好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

サマリー

代謝細胞外フラックス分析装置を用いてマウスおよびヒト好中球およびHL60細胞のミトコンドリア呼吸を測定する段階的プロトコルについて説明する。

要約

好中球は防御の最前線であり、ヒトで最も豊富な白血球です。これらのエフェクター細胞は、食作用や酸化バーストなどの機能を果たし、微生物クリアランスのための好中球細胞外トラップ(NET)を作成します。好中球の代謝活動に関する新しい洞察は、好中球が主に解糖に依存しているという初期の概念に挑戦します。代謝活性の正確な測定は、トリカルボン酸(TCA)サイクル(クレブス回路としても知られています)、酸化的リン酸化(OXPHOS)、ペントースリン酸経路(PPP)、および生理学的条件および疾患状態における脂肪酸酸化(FAO)を含む好中球のさまざまな代謝要件を明らかにすることができます。本論文では、代謝細胞外フラックス分析装置による代謝フラックス解析を用いて、マウス骨髄由来好中球、ヒト血液由来好中球、好中球様HL60細胞株のミトコンドリア呼吸の指標として酸素消費率(OCR)を測定するための段階的なプロトコルと前提条件について説明します。この方法は、正常および疾患条件下での好中球のミトコンドリア機能を定量するために使用できます。

概要

ミトコンドリアは、酸化的リン酸化(OXPHOS)によってアデノシン三リン酸(ATP)を生成する細胞の生体エネルギー学において主要な役割を果たしています。これに加えて、ミトコンドリアの役割は、活性酸素種の生成と解毒、細胞質およびミトコンドリアマトリックスカルシウム調節、細胞合成、異化、および細胞内の代謝産物の輸送にまで及びます¹。ミトコンドリア呼吸は、その機能不全が心血管疾患³や加齢黄斑変性症⁴、パーキンソン病およびアルツハイマー病⁵、シャルコー・マリー・トゥース病2A(CMT2A)⁶などの多種多様な神経変性疾患を含む代謝障害2を引き起こす可能性があるため、すべての細胞に不可欠です。

好中球に関する電子顕微鏡的研究により、ミトコンドリア^は比較的少なく7、ミトコンドリアの呼吸速度は非常に低いため、エネルギー産生を解糖に大きく依存していることが明らかになりました⁸。ただし、ミトコンドリアは、走化性⁹やアポトーシス¹⁰

プロトコル

ヘパリン処理全血サンプルは、ヘルシンキ宣言に従ってUConn Healthの治験審査委員会によって承認されたように、インフォームドコンセントを取得した後、健康なヒトドナーから取得されました。すべての動物実験は、UConn Health施設動物管理および使用委員会(IACUC)のガイドラインに従い、げっ歯類の使用の承認は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに概説されている基準に従って、UConn Health IACUCから取得されました。この研究では、6週齢の雄C57BL / 6マウスを使用しました。

1. 代謝細胞外フラックスアッセイ用の96ウェルプレートの調製

1. センサーカートリッジは、代謝細胞外フラックスアッセイ用に特別に設計された96ウェルプレートの上にパッケージされています。カートリッジを慎重に持ち上げて水和し、200 μL/ウェルの校正培地を下になるプレートの各ウェルに入れます。キャリブラント付きのプレート上にカートリッジを置き、非_CO2、加湿、37°Cインキュベーター内で一晩水和する。
2. 細胞の種類に応じて、培養プレートに特定のコーティングを使用して細胞の接着を確保します。ヒト好中球-未分化および分化したHL60細胞の場合、5 μLの5 μg/mL精製マウス抗ヒトCD18抗体(クローンTS1/18)50 μLを含む滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で96ウ....

結果

マウス好中球(図3A)、ヒト好中球(図3B)、および未分化および分化したHL60細胞(図3C)の混合物であるオリゴマイシン、FCCP、およびロテノン/抗マイシンA混合物に応答するミトコンドリア呼吸の変化を示す代表的なOCRダイナミクスが示されています。すべての細胞において、オリゴマイシン処理は、ATPシンターゼのプロトンチャネルを阻害することによってOCR値を減少させる。FCCP治療は、電子の流れと酸素消費量を増やして膜電位を維持し、最大の呼吸を達成することにより、OCR値を回復させます。ロテノン/抗マイシンA混合処理は、電子伝達鎖の複合体IおよびIIIをブロックすることにより、ミトコンドリア呼吸を排除します。

好中球指向性分化後、HL60細胞はミトコンドリア呼吸の低下を示すことを観察しました(図3C)。上記の異なる呼吸パラメータを定量した後、分.......

ディスカッション

代謝細胞外フラックス分析装置を使用して好中球のミトコンドリア呼吸を測定する標準的な手順は、細胞数、細胞増殖、生存率などの多くの要因によって制限されます。各化合物濃度は、このアッセイにおける細胞の種類と供給源によって異なります。オリゴマイシンとロテノン/抗マイシンAは、ほとんどの細胞タイプの中で主に同様の濃度で使用されます。ただし、FCCPによって誘発される最大呼吸数は細胞によって異なるため、濃度を最適化するにはFCCPの慎重な滴定が必要です⁴²。また、最適化中にFCCPの順次追加を実行することをお勧めします。代謝細胞外フラックス分析装置は、空気圧⁴³下でプレート内に薬物を注入するが、いくつかのミトコンドリア複合体阻害剤に対する細胞膜の不透過性は、単離されたミトコンドリア⁴⁴と比較して、無傷の細胞の場合のそれらの使用を制限する。ポートへの積み込みは、相互汚染を避けるために慎重に実行する必要があります。培地中の基質濃度(グルコース、ピルビン酸、グルタミンなど)もミトコンドリア活性に影響を与える可能性.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
37度;C非CO<サブ>2 インキュベーター	Precision	Economy Model 2EG
Instrument Biorender			Software Application
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R	Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	102416-100	試薬
EasySep Magnet	STEMCELL	18000	Magnet
EasySepMouse 好中球濃縮キット	STEMCELL	19762A	試薬
Graphpad Prism 9			ソフトウェア アプリケーション
ヒト血清アルブミン溶液 (25%)	GeminiBio	800-120	試薬
ケタミン (VetaKet)	DAILYMED	NDC 59399-114-10	麻酔薬
PBS	Cytiva	SH30256.01	試薬
プレートバケツ エ	ッペンドルフ	UL155	アクセサリー
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (旧1114683)	多糖類溶液
精製マウス抗ヒト CD18 抗体	Biolegend	302102	クローン TS1/18
RPMI 1640 ミディアム	Gibco	11-875-093	試薬
タツノオトシゴ 代謝細胞外フラックス分析装置	Agilent	XFe96	機器
タツノオトシゴ XF セル 水戸ストレステストキット	Agilent	103015-100	ミトコンドリアストレステストキット
スイングバケットローター	エッペンドルフ	A-4-62	ローター
バキュームトラップ 2 バキュームトラップ	フォックスライフサイエンス	3052101-FLS	Instrument
Wave			Software Application
XF 1.0 M グルコース溶液	Agilent	103577-100	試薬
XF 100 mM ピルビン酸溶液	Agilent	103578-100	試薬
XF 200 mM グルタミン溶液	Agilent	103579-100	試薬
XF DMEM 中	Agilent	103575-100	試薬
XFe96 FluxPak	Agilent	102601-100	材料
Xylazine(AnaSedの注入)	DAILYMED	NDC 59399-110-20	麻酔薬

型