方法論記事

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

2.9K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/64971

⸱

2023年6月2日

 ,  , 
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

この記事について

サマリー

代謝細胞外フラックス分析装置を用いてマウスおよびヒト好中球およびHL60細胞のミトコンドリア呼吸を測定する段階的プロトコルについて説明する。

要約

好中球は防御の最前線であり、ヒトで最も豊富な白血球です。これらのエフェクター細胞は、食作用や酸化バーストなどの機能を果たし、微生物クリアランスのための好中球細胞外トラップ(NET)を作成します。好中球の代謝活動に関する新しい洞察は、好中球が主に解糖に依存しているという初期の概念に挑戦します。代謝活性の正確な測定は、トリカルボン酸(TCA)サイクル(クレブス回路としても知られています)、酸化的リン酸化(OXPHOS)、ペントースリン酸経路(PPP)、および生理学的条件および疾患状態における脂肪酸酸化(FAO)を含む好中球のさまざまな代謝要件を明らかにすることができます。本論文では、代謝細胞外フラックス分析装置による代謝フラックス解析を用いて、マウス骨髄由来好中球、ヒト血液由来好中球、好中球様HL60細胞株のミトコンドリア呼吸の指標として酸素消費率(OCR)を測定するための段階的なプロトコルと前提条件について説明します。この方法は、正常および疾患条件下での好中球のミトコンドリア機能を定量するために使用できます。

概要

ミトコンドリアは、酸化的リン酸化(OXPHOS)によってアデノシン三リン酸(ATP)を生成する細胞の生体エネルギー学において主要な役割を果たしています。これに加えて、ミトコンドリアの役割は、活性酸素種の生成と解毒、細胞質およびミトコンドリアマトリックスカルシウム調節、細胞合成、異化、および細胞内の代謝産物の輸送にまで及びます1。ミトコンドリア呼吸は、その機能不全が心血管疾患3や加齢黄斑変性症4、パーキンソン病およびアルツハイマー病5、シャルコー・マリー・トゥース病2A(CMT2A)6などの多種多様な神経変性疾患を含む代謝障害2を引き起こす可能性があるため、すべての細胞に不可欠です。

好中球に関する電子顕微鏡的研究により、ミトコンドリアは比較的少なく7、ミトコンドリアの呼吸速度は非常に低いため、エネルギー産生を解糖に大きく依存していることが明らかになりました8。ただし、ミトコンドリアは、走化性9やアポトーシス10、11、12などの好中球機能にとって重要です。以前の研究では、膜電位の高いヒト好中球における複雑なミトコンドリアネットワークが明らかになりました。ミトコンドリア膜電位損失は、好中球アポトーシスの早期指標である10。ミトコンドリア脱共役カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)による処理は、ミトコンドリアの形態の変化とともに、走化性の有意な阻害を示しました9,10。

好中球の主要なエネルギー源は解糖系であるが、ミトコンドリアは、プリン作動性シグナル伝達の第1段階に燃料を供給することによって好中球活性化を開始するATPを提供し、これはCa2+シグナル伝達を高め、ミトコンドリアATP産生を増幅し、好中球機能応答を開始する13。ミトコンドリア呼吸鎖の機能不全は、有毒な活性酸素種(ROS)の過剰産生をもたらし、病原性損傷につながります14,15,16。好中球細胞外トラップ(NET)を形成するプロセスであるNETosisは、好中球の重要な特性であり、病原体と戦うのに役立ち17、癌、血栓症、自己免疫疾患などの多くの病理学的状態に寄与します18。ミトコンドリア由来のROSはNETosis19に寄与し、ミトコンドリアDNAはNETs18の構成要素となり得、そして変化したミトコンドリア恒常性はNETosis20,21,22,23,24を損なう。さらに、正常な分化または成熟の間に、好中球代謝リプログラミングは解糖活性を制限することによって逆転し、それらはミトコンドリア呼吸に従事し、細胞内脂質を動員します25,26。

代謝細胞外フラックス分析装置は、生細胞のミトコンドリア呼吸と解糖を継続的に監視および定量することができます。この分析装置は、96ウェルプレートフォーマットのセンサーカートリッジと2つの蛍光色素を使用して、酸素(O2)濃度とpH変化を定量します。センサーカートリッジは、アッセイ中に細胞単層の上にあり、~200 nmの高さのマイクロチャンバーを形成します。分析器内の光ファイバー束は、蛍光色素を励起し、蛍光強度の変化を検出するために使用されます。O2 濃度とpHのリアルタイム変化が自動的に計算され、酸素消費速度(OCR)と細胞外酸性化速度(ECAR)として表示されます。センサーカートリッジには4つのポートがあり、アッセイ測定中に各ウェルに最大4つの化合物をロードできます。このプロトコルは、代謝細胞外フラックスアナライザーを使用して、マウスおよびヒト好中球、ならびに好中球様HL60細胞のミトコンドリア呼吸を定量化することに焦点を当てています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

ヘパリン処理全血サンプルは、ヘルシンキ宣言に従ってUConn Healthの治験審査委員会によって承認されたように、インフォームドコンセントを取得した後、健康なヒトドナーから取得されました。すべての動物実験は、UConn Health施設動物管理および使用委員会(IACUC)のガイドラインに従い、げっ歯類の使用の承認は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに概説されている基準に従って、UConn Health IACUCから取得されました。この研究では、6週齢の雄C57BL / 6マウスを使用しました。

1. 代謝細胞外フラックスアッセイ用の96ウェルプレートの調製

  1. センサーカートリッジは、代謝細胞外フラックスアッセイ用に特別に設計された96ウェルプレートの上にパッケージされています。カートリッジを慎重に持ち上げて水和し、200 μL/ウェルの校正培地を下になるプレートの各ウェルに入れます。キャリブラント付きのプレート上にカートリッジを置き、非CO2、加湿、37°Cインキュベーター内で一晩水和する。
  2. 細胞の種類に応じて、培養プレートに特定のコーティングを使用して細胞の接着を確保します。ヒト好中球-未分化および分化したHL60細胞の場合、5 μLの5 μg/mL精製マウス抗ヒトCD18抗体(クローンTS1/18)50 μLを含む滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で96ウェルプレートを4°Cで一晩コーティングします。マウス好中球の場合は、96 ウェルプレートに25 μLの22.4 μg/mL Cell TakをpH 8.0、0.1 M NaHCO3 中、室温(RT)で20分間コーティングします。
  3. プレートを200 μLの滅菌PBSで2回洗浄します。
  4. 播種中に細胞培養プレート内のバックグラウンド補正のために、細胞培養プレート(細胞なし)のコーナーウェル(A1、A12、H1、およびH12)に完全な培地を追加します。
    注意: コーティングおよびキャリブレーション中の蒸発は、キャリブレーションメディアの量と正規化に影響を与える可能性があります。滅菌水濡れティッシュの入ったトレイまたはチャンバーを使用し、蒸発を防ぐためにその上にキャリブラントを付けたプレートを置きます。

2.細胞の調製と播種

  1. アッセイ培地の調製
    1. 1 mM ピルビン酸、10 mM グルコース、および 2 mM グルタミンをダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) に添加してアッセイ培地を調製します。
  2. 骨髄からのマウス好中球の単離
    1. 製造元の指示に従って、マウス好中球濃縮キットを使用して骨髄からマウス好中球を分離します。
    2. ケタミン(125 mg / kg)とキシラジン(12.5 mg / kg)の腹腔内(i.p.)注射によってマウスに麻酔をかけ、次に頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。
    3. 前述のように、大腿骨と脛骨を収穫します27。簡単に言うと、筋肉で脚を露出させるために皮膚をカットします。股関節を切断して、脚を体から取り外します。次に、筋肉を取り除き、大腿骨と脛骨を収集します。
    4. 大腿骨と脛骨の小さい方の端を切ります。切断端を下にして、底部に2つの25 Gシリンジニードルパンチ穴がある0.5 mL遠沈管に入れ、0.5 mLチューブを1.5 mL遠沈管に入れます(図1A)。骨髄細胞の乾燥を防ぐために、50 μLのPBSを0.5 mLチューブに加えます。
    5. RTで5,900 × g で15秒間遠心分離し、1.5 mLチューブの底で骨髄を採取します。骨髄細胞を1 mLのDMEMで再懸濁します。キットからラット血清50 μLを加え、ピペッティングで穏やかに混合し、細胞懸濁液を5 mLポリスチレン培養試験管に移します。
    6. マウス好中球濃縮キットから50 μLの濃縮カクテルを加え、RTで15分間インキュベートします。 RTで300 × g で5分間遠心分離します。
    7. 細胞を1 mLのDMEMで再懸濁し、キットから50 μLのビオチン選択カクテルを加え、ピペッティングで穏やかに混合し、RTで15分間インキュベートします。
    8. キットから150 μLのボルテックス磁性粒子を添加し、ピペッティングで穏やかに混合し、RTで10分間インキュベートします。
    9. DMEMを~1.3 mL加え、ピペッティングで穏やかに混合し、チューブを磁石に3分間入れ、精製マウス好中球を含む上清を、元のチューブを磁石と一緒に反転させて、新しい5 mLポリスチレン培養試験管に移します。
    10. RTで300 × g で5分間遠心分離します。真空吸引により上清を除去した後、細胞を1 mLのアッセイ培地で再懸濁する。
    11. 血球計算盤を使用して手動で細胞をカウントします。
    12. 調製した96ウェルプレートにアッセイ培地、マウス好中球懸濁液(2 × 10 5細胞)の播種180 μLを加えて細胞密度を1.1 ×10 6 cells/mLに調整し(ステップ1.2-1.4)、プレートを300 × gでRTで3分間、ブレーキをかけずに遠心分離して、プレート底部の細胞が適切に接着するようにします。
    13. プレートを非CO2中でインキュベートし、加湿し、37°Cインキュベーター中で1時間、アッセイ培地で細胞を予備平衡化した。
      注:好中球の純度は、潜在的なバイアスであるため、アッセイにとって重要です。マウス好中球単離の純度は、このプロトコルによって69.9%〜88.7%である。マウス骨髄から好中球を単離するための他の方法、例えば密度勾配遠心分離28がある。好中球に発現しない抗原に対するモノクローナル抗体を使用した負の磁気選択に基づく、他のベンダーからの代替好中球分離キットもあります。
  3. 末梢血からのヒト好中球の単離
    1. 8 mLの多糖類溶液を15 mLの遠沈管に加え、混合せずに多糖類溶液の上に4 mLの末梢血を重ねます。
    2. 550 × g 、20°Cで30分間遠心分離します。ローターを1で減速させます。
      注:好中球分離時間はドナーによって異なる場合があります。それは最低30分であり、好中球分離が失敗した場合はさらに10〜20分かかる場合があります。
    3. 図1Bに示すように、遠心分離後の血漿/血小板および単核球の分離を観察します。1 mLピペットを使用して、下部の曇ったバンド(好中球)を乱さずに、上部の上部の黄色の液体(血漿および血小板)と上部の曇ったバンド(単核球)を慎重に取り除きます。
    4. 下の白濁バンドと~3-4 mLの透明な液体を、10 mLのPBSを含む新しい15 mLの遠沈管に集めます。
    5. 400 × g 、20°Cで10分間遠心分離し、真空吸引により上清を除去します。
    6. 細胞を5 mLのPBSで再懸濁し、300 × g 、20°Cで5分間遠心分離します。
    7. 上清を除去した後、細胞を1 mLのアッセイ培地で再懸濁します。
    8. 血球計算盤を使用して手動で細胞をカウントします。
      注:血液中の赤血球にはミトコンドリアがないため、赤血球汚染はミトコンドリアストレステストアッセイに影響を与えず、好中球の活性化/プライミングを防ぎます29,30。赤血球は、正確な好中球濃度を得るために、細胞計数中に溶解する必要があります。10 μLの細胞懸濁液を891 μLの脱イオン水に10〜30秒間加えて赤血球を溶解し、次に99 μLの10x PBSを加えて浸透圧のバランスを取り、好中球の溶解を回避します。
    9. アッセイ培地を添加して細胞密度を2.2 ×10 6 cells/mLに調整し、調製した96ウェルプレートに1ウェルあたり180 μLのヒト好中球(~4 ×10 5)を播種し、プレートを300 × g でRTで3分間、ブレーキをかけずに遠心分離して、プレート底部の細胞が適切に接着するようにします。
    10. プレートを非-CO2中でインキュベートし、加湿し、37°Cインキュベーター中で1時間、アッセイ培地で細胞を予備平衡化した。
      注:好中球の純度は、潜在的なバイアスであるため、アッセイにとって重要です。ヒト好中球単離の純度は86.6%〜96.8%である。ヒト血液から好中球を単離するための密度勾配遠心分離法には、パーコール単離やフィコール単離とデキストラン沈降の組み合わせなどがあります31。
  4. HL60細胞培養と好中球指向性分化
    1. HL60細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)、100 μg/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、および250 ng/mLアムホテリシンBを含むロズウェルパーク記念研究所(RPMI)-1640培地で37°Cおよび5%CO2で維持します。
    2. 好中球指向性分化のために、HL60細胞(浮遊細胞)をT25フラスコ中で1 ×10

figure-protocol-1







figure-protocol-2


アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

マウス好中球(図3A)、ヒト好中球(図3B)、および未分化および分化したHL60細胞(図3C)の混合物であるオリゴマイシン、FCCP、およびロテノン/抗マイシンA混合物に応答するミトコンドリア呼吸の変化を示す代表的なOCRダイナミクスが示されています。すべての細胞において、オリゴマイシン処理は、ATPシンターゼのプロトンチャネルを阻害することによってOCR値を減少させる。FCCP治療は、電子の流れと酸素消費量を増やして膜電位を維持し、最大の呼吸を達成することにより、OCR値を回復させます。ロテノン/抗マイシンA混合処理は、電子伝達鎖の複合体IおよびIIIをブロックすることにより、ミトコンドリア呼吸を排除します。

好中球指向性分化後、HL60細胞はミトコンドリア呼吸の低下を示すことを観察しました(図3C)。上記の異なる呼吸パラメータを定量した後、分...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

代謝細胞外フラックス分析装置を使用して好中球のミトコンドリア呼吸を測定する標準的な手順は、細胞数、細胞増殖、生存率などの多くの要因によって制限されます。各化合物濃度は、このアッセイにおける細胞の種類と供給源によって異なります。オリゴマイシンとロテノン/抗マイシンAは、ほとんどの細胞タイプの中で主に同様の濃度で使用されます。ただし、FCCPによって誘発される最大呼吸数は細胞によって異なるため、濃度を最適化するにはFCCPの慎重な滴定が必要です42。また、最適化中にFCCPの順次追加を実行することをお勧めします。代謝細胞外フラックス分析装置は、空気圧43下でプレート内に薬物を注入するが、いくつかのミトコンドリア複合体阻害剤に対する細胞膜の不透過性は、単離されたミトコンドリア44と比較して、無傷の細胞の場合のそれらの使用を制限する。ポートへの積み込みは、相互汚染を避けるために慎重に実行する必要があります。培地中の基質濃度(グルコース、ピルビン酸、グルタミンなど)もミトコンドリア活性に影響を与える可能性...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

UConn Healthの免疫学部のAnthony T. Vella博士とFederica Aglianoin博士の代謝細胞外フラックス分析装置の使用に関するトレーニング、およびUConn Healthの免疫学部のLynn Puddington博士の機器のサポートに感謝します。UConn医学部のジュネーブ・ハーギス博士が、この原稿の科学的執筆と編集に協力してくれたことに感謝します。この研究は、国立衛生研究所、国立心臓肺血液研究所(R01HL145454)、国立総合医学研究所(R35GM147713およびP20GM139763)、UConn Healthのスタートアップファンド、および米国免疫学会のキャリア再エントリーフェローシップからの助成金によってサポートされました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
37度;C非CO<サブ>2 インキュベーターPrecisionEconomy Model 2EG
Instrument BiorenderSoftware Application
CentrifugeEppendorfModel 5810RInstrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue AdhesiveCorning102416-100試薬
EasySep MagnetSTEMCELL18000Magnet
EasySepMouse 好中球濃縮キットSTEMCELL19762A試薬
Graphpad Prism 9ソフトウェア アプリケーション
ヒト血清アルブミン溶液 (25%)GeminiBio800-120試薬
ケタミン (VetaKet)DAILYMEDNDC 59399-114-10麻酔薬
PBSCytivaSH30256.01試薬
プレートバケツ エッペンドルフUL155アクセサリー
PolymorphPrepPROGEN1895 (旧1114683)多糖類溶液
精製マウス抗ヒト CD18 抗体Biolegend302102クローン TS1/18
RPMI 1640 ミディアムGibco11-875-093試薬
タツノオトシゴ 代謝細胞外フラックス分析装置AgilentXFe96機器
タツノオトシゴ XF セル 水戸ストレステストキットAgilent103015-100ミトコンドリアストレステストキット
スイングバケットローターエッペンドルフA-4-62ローター
バキュームトラップ 2 バキュームトラップフォックスライフサイエンス3052101-FLSInstrument
WaveSoftware Application
XF 1.0 M グルコース溶液Agilent103577-100試薬
XF 100 mM ピルビン酸溶液Agilent103578-100試薬
XF 200 mM グルタミン溶液Agilent103579-100試薬
XF DMEM 中Agilent103575-100試薬
XFe96 FluxPakAgilent102601-100材料
Xylazine(AnaSedの注入)DAILYMEDNDC 59399-110-20麻酔薬
型

参考文献

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136(2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858(2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472(2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521(2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121(2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444(2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586(2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487(2021).
  30. Zhang, Z. -W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907(2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850(2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465(2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656(2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845(2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975(2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079(2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019).
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899(2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech. , Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020).
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608(2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856(2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099(2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306(2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

HL60

関連記事