人体の~40%を占める骨格筋は、運動から呼吸、代謝に至るまで重要な機能を支える主要な器官です。重要なのは、怪我後に自己修復する独自の能力を持ち、この再生能力により、1か月以内に深刻な損傷から完全に機能的および構造的に回復できることです。この驚くべき修復能力にはいくつかの細胞型が関与しており、筋幹細胞が中心的な役割を果たしています。
世界中の筋肉研究者は、骨格筋を機能的、分子的、細胞レベルで分析するためのいくつかのアッセイを開発しました。各技術には独自の強みがあり、動物モデルでの in vivo 試験は、人間と生物の複雑さに最も関連性のある選択肢を表しています。世界中の研究グループが、国際的に認められた置換-削減-改良(3R)原則を考慮して動物研究を最小限に抑えようと努めているため、 in vitro および ex vivo の対応物は普及しています。このメソッドコレクションは、種を超えた分子、細胞、および機能的筋肉研究のための in vivo および ex vivo モデルを提供することを目的としていました。
Montandon et al.1 は、対照遺伝子型と変異遺伝子型のゼブラフィッシュの筋肉再生表現型を迅速に特徴付ける技術について説明しています。まず、麻酔をかけた動物から振り落とされた材料を使用して胚の遺伝子型が決定されます。遺伝子組み換え胚のジェノタイピングを含むほとんどのプロトコルでは胚の同時犠牲が必要であるため、これはエキサイティングな見通しです。次に、ゼブラフィッシュ幼虫の筋肉組織の特定の領域を刺すことによって再生を誘導します。サルコメアの光学特性のおかげで、損傷後の画像を使用して損傷した筋肉の完全性を評価できます。このプロトコルは、再生欠陥のさまざまな変異体を調査するための迅速で潜在的にハイスループットの方法であるため、筋肉の再生を研究する科学者にとって非常に興味深いものです。
Hüttnerら2と Pegoliら3 は、筋肉再生の中核となる細胞集団である筋幹細胞の細胞的および分子的研究を可能にする方法を提示しています。この方法は、初期の活性化研究と細胞とニッチの相互作用に焦点を当てた研究者にとって非常に興味深いものです。単一筋線維培養の方法は、筋幹細胞がまだ筋線維と結合している間に最大96時間の筋幹細胞を培養および研究し、この近接した内因性ニッチから信号を受け取ることを可能にする。この技術は、Hüttnerら2が注意深く 説明する多くの繊細なステップ(例えば、穏やかな筋肉の解剖と解離)のために確立するのが特に困難です。さらに一歩進んで、著者らは、幹細胞の挙動に影響を与える可能性のある因子の機能解析のためのsiRNAターゲティングを詳述し、同じマウスと筋肉からのsiRNAトランスフェクト細胞と対照トランスフェクト細胞を比較することの重要性を強調しています。並行して、Pegoli et al.3 は、エメリー・ドレイファス筋ジストロフィーと出生後早期の生活の文脈で筋幹細胞を研究するためにこの方法をどのように調整できるかを説明し、この文脈における筋肉の脆弱性に関連する課題に焦点を当てています。プロトコルの効率を高めるために、生存率の良い繊維と悪い生存率を持つ繊維の画像で読者を導き、消化時間を「経験的に検証」する必要性を強調しています。
Zaidan et al.4 は、静止状態の予備細胞の産生を促進する骨格筋の ex vivo 培養システムについて説明しているが、他の多くの細胞型も維持しているが、どちらも代替培養システムの下で課題を提示している。したがって、この方法は、薬物、siRNA、またはベクターを使用して分子経路を修飾する条件下を含む、静止研究またはニッチと幹細胞の相互作用を志向する研究者にとって有用です。このプロトコルでは、後肢の筋肉を迅速に解剖し、その後酵素による消化と濾過を行います。その後、細胞を培養し、1週間以内に予備細胞が出現します。このプロトコルは、 Pax7nGFPなどの遺伝的にタグ付けされたマウスを使用した生細胞イメージングの可能性とともに、これらの予備細胞の大規模な増幅を可能にします。
Parkら5は、主要な硝酸塩貯蔵器官の1つである骨格筋で硝酸塩と亜硝酸塩をどのように測定できるかを示しています。 記載されている方法は、運動生理学および一酸化窒素サイクル関連の神経筋または代謝障害を研究する研究者にとって特に興味深いものです。硝酸塩と亜硝酸塩の測定を容易にするための重要な技術開発がありますが、最終結果に影響を与える可能性のあるいくつかのパラメーターがあり、著者によって慎重に説明および比較されています (均質化方法、生検サイズ、筋肉の種類など)。
Hesselら6は、機械実験に十分な長さの繊維を得るために、ヒト患者の前脛骨筋から生検を行う手順を非常に詳細に説明しています。著者らは、最近筋肉に損傷を受けた患者は除外されるべきであると強調しています。適格な患者のインフォームドコンセントが得られたら、超音波を使用して、生検収集に最適な筋肉の部位を評価します。理想的な注射経路について話し合った後、チームは専用の針を使用して生検を行います。最後に、術後の患者ケアと組織処理方法が詳しく説明されています。この方法は、筋線維の機械的研究のために患者からの組織採取を標準化したい医師科学者にとって特に興味深いものです。
このメソッドコレクションでは、Brightwell et al.7 と Corona et al.8 によって力学的研究が提示されています。これらの記事では、小型および大型の動物モデルで筋力を測定する方法について説明します。神経筋疾患または損傷は筋力に悪影響を及ぼします。したがって、運動、栄養、および治療的介入は、それを回復することを目的としています。Brightwell et al.7 は、ヒト患者に使用される方法と同様の方法でマウスの大腿四頭筋機能を評価する方法を詳述しています。まず、実験に必要な機器とソフトウェアを準備する手順を示します。次に、マウスを麻酔し、伸筋機能を評価するための位置に置きます。収縮を誘導するために大腿四頭筋の遠位部に電極を配置し、最適な電流を評価し、ピーク等尺性破傷風トルクの測定値を記録および分析します。Corona ら 8 は、より大きな動物モデルを使用して、ブタの後肢背屈筋の等尺性トルクを評価し、段階的な機器設定と筋力測定プロトコルを示しています。注目すべきは、最適な結果取得を保証するために、高品質の波面と低品質の波面を示すことです。彼らは、同じ動物の縦断的分析を可能にするこの非侵襲的技術の強みを認識していますが、重要なステップ(神経刺激、機械的アライメントなど)と方法の制限についても詳しく説明しています。
骨格筋研究の分野では、どの遺伝子が筋肉の再生に重要なのか、サテライト細胞がさまざまな生物の生涯にわたって再生能力をどのように維持しているのか、さまざまな病状で筋肉機能にどのような影響を与えるのかなど、まだ多くの未解決の疑問があります。このコレクションでは、幅広いモデルシステムを使用して、分子レベルと機械レベルで筋肉の機能と修復を調査するための多くの最新の技術を紹介しています。これらの論文の著者は、詳細なプロトコルを提供することで、基礎的および応用的な骨格筋研究の一貫性と透明性を高めるのにすでに役立っています。