本プロトコルは、天然寄生虫 Heligmosomoides polygyrusに感染した外植マウス腸のNAD(P)H蛍光寿命イメージングを記述し、これにより、宿主組織と寄生虫組織の両方で代謝プロセスを空間的に解決した方法で調査することができます。
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本プロトコルは、天然寄生虫 Heligmosomoides polygyrusに感染した外植マウス腸のNAD(P)H蛍光寿命イメージングを記述し、これにより、宿主組織と寄生虫組織の両方で代謝プロセスを空間的に解決した方法で調査することができます。
寄生虫は一般的に宿主の健康に悪影響を及ぼします。それらは、感染した人間や動物の健康に長期的に世界的に影響を及ぼし、したがって農業および社会経済的結果に影響を与えるため、大きな健康負担を表しています。しかし、寄生虫による免疫調節効果が報告されており、自己免疫疾患に対する治療上の関連性が期待されています。宿主と寄生虫の両方の代謝は、宿主と寄生虫の両方の防御に寄与し、腸内での線虫の生存の基礎ですが、適切な技術が不足しているため、ほとんど研究されていません。私たちは、NAD(P)H蛍光寿命イメージングを開発して、天然の線虫 Heligmosomoides polygyrus に感染したマウス腸組織に移植して適用し、宿主と寄生虫の両方の代謝プロセスを空間的に分解して研究しました。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)(以下、NADPH)は、種を超えて保存されていますが、これらは種を超えて保存されており、それらの結合状態と代謝プロセスを触媒する酵素の結合部位に依存します。最も多く発現するNAD(P)H依存性酵素に着目し、主要な防御機構である嫌気性解糖、酸化的リン酸化/好気的解糖、NOXベースの酸化的バーストに関連する代謝経路を同定し、感染時の宿主と寄生虫との間の代謝クロストークを特徴づけた。
寄生虫感染症は、人間の健康に大きな負担をかけます1,2。自己免疫疾患の増加と寄生虫感染の減少との間には相関関係が先進国で観察されています。寄生虫は、過剰な宿主の免疫応答を抑制することにより、有益な効果をもたらすことが知られています。H. polygyrusは、げっ歯類の腸内に発見される天然寄生虫であり、この寄生虫は、感染した宿主3,4,5,6,7,8,9,10,11において、他のメカニズムの中でも特に、宿主の抗寄生虫免疫応答を低下させる免疫調節メカニズムを誘導することが知られている.これらの制御メカニズムは、変性自己....
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すべての実験は、国家動物保護ガイドラインに従って実施され、動物保護のためのドイツ動物倫理委員会(G0176/16およびG0207/19)によって承認されました。このプロトコルは、NAD(P)H蛍光寿命イメージングデータの取得とデータ評価について説明しており、これにより、天然のマウス腸内線虫である H.polygyrusに感染した際の宿主腸と寄生虫の両方の一般的な代謝活性と特定の代謝経路を評価することができます。この目的のために、10-12週齢の雌C57BL/6マウスを200匹のステージ3幼虫(L3)に感染させた。感染の異なる時点で、感染したマウスを屠殺し、十二指腸を切除し、前述したように画像化の準備をした33。感染していない、年齢と性別が一致したマウスの十二指腸も同様に調製され、制御目的で画像化されました。さらなるイメージングと分析に必要な組織特性を維持するためには、サンプルを外植栽直後に処理し、次のステップ(ステップ1.1-1.7)を迅速に実行する必要があります(図1B)。
1. サンプル調製
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現在のNAD(P)H−FLIM手順28,29,33を記載のフェーザー分析法と組み合わせて使用し、健常で感染した十二指腸における代謝活性および代謝経路を、マウス腸内線虫H. polygyrusの感染後6日目、10日目、12日目、および14日目に測定した。
NAD(P)H-FLIMによって明らかにされた切除された十二指腸における腸管組織の生存率の保存
ex vivoでの組織活性を調査し、切除された組織サンプルが生体内の組織と比較して代謝活性を維持する期間を決定するために、NAD(P)H-FLIMは、(i)新たに切除された、または(ii)氷上に3時間保持された健康なマウスの切除された十二指腸組織に対して行われ、その結果を麻酔マウスの腸で取得されたすでに公開されているNAD(P)H-FLIMデータと比較した
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プロトコール内の重要なステップは、調製中およびROIを見つけるときに発生します。部分的に消化された食品の繊維は、主にNAD(P)H蛍光と重なる繊維の内因性発光だけでなく、その高調波発生信号によるイメージングの課題となっています。糞便のないROIを見つけることは非常に重要です。糞便が入る場所を測らないようにしました。これは壊れやすい絨毛の完全性に影響を与え、粘液の粘度に影響を与えるため、洗浄は避けられました。さらに、全体の調製手順は、組織の変性および乾燥を避けるために、サンプルあたり約5〜10分続くことが望ましい。また、使用される低濃度アガロースは、腸管粘液34の粘度を模倣している。したがって、測定中にワームが自由に動いている間、絨毛が崩壊しないことを保証できます。測定は、細胞代謝をイメージングするための最良の条件を維持するために、45分(図1A、Bおよび図1A、
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著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
Robert Güntherの優れた技術サポートに感謝します。ドイツ研究評議会(DFG)からの資金援助は、助成金SPP2332 HA2542/12-1(S.H.)、NI1167/7-1(R.A.N.)、HA5354/11-1(A.E.H.)、RA2544/1-1(S.R.)、Grant SFB1444、P14(R.A.N.、A.E.H.)、Grant HA5354/8-2(A.E.H.)、およびGrant GRK2046 B4およびB5(S.H., S.R.)HA2542/8-1(S.H.)が高く評価されています。W.L.は、ベルリンのBerliner Hochschule für Technik, School of Applied Sciencesから医学物理学/物理工学の博士号を取得しました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アガロー | サーモフィッシャー | J32802.22 | 超高純度 |
| 鈍いはさみ | FST ファイン サイエンス ツール | 14108-09 | 鈍い 14 cm |
| ボディ c12 | サーモフィッシャー | D3822 | 1 mg 固体 |
| コントロール ユニット、ダイオード、TCSPC | LaVision Biontech | カスタム | TrimScope II |
| DMSO | サーモ フィッシャー | D12345 | 3 mL |
| フィルター | Chroma 755 | 466 ± 20, 525 ± 25, 593 ± 20, 655 ± 20 nm | |
| フォリオドレープシート | Hartmann | 277500 | |
| グローブ | Sigma-Aldrich | Z423262 nitril | |
| Halogen torch | Leica | This item has been phased out and no longer available | KL 1500 LCD |
| hPMT | 浜松, ドイツ | H7422 | GaAsP |
| Ilastik | Netlify | フリーソフトウェア | Javaバックエンド |
| ImageJ | 国立衛生研究所 | フリーソフトウェア | FIJI - 標準プラグイン |
| Imspector | LaVision Biontech-Vers | . 208 | |
| Intravital stage | LaVision Biontech | カスタム | TrimScope II |
| レンズシステム 20x | Zeiss | カスタム | W-plan-apochom 20x Waterimmersion NA 1.05 |
| 水銀蒸気トーチ | LaVision Biontech | カスタム | |
| マイクロブラシ | フィッシャー科学 | 22-020-002 | 85 mm |
| 顕微鏡 | LaVision Biontech | カスタム | TrimScope II |
| オシロスコープ | ロード&シュワルツ | 1326.2000.22 | |
| PBS | シグマ - アルドリッチ | AM9624 | 0.5 L |
| ペトリ皿 | シグマ アルドリッチ | P5606 | 40 x 15 mm |
| ピペット | サーモフィッシャー | 4651280N | アインカナルピペット |
| ピペットチップ | サーモフィッシャー | 94056980 スピッツェン ミット フィルター | |
| PMT | 浜松 | H7422 | GaAsP |
| Python | Pythonソフトウェア基盤 | フリーソフトウェア | Anaconda 3.7 Spyder IDE、KYTE |
| Sterio顕微鏡付き標準ライブラリ | ライカ | このアイテムは段階的に廃止され、入手できなくなりました | M26, 6.3倍ズーム |
| Ti:Sa レーザー カメリオン ウルトラ II | コヒーレント, APE-690-1080 | nm 調整可能, 80MHz | |
| ティッシュグルー | 3M | 51115053603 | 3 mL |
| ピンセット | FST ファイン サイエンス ツール | 11049-10 | blund, graefe, angeled |
| ピンセット | FST ファイン サイエンス ツール | 91197-00 | Dumont,闉 |
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