Method Article

脂肪組織機能の探索

DOI:

10.3791/64957

March 3rd, 2023

In This Article

Abstract

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議論された記事:

Cho, D. S., Doles, J. D. マウス精巣上体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製.視覚化された実験のジャーナル。(162)、DOI:10.3791/61694(2020)。

Peics, J. et al. マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離。視覚化された実験のジャーナル。(162)、DOI:10.3791/61610(2020)。

Estrada-Gutierrez, G. et al. RNA分析およびマクロファージ表現型に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離。視覚化された実験のジャーナル。(164)、DOI:10.3791/61884(2020)。

Gilleron, J. et al. メチルサリチル酸の透明化と3Dイメージングによる脂肪組織構造の探索。視覚化された実験のジャーナル。(162)、土井:10.3791/61640(2020)。

Czepielewski, R. S. et al. 肥満時のリンパ管および血液ネットワーク分析.視覚化された実験のジャーナル。(165)、DOI:10.3791/61814(2020)。

Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F.タンパク質とマイクロRNAの調節が脂肪細胞の機能に及ぼす影響を研究するための脂肪細胞培養モデル。視覚化された実験のジャーナル。(171)、DOI:10.3791/61925(2021)。

Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. アカゲザルの脂肪由来幹細胞の単離、増殖および分化.視覚化された実験のジャーナル。(171)、DOI:10.3791/61732(2021)。

Batista Jr., M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. 悪液質誘発性白脂肪組織リモデリングを研究するためのモデルとしての三次元脂肪細胞培養.視覚化された実験のジャーナル。(167)、DOI:10.3791/61853(2021)。

Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. ろ過および超遠心分離を用いたヒト脂肪細胞由来細胞外小胞の単離および特性評価.視覚化された実験のジャーナル。(170)、DOI:10.3791/61979(2021)。

Discussion

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脂肪組織 (AT) 量の増加と AT 免疫細胞の炎症誘発性リモデリングを特徴とする肥満は、心血管疾患、2 型糖尿病、肝疾患の発症リスクを劇的に高めるため、世界的な主要な公衆衛生問題として浮上しています。したがって、AT の構造と機能を探求することは、重要な臨床的課題となっています。この方法コレクションでは、生理学的および病理学的条件下でATの構造と機能を調査するために開発されたいくつかの最先端の方法を紹介します。

AT は、成熟脂肪細胞、脂肪前駆細胞 (APC)、線維炎症前駆細胞 (FIP)、内皮細胞、免疫細胞などのいくつかの細胞集団で構成される不均一な組織です。したがって、この組織を特徴付けるために、単一細胞の表現型解析を行うことができます。ChoらとPeicsらは、蛍光活性化細胞選別(FACS)1,2によってマウスの白色AT常在APCを単離および特徴付けるためのプロトコルを提供しています。このステップは、AT増殖の能力を決定する重要な要素である常在APCの数を数えるだけでなく、単一細胞レベルでこれらの細胞の機能をさらに調査する上でも極めて重要です。Peics et al. また、AT 機能不全に関与することが知られている炎症誘発性表現型の発生に寄与する可能性のある非脂肪生成性コラーゲン産生細胞であるマウスの白色 AT 常在FIPs 2 を単離する方法も提供しています。同様に、Estrada-Gutierrezらは、ヒト内臓AT生検から生存可能な成熟脂肪細胞と間質血管画分細胞を同時に単離するプロトコルを記述しています3。全体として、これらのプロトコルは、ヒトおよびマウスのATから単一細胞懸濁液を生成するためのゴールドスタンダードであり、これは、さまざまなAT細胞亜集団をさらにカウントし、機能的に表現型化するための最初の重要なステップです。

構造と機能の関係は、ATで非常に関連性があります。肥満中の AT 機能不全の特徴は、脂肪細胞サイズの増加と AT の大幅なリモデリングに関連しています。このリモデリングは、脂肪細胞と免疫細胞集団だけでなく、リンパ管と血管ネットワークにも影響を与えます。AT 全体におけるこれらの変化を理解するために、Gilleron らは非常にシンプルで安価で高速な AT クリアリング プロトコルを開発しました4.この簡単なプロトコルは、マウス全体のATおよび大規模なヒトAT生検の形態を3次元的に視覚化します。これには、神経細胞および血管ネットワーク、脂肪細胞、および自然免疫細胞および適応免疫細胞の分布が含まれ、これらはすべて肥満およびそれに関連する病状を研究するための重要なパラメーターです。AT リンパ管および血管に対する肥満の影響を特徴付けるために、Czepielewski らは、蛍光色素結合レクチンを注射することにより、リンパ管樹枝形成と血管を同時に染色する in vivo 方法を提供します5。このプロトコルは、密度、体積、分岐など、両方のネットワークの in vivo 形態を分析する方法を提供します。興味深いことに、この標識戦略をATクリアリング手順4 と組み合わせることで、マウスAT全体の高解像度マッピングを3次元(3D)5で可能にすることができます。全体として、これらのアプローチは、生理学的および病態生理学的条件下での AT の構造を特徴付け、AT 構造と機能との相関関係についての洞察を得ることができます。

その高い不均一性と途方もないリモデリング能力により、in vivoでの AT内の脂肪細胞の機能の分析は簡単ではなく、いくつかの培養システムが開発されています。これらすべての細胞培養システムの主な利点は、細胞集団と微小環境を高レベルで制御できることです。Jagerらは、3T3-L1分化した成熟脂肪細胞におけるRNA発現を操作するための簡単なプロトコルを開発しています6。この培養システムは理想的な生理学的条件からはほど遠いですが、3T3-L1脂肪細胞は、インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、脂肪生成、および脂肪分解に関して機能を維持しています。したがって、このプロトコルは、タンパク質および非コードRNAの発現を操作し、脂肪細胞機能に対するそれらの役割を研究するための強力なツールを提供します。理想的な生理学的条件に近づくために、Poretらは、アカゲザルAT7から得られた脂肪由来幹細胞(ADSC)を使用して機能的な成熟脂肪細胞を生成する方法を説明しています。このプロトコルでは、初代ADSCを単離する方法と、それらの増殖と分化を誘導する方法について説明します。著者らはさらに、この手順が他の種にも適応できる可能性があると示唆している。この培養システムは、3T3-L1細胞株と比較して理想的な生理学的条件に近いですが、初代ADSCに由来する成熟脂肪細胞は、 in vivoとは異なり、2Dで増殖します。この問題に対処するために、Batista Jr.らは、3次元プリンティング組織培養システム8のための効率的なプロトコルを提供します。この研究では、著者らはマウス間質血管画分細胞からアディポスフェロイドを生成し、この3D培養システム内で脂肪細胞前駆体を直接分化します。このアプローチは、2D培養法よりも理想的な生理学的条件に取り返しのつかないほど近いですが、スフェロイドの中心にある脂肪細胞に栄養素をもたらす可能性のある血管の欠如を考慮する必要があります。これらの培養系内で説明されているように、タンパク質およびノンコーディングRNAの発現を調節することは、6、より生理学的に関連する脂肪細胞におけるこれらの標的の機能的役割に関するさらなる洞察につながる可能性があります。しかし、このような複雑なシステムは確立されていません。これらの ex vivo/in vitro 培養システムの主な関心は、細胞から分泌される因子も含む微小環境に対する高レベルの制御です。この点で、Akbarらによるプロトコルは、ヒト脂肪細胞によって分泌される細胞外小胞(EV)を単離し、特徴付けます9。最近、EV が重要な代謝調節因子であることが判明しました。この方法は、さまざまな代謝状況下でのこれらの脂肪細胞由来 EV の代謝への影響を分析するために必須です。

現在のメソッドコレクションでは、 ex vivo および in vitro 培養システム、3D全組織探索、単一細胞分析など、AT分析のいくつかの側面をカバーする最先端のプロトコルの概要を示します。完璧な培養システムは存在しませんが、生物学的問題に適応した培養システムを選択することが重要です。したがって、このメソッドコレクションは、 in vitroで脂肪細胞を単離、分化、および操作するための手順の大規模なツールボックスを提供します。ここで説明するさまざまな方法をすべて組み合わせることで、AT の形態と機能についての洞察が得られます。

Disclosures

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著者は開示するものは何もありません

Acknowledgements

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著者は、科学的な支援とインプットに対してJean-Francois TantiとMireille Cormontに感謝しています。この研究は、INSERM、コートダジュール大学、およびフランス国立研究機関(ANR)からの助成金により、Investments for the Future Labex SIGNALIFE(ANR-11-LABX-0028-01)、UCA JEDIプログラム(ANR-15-IDEX-01)、およびJ.G.(ANR18-CE14-0035-01-GILLERON)およびJ.J.(ANR-20-CE14-0010-01)のYoung Investigator Programを通じて支援されました。

References

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  1. Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. Journal of Visualized Experiments. (162), e61694(2020).
  2. Peics, J., et al. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (162), e61610(2020).
  3. Estrada-Gutierrez, G., et al. Isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for RNA analysis and macrophage phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (164), e61884(2020).
  4. Gilleron, J., et al. Exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3D imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
  5. Czepielewski, R. S., et al. Lymphatic and blood network analysis during obesity. Journal of Visualized Experiments. (165), e61814(2020).
  6. Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function. Journal of Visualized Experiments. (171), e61925(2021).
  7. Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61732(2021).
  8. Batista, M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Three-dimensional adipocyte culture as a model to study cachexia-induced white adipose tissue remodeling. Journal of Visualized Experiments. (167), e61853(2021).
  9. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).

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