方法論記事

zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュヒト遺伝病モデリングのための効率的なPAMレスベース編集

DOI：

10.3791/64977

⸱

2023年2月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Brain, Cognition and Education Science, Ministry of Education, 2Institute for Brain Research and Rehabilitation, Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University, 3Institute of Modern Aquaculture Science and Engineering, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center for Environmentally Friendly Aquaculture, Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture, School of Life Sciences, South China Normal University, 4Department of Pathology, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、zSpRY-ABE8eを使用して正確なゼブラフィッシュ病モデルを構築するために、PAMの制限なしに効率的なアデニン塩基編集を実行する方法について説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR/Cas9技術は、ヒト遺伝病のモデル化、疾患病因の研究、および薬物スクリーニングのためのゼブラフィッシュの価値を高めましたが、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の制限は、一塩基変異体(SNV)によって引き起こされるヒト遺伝性疾患の正確な動物モデルを作成する上で大きな障害となっています。これまで、幅広いPAM互換性を持ついくつかのSpCas9バリアントは、ゼブラフィッシュで効率を示してきました。最適化されたSpRY媒介アデニン塩基エディター(ABE)、zSpRY-ABE8e、および合成修飾gRNAをゼブラフィッシュに適用することで、PAMの制限なしに効率的なアデニン-グアニン塩基変換が可能になりました。ここで説明するのは、zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュにおけるPAM制限のない効率的なアデニン塩基編集のためのプロトコルである。zSpRY-ABE8e mRNAと合成修飾gRNAの混合物をゼブラフィッシュ胚に注入することにより、TSR2リボソーム成熟因子(tsr2)の病原部位を模擬した正確な変異を有するゼブラフィッシュ病モデルを構築した。この方法は、疾患メカニズムと治療法を研究するための正確な疾患モデルを確立するための貴重なツールを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミスセンス変異またはナンセンス変異を引き起こす一塩基変異体(SNV)は、ヒトゲノム1における最も一般的な変異源です。特定のSNVが病原性であるかどうかを判断し、その病因を明らかにするためには、正確な動物モデルが必要です2。ゼブラフィッシュは、ヒトとの高度な生理学的および遺伝的相同性、短い発生サイクル、および強力な繁殖能力を示す優れたヒト疾患モデルであり、病原性の特徴とメカニズムの研究、および薬物スクリーニングに有利です3。

クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)/Cas9システムは、ゼブラフィッシュ4を含むさまざまな種のゲノム編集に広く適用されています。gRNAガイダンスにより、CRISPR/Cas9システムは標的部位でDNA二本鎖切断(DSB)を生成することができ、相同性指向性修復(HDR)経路を介して標的部位とドナーDNAテンプレートとの組換えによる一塩基置換が可能になります。しかし、細胞DNA修復プロセスは主に非相同末端結合(NHEJ)経路によって行われ、通常は挿入および欠失(インデル)変異を伴うため、この塩基置換法の効率は非常に低いです5。幸いなことに、CRISPR/Cas9ベースのシングルベース編集技術は、DSBを誘導することなくより効率的なシングルベース編集を可能にするベースエディタを使用することで、この問題を大幅に軽減します。Two major classes of base editors, adenine base editors (ABEs) and cytosine base editors (CBEs), have been developed to implement base substitution editing for A·T から G·C および C·G から T ·A、それぞれ6、7、8、9、10、11。これらの4種類の塩基置換は、ヒト病原性多様体の30%をカバーしています12。PmCDA1、BEシステム、CBE4max、ABE7.10、ABE8eを含む両方のクラスのベースエディタは、ゼブラフィッシュで動作することが報告されており、特にBE4maxとABE8eは高い編集活動を達成することが報告されています13,14,15,16,17,18,19。

黄色ブドウ球菌、化膿レンサ球菌、およびS.canisを含む異なる種のCas9タンパク質は、ゼブラフィッシュ遺伝子編集に実装されており、化膿レンサ球菌Cas9(SpCas9)が最も広く使用されています20,21,22,23。 しかしながら、SpCas9は、NGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を有する標的部位しか認識できず、これはその編集可能な範囲を制限し、その結果、目的の病原性部位の近くに適切な配列が見出されない可能性がある24。ターゲット範囲を拡大するために、さまざまなSpCas9バリアントが、指向性進化と構造ガイド付き設計を通じてさまざまなPAMを認識するように設計されています。しかし、動物、特にゼブラフィッシュに有効な変異体はほとんどなく、SNV関連疾患研究におけるゼブラフィッシュの適用を制限しています25,26,27,28。最近、SpCas9の2つのバリアント、SpGおよびSpRYは、PAM制限がそれほど厳しくない(SpGのNGNおよびSpRYのNNNはNYNよりもNRNの選好が高い)が、ヒトの細胞および植物において高い編集活性を示すことが報告されている29,30,31,32。その後、SpGとSpRY、およびSpRYを介したCBEやSpRYを介したABEなどの多くの媒介ベースエディターもゼブラフィッシュで機能することが報告されており、SNV関連疾患の機構研究と薬物スクリーニングにおけるゼブラフィッシュモデルの適用を強化します18,33,34,35.さらに、i-Silenceは、ABEを介したATGからGTGまたはACG36への開始コドン変換による効果的で正確な遺伝子ノックアウト戦略として提案されました。i-Silence戦略とSpRYを介したベースエディターzSpRY-ABE8eの組み合わせは、疾患モデリングのための新しい方法を提供します18。このプロトコルは、ゼブラフィッシュでzSpRY-ABE8eを使用して遺伝子編集を実行し、i-Silence戦略を使用してtsr2(M1V)モデルを構築する方法を示しています。ゼブラフィッシュモデルに現れる編集効率と表現型を評価および分析しました。

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プロトコル

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この研究は、華南師範大学のケアアンドユース委員会のガイドラインに厳密に準拠して実施されました。

1. 合成修飾gRNAおよびzSpRY-ABE8e mRNAの調製

  1. 以前の文献37、38に従ってgRNAを設計する。
    1. zSpRY-ABE8eはNYN PAMよりもNRN PAMの選好が高いため、PAM配列としてNRNを優先的に選択します(RはAまたはG、YはCまたはT)18。ターゲットのアデニンヌクレオチドが高活性編集ウィンドウ(プロトスペーサーに沿った3番目から9番目のヌクレオチド)にあることを確認します。
  2. 両端に2'-O-メチル-3′-ホスホロチオエート(MS)で修飾したイージーエディットsgRNA(EE gRNA)を注文してください(図1)。
    注:EE gRNAはRNaseフリーの水に溶解し、-80°Cで保存する必要があります。
  3. zSpRY-ABE8eプラスミド18を線形化します。
    1. プラスミド6 μgを XbaI 酵素(材料表)で37°Cの金属浴中で3時間直線化します。
    2. DNA精製キット( 材料表を参照)を使用して、製造元の指示に従って直鎖状化プラスミドを精製します。
  4. in vitro転写キット(材料表)を用いてmRNAを転写します。
    1. zSpRY-ABE8e mRNAを、直鎖状化プラスミドを鋳型として、製造元の指示に従って転写します。
      注:mRNAおよびgRNAを含むすべての操作では、RNaseフリーの実験用品を使用する必要があります。
  5. RNA精製キット(材料表)を使用して、製造元の指示に従ってmRNAを精製します。
    注:溶出する前に、細胞毒性を避けるためにエタノールを乾燥させ、すぐに使用しない場合はmRNAを-80°Cで保存する必要があります。

2.マイクロインジェクションガラスキャピラリーの準備

  1. マイクロピペットプーラーシステムをセットアップし、少なくとも30分間予熱します。
  2. ランプテストを実行して、製造元の指示に従って、ホウケイ酸ガラスキャピラリー(外径1 mm、内径0.58 mm)を溶かすのに必要な熱値を決定します。
  3. プログラムを選択し、キーボードの数字をクリックしてパラメータ値を入力します。ガラスキャピラリーを引っ張るには、熱=ランプテスト値、引っ張り= 50、速度= 100、時間= 50、圧力= 30のパラメータを設定します。
  4. キャピラリーチューブを取り付け、溝にあることを確認します。 プルスタート/ストップ を押してプログラムを実行します。
  5. 引っ張られた毛細血管を隙間のあるフォームに挿入し、針を吊り下げたまま保存します。

3. ゼブラフィッシュ胚へのzSpRY-ABE8e mRNAおよびEE gRNA混合物のマイクロインジェクション

  1. 注射の前夜に繁殖タンクを設置します。仕切りを挿入し、各タンクに2匹のメスと1匹のオスのAB系統ゼブラフィッシュ(3〜18ヶ月)を入れ、蓋をします。性別の区別については、以前の出版物を参照してください39。
    注:より多くの胚を取得するには、少なくとも1週間繁殖していない魚を選択してください。
  2. 注射の翌朝、zSpRY-ABE8e mRNAとEE gRNAを氷上で解凍します。mRNAとgRNAをそれぞれ400 ng/μLと200 ng/μLの最終濃度に混合します。
    1. RNaseフリーのチップとチューブを使用して氷上で手順全体を実行し、手袋で取り扱います。
  3. 空気圧マイクロインジェクターを構成します。エアポンプの分圧バルブを閉じて、最初にメインバルブを開き、ガスボンベのネジを外し、分圧バルブの圧力を0.2MPa / 29psiに調整します。
    1. 空気圧マイクロインジェクターの電源を入れ、モードをTIMERに設定し、初期パラメータ圧力値を20.0psiに、TIMER値を0.040秒に調整します。
  4. 細かい鉗子を使用して、実体顕微鏡下で引っ張られたガラス毛細血管の針を注意深く壊し、絨毛膜と卵子の穴開けを容易にするために針が斜めに切断されていることを確認します。
    注意: 針のブレークポイントは適切な場所にあり、卵を突き刺すのに十分な強度がありながら、卵への損傷を最小限に抑えるのに十分な厚さである必要があります。
  5. マイクロローダーピペットチップを使用して、zSpRY-ABE8e mRNAとgRNAの混合物をガラスキャピラリーの先端に加え、キャピラリー内の気泡を避けます。ニードルをマイクロマニピュレーターに取り付け、インジェクターの圧力とTIMER値を設定して、マイクロキャップを使用して注入ごとに2nLの混合物が生成されるようにします。
  6. 繁殖タンクの仕切りのプラグを抜き、魚を10〜15分間繁殖させます。ストレーナーを使用して卵を採取し、実体顕微鏡で卵の細胞病期と品質を調べます。単細胞状態の卵を注入対象として選択し、編集効率を向上させます。
  7. 卵を1.5%アガロース注射プレートに並べ、顕微鏡下で胚の卵黄ではなく細胞に2 nLの混合物を注入して、編集効率を向上させます。対照群として少なくとも15個の卵を保持します。
  8. 1x E3バッファーを使用してペトリ皿に卵を集め、28°Cのインキュベーターに入れます。 死んだ卵を取り除き、受精後12時間(hpf)まで48時間ごとに培養バッファーを交換します。

4. EditRによるベース編集の効率分析

  1. 48 hpfで、ランダムに選択された6つの注入胚と6つのランダムに選択されたコントロール胚の3つのプールをそれぞれPCRチューブに収集します。ピペットを使用して、残留E3バッファーを吸引します。
  2. 40 μLの50 mM NaOHをPCRチューブに加えます。チューブを95°Cの金属浴に20分間入れ、次に15秒間ボルテックスします。
  3. 4 μLの1 Mトリス·HCl(pH 8.0)を各チューブに挿入し、NaOHを中和した。室温で2,000 x g で10秒間短時間遠心分離し、チューブ壁から液滴を除去します。上清を新しいPCRチューブに回収し、-20°Cで保存します。
  4. gRNA標的部位の上流および下流に適切なプライマーを設計します。上記の上清1 μLを、50 μL容量のPCR反応の鋳型として使用します。本試験でPCRに用いたプライマーを 別表1に示します。
  5. DNAアガロースゲル電気泳動を実行して、正確で特異的なバンドを確認し、続いて前述のようにサンガーシーケンシングを行います40。
  6. サンガーシーケンシングデータをEditR(1.0.10)プログラム41で解析します。
    1. シーケンス ファイル (ab1 形式) を [.ab1 ファイルをアップロード] ボックスにアップロードします。
    2. 20 bp gRNA配列を5'-3′方向で「gRNA配列を入力」ボックスに入力します。
    3. シーケンシングファイル(ab1形式)を開き、20 bp gRNA配列が開始および終了する塩基位置を確認します。「5'開始」ボックスと「3'終了」ボックスに対応するベース位置を入力します。
    4. [予測編集]をクリックして、基本的な 編集 効率を取得します。gRNAターゲット配列付近のシーケンシングデータの品質をチェックして、無秩序なピークやインデルを回避します。
      注:一般に、無秩序なピークは、PCRアニーリング温度を調整することで効果的に除去できます。

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結果

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TSR2の変異は、ダイヤモンドブラックファン貧血(DBA)を引き起こすことが報告されています42。ここでは、i-Silence戦略を使用してtsr2(M1V)変異を持つDBAゼブラフィッシュモデルを構築しました。ゼブラフィッシュtsr2のスタートコドンのアデニンは、zSpRY-ABE8eを用いてグアニンへの変換に成功しました(図3)。

サンガーシーケンシング結果のEditR解析では、 tsr2 開始コドンのアデニン塩基にA/Gオーバーラップがあることが示されました(図4)。

F0ファウンダーを以前に生成された tsr2 ヘテロ接合変異体成体と交配させた後、受精後2日目(dpf)に顕微鏡下で胚表現型を観察しました。いくつかの胚は、対照と比較して、より小さな目と腫れた心膜の表現...

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ディスカッション

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このプロトコルは、ベースエディタzSpRY-ABE8eを使用したゼブラフィッシュ病モデルの構築を記述します。塩基置換のための従来のHDR経路と比較して、このプロトコルはより効率的な塩基編集を達成し、インデルの発生を減らすことができます。同時に、このプロトコルには、最近提案されたi-Silence遺伝子ノックアウト戦略をゼブラフィッシュに実装することが含まれます。まとめると、zSpRY-ABE8eは、疾患研究におけるゼブラフィッシュモデルの適用を強化します。

オフターゲット効果は、CRISPR/Cas9システムで一般的な問題です。PAMレスの制限を考慮すると、tsr2ターゲティング18を含む以前の研究で有意なオフターゲットが見つからなかったとしても、zSpRY-ABE8eのオフターゲット効果はより高い可能性があります。幸いなことに、この問題は厳格なgRNA設計基準によって回避でき、1つのゲノム配列のみがgRNAとPAMを正確に一致させ、予測されるオフターゲットサイトの総数を最小限に抑えます。さらに、ある研究では、リボ核...

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開示事項

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著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

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この原稿の草稿の英語テキストを編集してくれたLiwen Bianji(Edanz)のBarbara Garbers博士に感謝します。この研究は、広東省の主要地域研究開発プログラム(2019B030335001)、中国の国家重点研究開発プログラム(2019YFE0106700)、中国国家自然科学財団(32070819、31970782)、および広東省の水生経済動物の病原生物学および疫学の主要研究所の研究基金プログラム(PBEA2020YB05)によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロースSigma-AldrichA95391.5%アガロースを使用して注入プレート
ホウケイ酸ガラス毛細血管を作るために使用 ハーバード・イスラームBS4 30-0016
細胞培養皿 Falcon351029
ClonExpress Ultra One Step Cloning KitVazymeC115Kit for Infusion clone 
コドン最適化サービスSangon Biotech
Drummond MicrocapsDrummond MicrocapsP1299-1PAK長さ:32 mm、容量:0.5 μL
EasyEdit gRNAサービスGenScript
Fine ForcepsFine Scientific Instrument11254-20Meedle
Flaming/Brown Micropipette Pullerをスタッター器具P-97ガラス毛細血管を引っ張るために使用されます
HotStart Taq PCR StarMixGenstarA033-101PCR反応に使用
インテリジェント人工気候ボックスTENLINPRX-1000Aゼブラフィッシュの胚を培養するために使用されます
メチルセルロースSigma-AldrichM0512ブラフィッシュを固定するために使用されます
マイクロローダーピペットのヒント エッペンドルフ5242956003
mMACHINEキット 
Mut Express II 高速変異導入キット V2VazymeC214-01部位特異的変異導入用キット
空気圧マイクロインジェクターZGene BiotechZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9Addgene46757
RNeasy FFPE キット Qiagen73504RNA精製用キット
サンガーシーケンシングサービスSangon Biotech
水酸化ナトリウム、粒状SangonA100173-0500NaOH
体顕微鏡オリンパス 型の写真に使用SZX10
SZシリーズ ズーム実体顕微鏡CNOPTECSZ650
T3 mMESSAGEAmbionAM1348in vitro転写用キット 
TIANprep ミニプラスミドキットTIANGENDP103-03プラスミド抽出キット用キット
TIANquick ミニ精製キット TIANGENDP203-02直線化プラスミド精製用キット
トリカインSigma-AldrichE10521ゼブラフィッシュの麻酔に使用
トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタンサンゴンA600194-0500トリス&ミドドットの成分;ゲノム抽出に使用されるHCl
XbaINew England BiolabsR0145Sプラスミドの線形化に使用される制限エンドヌクレアーゼ
壊すために使用  ゼ ゲノム抽出に使用される 実表現

参考文献

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PAM CRISPR Cas9 gRNA

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