方法論記事

タンパク質の高次構造分析のための質量分析ベースのアプローチ

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DOI:

10.3791/64979

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2023年3月3日

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1Biologics Development, Bristol Myers Squibb, 2Eli Lilly and Company

この記事について

要約

議論された記事:

Espino, J. A., Jones, L. M.線虫Caenorhabditis elegansにおけるタンパク質相互作用の研究のためのin vivoヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリント。視覚化された実験のジャーナル。(158)、E60910(2020)。

Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. タンパク質の細胞内高速光化学酸化による細胞タンパク質の特性評価.視覚化された実験のジャーナル。(157)、E60911(2020)。

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. 凍結乾燥粉末中のタンパク質構造と相互作用を研究するための質量分析アプローチ.視覚化された実験のジャーナル。(98)、E52503(2015)。

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J.ペプチド生合成酵素を研究するための水素-重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム。視覚化された実験のジャーナル。(159)、E61053(2020)。

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. 質量分析によるタンパク質高次構造の研究のためのジエチルピロカーボネートによる共有結合標識.視覚化された実験のジャーナル。(172)、E61983(2021)。

Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. 可動XYステージ付きプラットフォームインキュベーター: タンパク質の細胞内高速光化学酸化を実施するための新しいプラットフォーム。視覚化された実験のジャーナル。(171)、E62153(2021)。

Haupt, C. et al. インタクトタンパク質複合体の化学架橋と質量分析を組み合わせて、マルチサブユニットタンパク質集合体のアーキテクチャを研究する。視覚化された実験のジャーナル。(129)、E56747(2017)。

Lento, C. et al. タンパク質の構造とダイナミクスを研究するための時間分解エレクトロスプレーイオン化水素-重水素交換質量分析。視覚化された実験のジャーナル。(122)、E55464(2017)。

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. タンパク質の高次構造解析を行うためのレーザーフリーのヒドロキシラジカルタンパク質フットプリント。視覚化された実験のジャーナル。(172)、E61861(2021)。

Misra, S. K., Sharp, J. S. タンパク質の高速光化学酸化におけるリアルタイム補償を可能にし、タンパク質のトポグラフィー変化の決定を可能にします。視覚化された実験のジャーナル。(163)、E61580(2020)。

Chaihu, L. et al. トップダウン質量分析によるタンパク質のコンフォメーション特性評価のためのキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換.視覚化された実験のジャーナル。(172)、E62672(2021年)。

編集記事

高次構造(HOS)は、タンパク質の機能と密接に関連しているため、タンパク質の特性評価の重要な側面です。質量分析(MS)は、タンパク質HOS1を評価するための重要な方法の1つです。MSベースのアプローチでは、タンパク質構造を原子分解能で分離することはできませんが、中高空間分解能、高い特異性、低いサンプル量要件、高スループット、およびプロテオミクス機能という利点があります。

MSベースのタンパク質フットプリントアプローチは、タンパク質の溶媒でアクセス可能な表面を分析することによってタンパク質HOSを評価し、通常、さまざまな化学標識アプローチと組み合わせます。水素-重水素交換(HDX)などの可逆的標識は、タンパク質1,2の骨格アミド水素を標的とします。不可逆的標識では、特定のアミノ酸残基を標的とする化学物質3、または反応速度が速いさまざまな残基を標識するラジカルのいずれかを利用します1。化学的架橋も不可逆的な標識カテゴリーの一部ですが、その二価の特徴により、2つの架橋部位間の空間的制約の決定が可能になり、独自のトポロジー的洞察が得られます4,5。これらすべてのアプローチを組み合わせて「ツールボックス」を形成できるため、MSはタンパク質HOSを解明するための貴重なツールになります。

このメソッドコレクションは、MSベースのタンパク質HOS分析の分野における最近の進歩を紹介するために整理されました。最初の一連の記事では、HDXベースのアプローチを取り上げています。Habibi と Thibodeaux6 は、比較的古典的な連続的なボトムアップの HDX-MS アプローチについて説明しています。溶液中の水素-重水素(H/D)交換を複数回の交換時間で行い、その後オンカラムでペプシンを消化することで、重水素の取り込みレベルをペプチドレベルで測定できます。差動実験(つまり、結合状態と非結合状態)を実行する場合、重水素取り込みレベルの増加または減少を示すペプチドは、HOSで変化を経験する領域を表します。著者らは、ランチペプチドシンテターゼを使用して、HDX-MSワークフローをうまく実証しています。

ボトムアップアプローチとは別に、HDX-MSはトップダウンの方法で実行することもできるため、分析者はインタクトタンパク質レベルでさまざまな分離戦略を適用できます。Chaihuら7 は、キャピラリー電気泳動を利用して、溶液中に共存する異なるタンパク質状態またはプロテオフォームを分離します。タンパク質は、重水素化バックグラウンド電解質溶液中のキャピラリー内を移動しながら電気泳動中にH/D交換を受け、その後、トップダウンMS分析と気相フラグメンテーションが行われ、グローバルレベルとフラグメントレベルの両方で重水素の取り込みレベルが評価されます。最後に、このコレクションには、H/D交換の異なる方法、すなわち凍結乾燥パワー8 とエレクトロスプレーイオン化後の交換9を強調する他の2つの方法もあります。

記事の 2 番目のグループでは、不可逆的なラベル付け方法について説明します。その中で、タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)は、タンパク質の表面をマークするための標識種としてラジカルを利用します10,11。実際には、過酸化水素はレーザーによって光活性化され、活性標識種として機能するヒドロキシルラジカルを生成します。MisraとSharp12は、アデニンをラジカル濃度のレポーターとして使用し、インラインラジカル線量測定システムを使用してアデニン応答を監視するラジカル線量測定の戦略を提示します。これにより、ヒドロキシルラジカル濃度をリアルタイムで補正できるため、反応条件を正規化して正確な読み出しが得られます。その後、WeinbergerとCheaはSharpグループと協力して、レーザーフリーのFPOPプラットフォーム13を開発しました。危険なレーザーをプラズマ光源に置き換え、これをインラインラジカル線量測定および自動サンプル収集システムと組み合わせることで、タンパク質HOSの特性評価を必要とする研究者に統合ソリューションを開発し、提供しています。

ジョーンズのグループによる3つの論文14、15、16 は、FPOPとタンパク質フットプリントを in vivo 研究に持ち込む可能性を探っています。このアプローチの利点は、タンパク質HOSをネイティブ環境で分析できるため、前例のないものです。細胞14 および 線虫15 におけるフットプリントの適用の成功は、天然状態でプロテオーム全体のHOSを追跡するための新しい可能性を開き、したがって、他のツールでは達成できないタンパク質HOSの深い理解を可能にします。

不可逆的標識のもう一つの重要な方法は、特定のアミノ酸残基を標的とする化学試薬を利用する3。Kirsch et al.17 は、共有結合標識によるタンパク質フットプリントのワークフローがよく利用されていることを報告しています。著者らは、標識試薬としてジエチルピロカーボネートを使用して、タンパク質の表面にある数種類のアミノ酸残基を標識することにより、タンパク質HOSの変化を調べました。微分実験とそれに続くタンパク質分解消化とボトムアップMS分析により、このワークフローを組み合わせることで、HOSの変化に直接関係する溶媒のアクセス可能性の変化を特定できます。

最後に、化学架橋は、二価化学試薬を利用してタンパク質を標識する別の重要なアプローチです4,5。化学架橋剤は、空間的に互いに近接し、多くの場合、構造複合体を形成する2つのタンパク質を架橋するために使用されます。Hauptら18は、タンパク質複合体の構造を理解するための化学架橋剤の使用を実証するプロトコルを報告しています。架橋タンパク質複合体は、2つの異なるレベルで分析できます。タンパク質分解消化とそれに続くMS同定により、架橋されたジペプチドはタンパク質複合体の相互作用部位を明らかにします。架橋されたサンプルを無傷の質量で分析する場合、複合体内のタンパク質サブユニットに関する化学量論的情報が容易に入手できます。

要約すると、過去30年間にわたり、タンパク質HOS分析のためのMSベースのツールが大幅に発展してきました。不可逆的で可逆的なフットプリントとMS分析は相互に補完し合い、タンパク質のHOS特性評価に大きく貢献します。このメソッドコレクションに含まれる作品は、MSベースのタンパク質HOS分析分野における注目の手法を表しています。これらの研究は、重要な質問に答えるために MS ベースのアプローチを利用しようとしている研究者にとって貴重なリソースです。より広い観点から見ると、フットプリントデータを構造予測に組み込むことは、MS ベースの手法の空間分解能の限界を打ち破るために重要です。そのようなアプローチの実現可能性を実証する先駆的な研究が存在します19,20。さらに、これらのアプローチは相互に補完し合い、さまざまな視点からの洞察を提供するため、プラットフォームの統合も重要です21,22。このコレクションで報告されている方法は、そのような統合の力を実証しており、この方向で継続的に開発されるでしょう。これらすべての進歩により、MS ベースのアプローチは分子量測定を超えて成長し、この分野では今後数十年にわたって継続的な成長が見られるでしょう。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者には確認がありません。

参考文献

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  13. Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins. Journal of Visualized Experiments. (172), e61861(2021).
  14. Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (157), e60911(2020).
  15. Espino, J. A., Jones, L. M. In vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e60910(2020).
  16. Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Platform incubator with movable XY stage: A new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (171), e62153(2021).
  17. Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e61983(2021).
  18. Haupt, C., et al. Combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies. Journal of Visualized Experiments. (129), e56747(2017).
  19. Biehn, S. E., Lindert, S. Accurate protein structure prediction with hydroxyl radical protein footprinting data. Nature Communications. 12 (1), 341(2021).
  20. Biehn, S. E., Lindert, S. Protein structure prediction with mass spectrometry data. Annual Review of Physical Chemistry. 73, 1-19 (2022).
  21. Zhang, M. M., et al. Epitope and paratope mapping of PD-1/nivolumab by mass spectrometry-based hydrogen-deuterium exchange, cross-linking, and molecular docking. Analytical Chemistry. 92 (13), 9086-9094 (2020).
  22. Zhang, M. M., et al. An integrated approach for determining a protein–protein binding interface in solution and an evaluation of hydrogen–deuterium exchange kinetics for adjudicating candidate docking models. Analytical Chemistry. 91 (24), 15709-15717 (2019).

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