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動物や植物を含む地球上のすべての多細胞生物は、~17億年前に単細胞真核生物から進化しました1。原始的な原核生物とは異なり、真核細胞は、膜に結合した核と、ミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体(ER)、リソソーム、小胞など、細胞質内に多くの膜で囲まれた細胞小器官を持っています。これらの細胞小器官は、特殊な生物学的機能と非常に効率的な代謝活動が局在するコンパートメントを形成します。光学顕微鏡の解像度が限られているため、ほとんどの細胞内細胞小器官には光回折限界に該当する機能的構造が含まれており、その視覚化が困難になります2。革新的な顕微鏡および生物学的標識技術により、超微細構造と細胞小器官の 生体内 ダイナミクスの高解像度の視覚化が可能になり始めています。このコレクションは、さまざまな種にわたるさまざまな細胞内細胞小器官の標識と画像化に成功した最近の方法をまとめたものであり、したがって、細胞小器官生物学の時空間調節の理解を深めました。
ここ数十年で、蛍光センサーの開発と生細胞内のタンパク質の標識により、細胞内ネットワーク、シグナル伝達、および細胞間相互作用のダイナミクスの理解が大幅に促進されました。高度な無機合成法を用いて、量子ドットや量子ドットとも呼ばれるナノスケールサイズの蛍光半導体ナノ結晶が、新しいクラスの光学レポーターとして発明されました。通常、量子ドット粒子のサイズは2〜10 nm以内であり、高い光感受性、安定性、および細胞に対する細胞毒性が低いです。量子ドット粒子は、細胞内プロセスを高解像度でイメージングするための有機色素や蛍光タンパク質の代替品として登場しました。Aishwaryaらによるプロトコルでは、著者らは、QDを介した免疫標識とそれに続く透過型電子顕微鏡(TEM)によるイメージングについて説明しています3。著者らは、抗体を標的とした量子ドット標識とTEM下で超解像でイメージングを行うことにより、成体マウス心臓細胞の複数の細胞小器官におけるSigmar1の局在を視覚化することに成功し、リソソームとミトコンドリア膜でのSigmar1の濃縮を強調しました。著者らは、QD-TEMの高分解能と高感度を強調することに加えて、この方法のいくつかの欠点についても言及しています。たとえば、量子子を介した免疫標識に使用される四酸化オスミウムは検体の特性を不可逆的に破壊し、固定と抗原のマスク解除ステップの最適化は、高品質の画像を確保するための重要でありながら困難な要素です。
QD以外にも、生細胞の細胞小器官を標識するために、他の多くの異なる色素がうまく適用されています。これらの方法は、 in vivoでの細胞小器官の形質転換または転座プロセスのライブイメージングを容易にしました。場合によっては、異なるタイプの細胞小器官を同時に視覚化するために、複数の細胞小器官特異的色素が使用されることがあります。Liu、Liら4によるプロトコルでは、著者らは、MitoTracker GreenとLysoTracker Redの2つの異なる色素を使用して、マウス胚性線維芽細胞(MEF)細胞におけるミトコンドリアとリソソームの両方のライブ染色とイメージングのための詳細なプロトコルを提供しています4。この研究では、両方の色素は、それぞれミトコンドリアとリソソームに特異的な高い蛍光感度と安定性を示しました。さらに、著者らは、プロトコルを使用して、MEF細胞におけるシアン化カルボニル-4(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)によって誘導されるマイトファジーの重要な in vivo 細胞プロセスを観察し、記録することに成功しました。議論の中で、著者らは、色素濃度と染色時間を最適化することにより、プロトコルをさまざまな細胞株または組織からの細胞に適用できることに言及しています。
蛍光タグに融合したオルガネラ特異的タンパク質で構成されるレポーターコンストラクトを利用することで、免疫標識なしでin vivo オルガネラのダイナミクスと発現パターンを観察できます。Liu、Zhuらによるプロトコル5では、著者らは、生きた出芽酵母である Saccharomyces cerevisiae5のほとんどの種類の細胞内細胞小器官をイメージングするための詳細なプロトコルを提供しています。出芽酵母を扱う初心者にとって、このプロトコルは、タンパク質の細胞内局在を特定し、タイムラプスイメージングを使用して目的の細胞小器官を追跡する方法を学ぶのに役立ちます。プロトコルの制限は、プロトコルで使用される構築物のほとんどが、他の種の細胞小器官の標識に使用できないことです。さまざまな種類の真核細胞については、蛍光タンパク質の細胞小器官特異的パターンを抗体免疫染色によって検証する必要があります。
抗体取り込みアッセイは、ショウジョウバエの感覚器官前駆体におけるエンドソームNotch/Deltaシグナル伝達の特異的な生標識のために最初に開発されました6。ノッチ/デルタシグナル伝達の線量感受性の性質により、レポーター融合遺伝子の余分なコピーが正常なシグナル伝達を中断し、ひいては細胞の運命を中断するため、細胞内でレポーターコンストラクトを発現することは、ノッチ/デルタシグナル伝達をin vivoで視覚化するのに適していません。ZhaoとGuoによるプロトコル7では、著者らは、発達中のゼブラフィッシュ脳7の放射状グリア前駆細胞におけるノッチ/デルタエンドソーム輸送をイメージングするための抗体取り込みアッセイを適用しています。プロトコルでは、抗DeltaD-Atto647N結合抗体を24 hpf(受精後数時間)の胚性後脳室に正確にマイクロインジェクションした後、エンドソーム輸送の全プロセスが、放射状グリア前駆細胞の有糸分裂全体を通して内在化された抗DeltaD-Atto647N抗体を使用して記録されます。この研究では、抗体取り込みアッセイが Notch/Delta シグナル伝達を妨げないことがわかりました。このプロトコルは、目的のタンパク質の細胞外ドメインに対する抗体が利用可能であれば、他の膜リガンド受容体シグナル伝達を視覚化するために使用することができる。
膨潤性ヒドロゲル内でサンプルを物理的に膨張させる膨張顕微鏡(ExM)の最近の開発により、従来の共焦点顕微鏡を超解像イメージングに使用できるようになりました。ExMは、その発明以来、多くの異なる種類の生物学的サンプルでテストされてきました8。ExMの主な課題の1つは、重合および消化ステップ中の蛍光シグナル損失です。最近開発されたラベル保持ExMは、三官能性アンカー9の問題を解決しました。Parkらによるプロトコル10では、著者らは、三官能性アンカー10のセットを使用してラベル保持ExM(LR-ExM)を実行する方法を説明しています。このプロトコルは、シグナル損失を防ぐだけでなく、SNAPまたはCLIPタグによる高効率の標識を促進することにより、拡張顕微鏡イメージングを改善します。彼らの研究では、著者らは、LR-ExMと超解像確率的光学再構成顕微鏡(STORM)を組み合わせることで、さまざまな細胞内構造に対する多色LR-ExMの実証に成功し、単一分子分解能を達成しました。
超解像顕微鏡の急速な発展と新しい蛍光標識技術の出現により、細胞内細胞小器官を前例のない解像度で視覚化するための方法とプロトコルのさらなる改善が期待できます。これらの取り組みは、細胞内細胞小器官のダイナミクスと機能の理解に新たな進歩をもたらす準備ができています。