ここでは、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)細胞の主要なモジュレーターであるキスペプチンニューロンを含む脳スライスに対して全細胞パッチクランプを実行するためのプロトコルを提示します。キスペプチンニューロンの活動に関する知識を加えることにより、この電気生理学的ツールは、過去20年間に神経内分泌学分野の重要な進歩の基礎として機能してきました。
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この記事について
サマリー
要約
キスペプチンは、視床下部-下垂体-性腺(HPG)軸の成熟と生殖能力に不可欠です。視床下部のキスペプチンニューロンは、視床下部の弓状核と同様に、前腹側脳室周囲核および吻側脳室周囲核に位置し、他の細胞の中でもとりわけゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)ニューロンに投射する。以前の研究では、キスペプチンシグナル伝達がKiss1受容体(Kiss1r)を介して発生し、最終的にGnRHニューロン活性を刺激することが示されています。ヒトおよび実験動物モデルでは、キスペプチンはGnRH分泌を誘導するのに十分であり、その結果、黄体形成ホルモン(LH)および卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出を誘導するのに十分である。キスペプチンは生殖機能に不可欠な役割を果たすため、視床下部キスペプチンニューロンの固有の活動が生殖関連の行動にどのように寄与するかを評価し、これらの特性を変化させることができる主要な神経伝達物質/神経調節物質を特定するために取り組んでいます。全細胞パッチクランプ技術は、げっ歯類細胞におけるキスペプチンニューロン活性を調査するための貴重なツールとなっています。この実験技術により、研究者は自発的な興奮性および抑制性のイオン電流、静止膜電位、活動電位の発火、および細胞膜の他の電気生理学的特性を記録および測定できます。本研究では、視床下部キスペプチンニューロンを定義する電気生理学的測定として知られる全細胞パッチクランプ法の重要な側面と、その技術に関する関連する問題の議論をレビューします。
概要
ホジキンとハクスリーは、いくつかの科学的研究で説明されている活動電位の最初の細胞内記録を作成しました。この記録は、大きな直径(~500μm)を持つイカ軸索で行われ、軸索の内側に微小電極を配置することができました。この研究は科学研究に大きな可能性を提供し、後に活動電位発生1,2,3,4,5,6,7,8のイオン基盤を研究するために使用された電圧クランプモードの作成に至りました。何年にもわたって、技術は改善され、科学研究に広く適用されるようになりました6,9。Erwin NeherとBert Sakmannによって開始された研究を通じて1970年代後半に行われたパッチクランプ技術の発明により、研究者は単一の電極のみを使用して、ほぼすべてのタイプの細胞における単一のイオンチャネルと細胞内膜電位ま....
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プロトコル
すべての動物の手順は、サンパウロ大学の生物医科学研究所の動物倫理委員会によって承認され、ブラジル動物実験大学によって採用された倫理ガイドラインに従って実施されました。
1.溶液の調製
- 内部溶液の調製
注意: 内部溶液はパッチクランプマイクロピペットを満たし、細胞の内部に接触します( 図2の例を参照)。内部溶液は、測定される活性のタイプに応じて変化し得る33。- 実験目的と適切なレコードタイプを考慮して内部ソリューションを選択します。電流クランプモードで膜電位を記録するには、120 mM K-グルコン酸塩、1 mM NaCl、5 mM EGTA、10 mM HEPES、1 mM MgCl 2、1 mM CaCl2、3 mM KOH、10 mM KCl、および4 mM(Mg)-ATPで構成される内部溶液を使用します。表1に示すように、所望の最終容量に従ってすべての塩を秤量する。
- 溶液の最終体積の90%に達するのに十分な脱イオン水を使用してください。この容量は、pHと浸透圧を調整するのに十分なスペースを確保します。
- すべての成分を完全に添加して混合した後、pHメーターを使用して5 M ....
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結果
視床下部キスペプチンニューロンの活動に対するヒト組換え成長ホルモン(hGH)の可能な影響を研究するために、脳スライスで全細胞パッチクランプ記録を行い、このホルモンがAVPV / PeNキスペプチンおよびARHキスペプチンニューロンの活性に急性変化を引き起こすかどうかを評価しました。この研究では、成体のKiss1-Cre / GFP雌(発情期)および雄マウス36を使用しました。視床下部キスペプチンニューロンの特性は性ステロイドレベル19,20によって異なる可能性があるため、生殖腺無傷の動物を実験用に選択しました。男女間の違いを評価することは本研究の範囲を超えていましたが、詳細についてはCroftらおよびFrazãoら19,20を参照してください。マウスやラットなどの遺伝子改変動物は、特定の遺伝子または選択的誘導アブレ.......
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ディスカッション
全細胞パッチクランプ技術の開発は科学界に大きな影響を与え、科学研究を発展させ、いくつかの発見を可能にするために最も重要であると考えられていました。科学への影響は、1991年にノーベル医学賞を受賞するのに十分であり、この発見は、生理学的および病理学的条件下でイオンチャネルがどのように機能するかについてのより良い理解と、治療薬の潜在的な標的の特定への扉を開いた11,39,40,41。.医学の分野では、この技術を使用して行われた優れた発見の1つは、臨床的に使用されるいくつかの物質(局所麻酔薬、抗不整脈薬、抗糖尿病薬、筋弛緩薬など)がイオンチャネルと直接相互作用することでした42。したがって、その適用可能性は臨床研究所や基礎研究部門で明らかです。この記事では、視床下部キスペプチンニューロンを含む脳スライスで全細胞パッチクランプ実験を実行するため.......
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開示事項
宣言される利益相反はありません。
謝辞
本研究は、サンパウロ研究財団[FAPESP助成金番号:2021/11551-4(JNS)、2015/20198-5(TTZ)、2019/21707/1(RF)、およびCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV)の支援を受けた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| aCSF、内部およびスライス溶液用コンパウンド | |||
| ATP | Sigma Aldrich/各種 | A9187 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich/各種 | C7902 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich/various | G7021 | |
| EGTA | Sigma Aldrich/各種 | O3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich/ | H3375 | |
| KCL | Sigma Aldrich/ | P5405 | |
| K-グルコン酸 | Σ ΣAldrich/ | G4500 | |
| KOH | Σ Aldrich/ | P5958 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/ | M9272 | |
| MgSO4 | シグマ・アルドリッチ/各種 | 230391 | |
| NaCl | シグマ・アルドリッチ/各種 | S5886 | |
| NaH2PO4 | シグマ アルドリッチ/ | 各種 S5011 | |
| NaHCO<サブ>3 | シグマ アルドリッチ/各種 | S5761 | |
| 硝酸 | シグマ アルドリッチ/各種 | 225711 | コーション |
| 糖 | シグマ アルドリッチ/各種 | S1888 | |
| <ストロング>イク | |||
| エアテーブル | TMC | 63-534 | |
| アンプ | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Computer | Various-DIGIDATA | ||
| 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM | Molecular Devices | DD1440 | |
| デジタル蠕動ポンプ | Ismatec | ISM833C | |
| ファラデーケージ | TMC | 81-333-03 | |
| イメージングカメラ | ライカ | DFC 365 FX マイクロ | |
| マニピュレーター | サッター機器 | Roe-200 | |
| マイクロピペットプーラー | 成重 | PC-10 | |
| 顕微鏡 | ライカ | DM6000 FS | |
| オステオトーム | ボンター equipamentos &Tecnologia/various | 128 | |
| リカバリーチャンバー | ワーナー・インスツルメンツ/ハーバード・イスプ | ||
| レコーディング | ・チャンバー | ワーナー・インスツルメンツ | |
| スパチュラ | ・フィッシャー・サイエンティフィック/various | FISH-14-375-10;FISH-21-401-20 | |
| ビブラトーム | ライカ | VT1000 S | |
| ウォーターバス | フィッシャーサイエンティフィック/各種 | Isotemp | |
| ソフトウェアとシステム | |||
| AxoScope 10ソフトウェア | Molecular | Devices-Commander | ソフトウェア |
| LAS X広視野システム | Leica-Image | acquisition and analysis | |
| MultiClamp 700B | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | Commanderソフトウェア |
| PCLAMP 10 WINDOWS用ソフトウェア | 分子デバイス | Pclamp 10 Standard | |
| Tools | |||
| Ag/AgCl 電極、ペレット、1.0 mm | ワーナーインスツルメンツ | 64-1309 | |
| 湾曲止血鉗子 | 様々 | - | |
| シアノアクリレート接着剤 | LOCTITE/various | - | |
| 斬首ハサミ | 各種 | ・ | |
| 濾紙 | 各種 | ・ | |
| ガラスキャピラリー(マイクロピペット) | ワールド・プレシジョンズ・インク | TW150F-4 | |
| アイリスハサミ | ボンサー・イクイパメントス &Tecnologia/various | 65-66 | |
| パスツールガラスピペット | シグマ アルドリッチ/各種 | CLS7095B9-1000EA | |
| ペトリ皿 | 各種 | ||
| ポリエチレンチューブ | ワーナーインスツルメンツ | 64-0756 | |
| 脳解剖用カミソリ刃 | テッドペラ | TEDP-121-1 | |
| ブラトーム用カミソリ刃 | テッドペラ | TEDP-121-9 | |
| さみ | ボンサーequipamentos&;Tecnologia/various | 71-72, 48,49; | |
| シリコーン乳頭 | 各種 | - | |
| スライスアンカー | ワーナーインスツルメンツ | 64-0246 | |
| シリンジフィルター | クミリポア株式会社 | SLGVR13SL | Millex-GV 0.22 μm |
| ピンセットボン | ターequipamentos&技術/各種 | 131, 1518 |
参考文献
- Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
- Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
- Gandini, M. A., Sandoval, A., Feli....
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