方法論記事

生体分子間相互作用の研究のための蛍光ベースの方法

2024年2月23日

1Interdisciplinary Institute for Neurosciences (IINS), CNRS UMR5297, University of Bordeaux

この記事について

要約

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議論された記事:

Reiser, A., Woschée, D., Kempe, S. M., Rädler, J. O. Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - 細胞動態を定量化する汎用性の高い技術。視覚化された実験のジャーナル。(169)、E62025(2021)。

Konate, K., Seisel, Q., Vivès, E., Boisguérin, P., Deshayes, S. 細胞透過性ペプチドによる膜の不安定化を調査するための蛍光漏出アッセイ.視覚化された実験のジャーナル。(166)、E62028(2020)。

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, M., Drin, G. 膜間のホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-リン酸交換の蛍光ベースの測定.視覚化された実験のジャーナル。(169)、E62177(2021)。

Abdelhamid, M. A. S., Rhind-Tutt, A. V., Ambrose, B., Craggs, T. D. オープンソースのsmfBoxを使用して、正確で正確な単一分子FRET測定を行います。視覚化された実験のジャーナル。(173)、E62378(2021年)。

編集記事

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生体分子相互作用は生物学的プロセスにおける重要なプレーヤーであり、したがって生命科学の根本的に重要な側面です。蛍光技術は、これらのプロセスを調査および理解するために最も強力で広く適用された方法の一部となっています。in vitro 蛍光アプローチは、細胞外および細胞内の分子相互作用をリアルタイムで検出できる可能性を提供し、他のアプローチに比べて大きな利点となります。これは、細胞プロセスの調節において重要な役割を果たすさまざまなタンパク質間相互作用、タンパク質間相互作用、タンパク質間相互作用に使用されてきました。

このコレクションは、生体分子相互作用を研究するためのさまざまな蛍光ベースの技術とアプリケーションの概要を示し、細胞プロセスの理解を広げます。

Reiser et al.1 は、自動画像取得と処理 (Live Cell Imaging on Single Cell Arrays [LISCA]) を介して 個々の細胞からの細胞動態を分析するためのハイスループット法について説明しています。この手法を使用して、蛍光レポーターは、トランスフェクション後の単一細胞遺伝子発現、シグナル伝達カスケードにおける細胞応答、アポトーシスイベント、幹細胞分化など、さまざまな独立した生物学的プロセスの時間分解された読み出しを提供します。著者らは、走査型タイムラプス顕微鏡を使用して単離された細胞アレイでイメージングを行い、数百の単一細胞軌道と統計分析に十分なデータをもたらしました。単一細胞蛍光時間トレースは、研究者が遺伝子送達メカニズムをより深く理解し、通常は固有の変動によって決定される複雑な生物学的システムの特徴である細胞の不均一性を解決するのに役立ちます。

Konateら2は、膜相互作用ペプチドの相互作用、摂動、および/または透過処理を特徴付けるための生物物理学的方法を報告 しています。彼らのプロトコルでは、リポソームを処方および精製し、蛍光漏れを特徴付けるためのさまざまなステップを正確に説明しています。この方法は、低分子干渉RNA(siRNA)と組み合わせて、または強力な治療用ペプチド(iCAL36)と組み合わせてWRAPと呼ばれる細胞浸透ペプチド(CPP)と適用され、よく知られているCPPであるペネタラチンと比較されます。この手法には複数の利点があります。実装は迅速かつ簡単です。脂質膜組成を厳密に制御して、さまざまな種類の細胞膜を模倣することができます。蛍光色素は、目的のペプチドとその膜漏出特性に応じて適応させることができます。最後に、サンプルは調製後に非常に安定しています。この技術の多用途性により、細胞損傷や薬物送達に関するさまざまな生物学的問題を調査するための有用なアプローチになります。

哺乳類の細胞膜におけるホスファチジルセリン(PS)の存在は、細胞アポトーシスや膜修復のためのタンパク質の動員などのさまざまなシグナル伝達プロセスにおいて重要です。原形質膜の表面でのPS分布の移動と変化は、Ikhlefら3が論文で取り組 む重要な問題です。彼らは、組換え酵母タンパク質Osh6pによるPSおよびPI-4-P脂質輸送および交換をリアルタイムで測定するプロトコルを説明しています。この方法では、蛍光センサーを利用して、脂質移動タンパク質 (LTP) が脂質小胞間の勾配に沿って人工膜内の脂質を抽出または移動するかどうかを検出します。このプロトコルにより、標識されていない脂質を操作して、脂質をLTPに正しく結合させることができます。さらに、放射能ベースのアッセイや質量分析などの従来の方法と比較して、より優れた時間分解能が達成されます。この方法は、研究者が異なる細胞小器官と膜間の脂質の抽出と交換をより深く理解するのに役立ちます。

フェルスター共鳴エネルギー移動 (FRET) は、生体分子系を研究するための強力な方法です。この手法は単一分子(smFRETなど)に適用でき、生体分子内の絶対距離を測定できます。Abdelhamid et al.4 は、自由に拡散する単一分子上の2つの色素間のFRET効率を測定できる最近開発された共焦点セットアップであるsmfBoxを実行する方法に関する段階的なプロトコルを提示しています。サンプル調製から装置のセットアップ、アライメント、データ収集、分析まで、smFRET技術を実装して使用する方法を示します。さらに、正確な FRET 導出距離測定に必要な補正係数を決定する方法についても説明しています。ここでは、この方法は自由に拡散するDNA二本鎖に適用され、タンパク質のコンフォメーション変化やタンパク質とDNAの相互作用の研究など、幅広いアプリケーションに拡張できます。

生物学的プロセスには、非常に多様で多数の生体分子相互作用が含まれており、新しい蛍光ベースのアッセイやセンサーの開発に十分な余地が残されています。このコレクションは、研究者に蛍光ベースの方法の革新と開発の概要を提供します。各記事は、さまざまな蛍光ベースの方法に光を当て、蛍光アッセイがいかに重要かつ多用途になっているかを強調しています。このコレクションでは、これらの方法について説明しており、さまざまなグループや研究分野での広範な使用を奨励しています。

開示事項

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著者は開示するものは何もありません。

謝辞

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M-L. J. は、フランス文化財団 (FRM ARF201809006996) から資金提供を受けました。

参考文献

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  1. Reiser, A., Woschée, D., Kempe, S. M., Rädler, J. O. Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a versatile technique to quantify cellular kinetics. Journal of Visualized Experiments. (169), e62025(2021).
  2. Konate, K., Seisel, Q., Vivès, E., Boisguérin, P., Deshayes, S. Fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide. Journal of Visualized Experiments. (166), e62028(2020).
  3. Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate exchange between membranes. Journal of Visualized Experiments. (169), e62177(2021).
  4. Abdelhamid, M. A. S., Rhind-Tutt, A. V., Ambrose, B., Craggs, T. D. Making precise and accurate single-molecule FRET measurements using the OpenSource smfBox. Journal of Visualized Experiments. (173), e62378(2021).

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Live cell ImagingSingle cell ArraysCellular KineticsFluorescent Leakage AssayMembrane DestabilizationCell penetrating PeptidePhosphatidylserine ExchangePhosphatidylinositol 4 phosphateSingle molecule FRETSmfBox

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