方法論記事

健康と病気における網膜血管の研究方法

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DOI:

10.3791/65008

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2023年2月17日

1Eye Research Center and Foundational Medical Studies Oakland University William Beaumont School of Medicine (OUWB), Eye Research Institute, Oakland University

この記事について

要約

議論された記事:

Damsgaard, C., Lauridsen, H. フロー増強超音波による眼の深部血管イメージング. 視覚化された実験のジャーナル。(176)、E62986(2021)。

Macouzet-Romero, F. J., Ochoa-Máynez, G. A., Pérez-García, O., Pérez-Aragón, B. J., Lima-Gómez, V. 光干渉断層撮影血管造影法で測定した黄斑灌流密度への毛細血管およびその他の血管の寄与の評価.視覚化された実験のジャーナル。(180)、E63033(2022)。

Subirada, P. V. et al. 非増殖性網膜および増殖性網膜症のマウスの全マウント網膜における血管パラメータの定量化。視覚化された実験のジャーナル。(181)、E63126(2022年)。

Vaglienti, M. V., Subirada, P. V., Barcelona, P. F., Bonacci, G., Sanchez, M. C. Müller glial cells における 2',7'-ジクロロフルオレセイン ジアセテート プローブとフローサイトメトリーを使用した活性酸素種の定量化.視覚化された実験のジャーナル。(183)、E63337(2022年)。

Tomaszewsk, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. 初代マウス網膜色素上皮細胞の単離.視覚化された実験のジャーナル。(189)、E63543(2022)。

Elmasry, K., Moustafa, M., Al-Shabrawey, M. 網膜神経血管疾患を研究するためのex vivoモデルとしての成体マウス網膜の網膜外植片。視覚化された実験のジャーナル。(190)、E63966(2022)。

編集記事

目には、角膜、目の水晶体、硝子体など、血管を欠いている透明な媒体が含まれています。光は、網膜の後部にある光受容体に到達する前に、これらの媒体を通過する必要があります。具体的には、角膜、水晶体、硝子体は、光の吸収と画像の歪みを避けるために血管を欠いています1。網膜血管は3つの層に分かれています:視神経乳頭から神経線維層内の周辺まで伸びる表層。内側の網状層内に位置する中間層。外側の網状層を通して分布する深層。この血管ネットワークは網膜内側に血液を供給し、光受容体は脈絡膜血管からの拡散によって供給されます。網膜の内側と外側の栄養は、内側と外側の血液網膜関門 (BRB) によって厳密に制御されています。網膜内皮細胞、周皮細胞、およびグリア細胞が内部BRBを構成します。一方、網膜色素上皮(RPE)細胞、脈絡膜内皮細胞、およびブルッフ膜は外側のBRBを形成します。網膜血管の病理学的変化は、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、未熟児網膜症など、いくつかの網膜疾患の特徴です。これらの病理学的変化には、血管の炎症、BRBの破壊、毛細血管変性、網膜血流の変化、および病的な網膜血管新生(RNV)が含まれますが、これらに限定されません2,3,4。したがって、これらの変化を実験動物を用いたin vivoとin vitroの両方で、ヒト疾患における生物学的・生化学的環境と同様の条件下で様々な網膜細胞を培養することにより、効果的な研究法を開発することが重要です。研究者は、網膜血管疾患の根底にある分子および細胞メカニズムを分析するために、いくつかの実験的アプローチを使用できます。この方法コレクションの目的は、さまざまな網膜疾患における正常な血管発達と血管異常を研究する方法に関して、視覚科学者や眼科医の専門知識を他の研究者と共有することです。

Damsgaardらによる論文は、研究者が造影剤を使用せずに眼の血管系を3次元で画像化できるようにするフローエンハンスト超音波法を提示しています5。この方法は、色素性網膜の後ろの目のイメージングにおける安定性により、他の方法の限界を克服します。この方法は金魚で実証されていますが、有核赤血球を持つ他のすべての実験種に適用できます。この方法は、正常および病理学的条件下で眼の血管を視覚化するのに価値があり、眼の血流の研究に役立つ可能性があります。ただし、この方法は、哺乳類には有核赤血球がないため制限されます。したがって、有核赤血球を持つ種と比較して、血流増強超音波は哺乳類でのみ血流コントラストを生成します。さらに、この方法は呼吸運動などのモーションノイズに敏感で、ぼやけた画像やアーティファクトを作成する可能性があります。このモーションノイズは、プロスペクティブゲーティングまたはレトロスペクティブゲーティングによって調整できます。2Dと3Dの両方の取得では、不十分な麻酔や不安定なトランスデューサーのセットアップによる動物の動きによって引き起こされるモーションアーティファクトを制限することが重要です。この技術の開発により、有核赤血球を持つ脊椎動物の大多数において、眼の深部血管網の非侵襲的な in vivo 検査への道が開かれます。

Macouzet-Romero らによって提示された方法は、光コヒーレンストモグラフィー (OCT) - 血管造影法を使用して、黄斑灌流密度に対する網膜血管の相対的な寄与を評価します6。この方法は、拡張した血管からの循環がある領域の割合を特徴付けます。注目すべきことに、血管拡張は病理学的状態への反応である可能性があります。このアプローチは、糖尿病性網膜症 (DR)、中心静脈閉塞症、加齢黄斑変性症 (AMD) などの網膜血管疾患における血管拡張を間接的に概説し、低酸素化を間接的に特定できます。この方法を使用して、Macouzet-Romero ら 6 の主な発見は、網膜毛細血管よりも大きな血管が網膜循環に寄与するのが健康な被験者で 18.2% であったことでした。したがって、この割合は、網膜血管疾患による灌流密度の初期変化を特定するための参照として使用できます。たとえば、寄与率は動脈性高血圧症患者で 2.6%、糖尿病患者で 16.4% であり、この方法が血管異常に関連する網膜疾患の進行を評価するために使用できる可能性があることを示唆しています。

Subirada et al. によって提示された方法は、酸素誘発性網膜症 (OIR) や実験的糖尿病などの虚血性網膜症の実験モデルにおける血管変化のさまざまなパラメーター (毛細血管変性 [無血管領域]、病理学的網膜血管新生 [血管新生領域]、網膜細動脈の拡張およびねじれ) を評価します7.注目すべきは、OIR が未熟児網膜症と増殖性糖尿病性網膜症のいくつかの側面を再現することです。実験モデルで網膜血管新生 (RNV) または毛細血管変性の程度を定量化する能力は、根底にある分子および細胞メカニズムを研究するため、および薬理学的または分子的介入の可能な治療効果をテストするために重要です。要約すると、この記事では、臨床現場で考慮される最も関連性の高い血管パラメータのいくつかを定量化するための、古典的で確立された再現性のある技術を紹介します。

Vaglienti et al. ミュラーグリア細胞の活性酸素種 (ROS) レベルを測定する方法を紹介しています8.虚血性網膜症における網膜微小血管機能障害における酸化ストレスの役割が確立されており、活性酸素種 (ROS) が in vivo と in vitro の両方で BRB と RNV の分解にどの程度寄与するかを研究者に調査することが奨励されています 9,10,11,12 .2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテート(DCFD)を使用して、活性酸素種(ROS)の細胞内生成レベルを評価します。この方法は、DCFDを細胞内に拡散させ、ROSによってDCFDを2'、7'-ジクロロフルオレセイン(DCF)に酸化することに基づいています。DCFは蛍光性が高く、フローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡で検出できます。この方法は、網膜細胞と組織の両方におけるROS生成のレベルを画像化して測定できます。

Tomaszewskiらによる論文は、マウス網膜色素上皮(RPE)細胞の単離と増殖を示しています13。RPE 細胞は外側の BRB に寄与し、光受容体の止血と完全性に重要な役割を果たします。RPE 細胞機能不全は、AMD や DR を含むがこれらに限定されないさまざまな網膜疾患の特徴です。したがって、健康と疾患におけるRPE細胞機能の in vitro 研究は、いくつかの血管網膜疾患の分子的および細胞的メカニズムを理解するために重要です。この目的のために、一次RPE細胞単離は、さまざまな眼疾患の根底にあるメカニズムと病因を研究し、それらの疾患の新しい治療応用を提案するための重要なツールとなる可能性があります。この技術により、RPE 細胞の構造と機能の変化、およびそれらが AMD および DR の外側 BRB に及ぼす影響の研究が可能になります。さらに、この技術は、野生型 C57BL6 マウスおよびさまざまな遺伝子組み換えマウスから単離された RPE 細胞の変化を研究し、AMD14 の治療標的としてさまざまな薬理学的化合物をテストするために適用できます。

Elmasryらによる論文は、網膜外植片を長期間培養することにより、神経血管網膜疾患を研究するために使用できるex vivo実験モデルを提示しています15。このex vivoシステムでは、網膜外植片は、培養中で最大2週間、無傷の血管およびグリアネットワークおよび網膜ニューロンを示します。器官型網膜外植片は、DRや変性網膜疾患などの網膜疾患を研究するための信頼できるツールとして浮上しています16,17。他の既存の技術と比較して、網膜外植片の使用は、同じ生化学的パラメーターの下で、全身変数に関係なく、さまざまな網膜細胞(血管細胞、グリア細胞、神経細胞など)間のクロストークを調べることができる独自の機能を追加することにより、in vitro網膜細胞培養とin vivo動物モデルの両方をサポートします。外植片培養は、さまざまな網膜細胞を同じ環境で一緒に維持し、細胞間の物理的および分子的相互作用を保持します。さらに、研究により、網膜外植片は培養された網膜細胞の形態学的構造と機能を維持できることが示されています。要約すると、網膜外植片は、糖尿病性網膜症 (DR) や未熟児網膜症 (ROP) で観察されるものと同様に、高血糖や低酸素症などの生化学的変化に応答して、さまざまな網膜細胞間のクロストークを調査するための適切なプラットフォームを提供できます。このアプローチにより、制限された生化学的環境下での治療介入のテストも可能になります。網膜外植片培養は、制御可能な技術であり、非常に柔軟な実験モデルであり、多数の薬理学的操作を可能にし、網膜疾患のいくつかの分子メカニズムを明らかにすることができます。

参考文献

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  2. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  3. Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: Structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 133-148 (2011).
  4. Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: Basic concepts, clinical features and management. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (6), 622-647 (2008).
  5. Damsgaard, C., Lauridsen, H. Deep vascular imaging in the eye with flow-enhanced ultrasound. Journal of Visualized Experiments. (176), e62986(2021).
  6. Macouzet-Romero, F. J., Ochoa-Máynez, G. A., Pérez-García, O., Pérez-Aragón, B. J., Lima-Gómez, V. Evaluation of capillary and other vessel contribution to macular perfusion density measured with optical coherence tomography angiography. Journal of Visualized Experiments. (180), e63033(2022).
  7. Subirada, P. V., et al. Quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63126(2022).
  8. Vaglienti, M. V., Subirada, P. V., Barcelona, P. F., Bonacci, G., Sanchez, M. C. Quantification of reactive oxygen species using 2',7'-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in Müller glial cells. Journal of Visualized Experiments. (183), e63337(2022).
  9. Al-Shabrawey, M., et al. Inhibition of NAD(P)H oxidase activity blocks vascular endothelial growth factor overexpression and neovascularization during ischemic retinopathy. American Journal of Pathology. 167 (2), 599-607 (2005).
  10. Al-Shabrawey, M., et al. Role of NADPH oxidase in retinal vascular inflammation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (7), 3239-3244 (2008).
  11. Fukai, T., Ushio-Fukai, M. Cross-talk between NADPH oxidase and mitochondria: Role in ROS signaling and angiogenesis. Cells. 9 (8), 1849(2020).
  12. Ruan, Y., et al. Oxidative stress and vascular dysfunction in the retina: Therapeutic strategies. Antioxidants. 9 (8), 761(2020).
  13. Tomaszewsk, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells. Journal of Visualized Experiments. (189), e63543(2022).
  14. Samra, Y. A., et al. Implication of N-methyl-d-aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356(2021).
  15. Elmasry, K., Moustafa, M., Al-Shabrawey, M. Retinal explant of the adult mouse retina as an ex vivo model for studying retinal neurovascular diseases. Journal of Visualized Experiments. (190), e63966(2022).
  16. Lecleire-Collet, A., et al. Advanced glycation end products can induce glial reaction and neuronal degeneration in retinal explants. British Journal of Ophthalmology. 89 (12), 1631-1633 (2005).
  17. Wang, Y., et al. E2f1 mediates high glucose-induced neuronal death in cultured mouse retinal explants. Cell Cycle. 16 (19), 1824-1834 (2017).

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