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歴史的に、科学者は医療製品(医薬品や医療機器など)を人間に試験する前に安全かどうかを判断するために、動物実験に大きく依存してきました。動物実験は多くの状況で依然として正当化されていますが、代替手段を見つけることが非常に望ましいです。科学と工学の最近の進歩により、動物実験に代わるものの開発はこれまで以上に実現可能になっています。心臓の安全性評価のためのヒト の in vitro 代替方法の開発に新たな焦点が当てられているのは、少なくとも部分的には人工多能性幹細胞 (iPSC) 技術の進歩に起因しています。ヒト心臓細胞は、患者からの単純な血液または皮膚サンプルを使用してラボで生成でき、堅牢なハイスループット検査に適したヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)が得られます。3D組織バイオエンジニアリング、微小電極アレイ技術、生細胞イメージング、およびその他の技術の進歩も、このコレクションに含まれるプロトコルの開発に貢献しています。
Gerges et al.1 によるプロトコルは、非侵襲的光学法 (MyoBLAZER) を適用して、成人ヒト初代心室心筋細胞の収縮性の変化を評価します。細胞は電気的にペースが調整され、画像分析は複数の細胞にまたがるサルコメア短縮を並行して測定します。この方法は、化合物ごとにデバイスごとに30分ごとに濃度-応答曲線を収集でき、構造活性関係データを提供します。この非侵襲的な光学的方法により、ハイスループットスクリーニング中に成人ヒト心筋細胞の生理学と薬理学を保存できます。さらに、ヒト成人心筋細胞の使用は、収縮性を予測するための重要な翻訳部分を提供することができます。
Lickiss et al.2 による方法論は、収縮性とインピーダンス/細胞外電界電位 (EFP) のハイブリッド技術を提示し、柔らかく柔軟なシリコンベースの細胞培養基質を使用することにより、業界標準の 96 ウェル プラットフォームに重要な成熟促進機能を追加します。このアプローチは、市販の健康なhiPSC-CMにおいて、イソプロテレノールに対する生理学的陽性の変力性反応を再確立することによって成功したことが証明されました。ハイブリッドシステムにより、収縮力(mN/mm2)、拍動率、セル単層密度と完全性を直接測定できます。また、従来の3Dシステムの課題(つまり、低スループット、かなりのトレーニングの必要性)にも対処し、アッセイの完了に必要な時間とコストを削減します。
このコレクションには、プローブフリーのビデオベースの顕微鏡を使用して、柔軟なマトリゲルマットレスにプレーティングされた2Dヒト幹細胞心筋細胞における心臓収縮性調節(CCM)療法を評価するための in vitro、ハイスループット、非侵襲的な方法を実証するFeasterら3の研究も含まれています。著者らは、健康および罹患のhiPSC-CMの収縮特性に対するCCMの急性効果を強調しています。このツールは、CCM の安全性または有効性を理解するための低コストの方法を提供し、動物実験への依存を減らし、心臓電気生理学医療機器の規制上の意思決定を支援する可能性があります。
Schaeferら4による洗練されたプロトコルは、通常、hiPSC-CMの細胞外電界電位を記録する標準的な微小電極アレイ(MEA)システムの新しい拡張を説明しており 、ナノ秒のレーザービームパルスで細胞膜を開くことにより、細胞内のような活動電位の記録を可能にします。このデバイスには、標準的なMEAの利点(すなわち、シグナル伝播モニタリング、急性および慢性実験)が含まれているだけでなく、細胞エレクトロポレーションに強い電界パルスを使用せずに、細胞内のような活動電位形状を洞察することができます。
Berry et al.5 によるプロトコルは、直接収縮力測定のための 3D 工学筋肉組織 (EMT) の再現性のある製造を可能にする新しいプラットフォームを説明しています。この装置は、収縮力のマイクロニュートン変化を検出できるため、用量依存的な化合物スクリーニングのための強力なツールになります。hiPSCベースの心臓組織および骨格筋組織の収縮性は、最大24の組織で同時に記録でき、データは数週間または数か月にわたって縦断的に分析できます。したがって、研究者に必要な追加スキルやトレーニングは最小限です。
最後に、Zhaoら6による出版物では、ユーザーラボが社内で生成できる心筋細胞での使用に最適化された一連の機能アッセイ(細胞外電界電位、活動電位、収縮性、およびカルシウム)について説明しています 。これは、スタンフォード大学心臓血管研究所バイオバンク(https://med.stanford.edu/scvibiobank/request-cells.html)から入手可能な以前に公開された分化プロトコルとiPS細胞を使用して行うことができ、幅広い「罹患」細胞と対照細胞を提供します。これは、標準的なアプローチ (パッチ クランプ、微小電極アレイ、カルシウム感受性蛍光プローブ、およびビデオベースの収縮性測定) を含む、主要な心臓収縮性と電気生理学的記録のための完全な方法セットです。
結論として、現在の方法コレクションは完全であるとは主張していませんが(そして成長し続けています)、それはすでに比較的包括的な方法のセットであり、ヒト心筋細胞の収縮性と電気生理学的記録における現在の多くの課題を示しています。これには、初代ヒト心筋細胞1、健康なドナーに由来する市販のhiPSC-CMのプロトコル2,3,4、および先天性心疾患の特徴を持つ細胞用に最適化されたプロトコルが含まれています3,6。これらの方法は、パッチクランプ実験用の単一細胞6から、硬い基質上の従来のhiPSC-CM 2D単層1,4、柔らかく柔軟な基質上の2D心筋細胞単層2,3、そして最後に3D操作された心臓組織5まで、さまざまな細胞培養条件に及びます.含まれる方法は、収縮性(ビデオベースのアッセイ1,3,6で間接的に測定するか、収縮力2,5で直接測定)、活動電位(パッチクランプ6を使用した単一細胞で、MEA4,6、または細胞をポレートする新しいアプローチを使用して、標準のMEAシステム4)およびカルシウム過渡現象(カルシウム感受性プローブ6を使用)で活動電位様の記録を記録することによって。まとめると、これらの方法は、他の実験室で再現できる詳細なプロトコルを提供するだけでなく、次のようなヒト心臓のin vitro方法のいくつかの課題も示しています。蛍光電圧またはカルシウム感受性プローブの望ましくない影響。従来の活動電位記録の低スループット。標準的なフィールドの潜在的な期間の記録の解釈の難しさ。医療機器の評価のためのアッセイの欠如(例:薬物)。これらの方法の改善に取り組んでいる研究室の数を見るのは刺激的であり、将来的には必然的にこれらの方法の広範な適応につながるでしょう。