方法論記事

筋骨格研究:現在の方法と革新的なアプローチ

DOI：

10.3791/65009

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2023年3月3日

1Center for Orthopaedic Research and Translational Science (CORTS), The Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, The Pennsylvania State University College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University College of Medicine, 4Center for RNA Molecular Biology, Pennsylvania State University

この記事について

要約

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議論された記事:

Lee J. I., Govindappa, P. K., Wandling, G. D., Elfar, J. C. マウスの外傷性末梢神経損傷.視覚化された実験のジャーナル。(181)、E63551(2022年)。

Dunning, L., McCulloch, K., Lockhart, J. C., Goodyear, C. S., Huesa, C. 内側半月板および軟骨引っかきマウスモデルの加速変形性関節症の不安定化.視覚化された実験のジャーナル。(185)、E64159(2022年)。

Jagadeeshaprasad, M. G., Govindappa, P. K., Nelson, A. M., Elfar, J. C. ヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞の分離、培養、および特性評価。視覚化された実験のジャーナル。(181)、E63776(2022)。

Hain, B. A., Waning, D. L. プラスミドDNAのマウス骨格筋へのエレクトロポレーション.視覚化された実験のジャーナル。(182)、E63916(2022)。

Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. マイクロコンピュータ断層撮影法を用いた骨折治癒の評価.視覚化された実験のジャーナル。(190). e64262 (2022).

編集記事

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筋骨格系疾患は何百万人もの人々を苦しめており、世界中で障害の主な原因となっています1.それにもかかわらず、筋骨格系疾患は、他の一般的な慢性疾患(がんや糖尿病など)と比較して十分に研究されておらず、あまりよく理解されていません。さらに、筋骨格系疾患に関連する障害の有病率は増加すると予測されており、筋骨格系疾患の発症と進行を支える分子メカニズムと細胞経路を調査する研究の重要性が強調されています。したがって、分子レベルで筋骨格系疾患をより深く理解し、革新的な治療法の開発を促進する方法論の必要性が高まっています。

末梢神経損傷は外傷症例の ~3% に関連しており、整形外科的外傷患者の罹患率の一般的な原因です2。しかし、神経機能を救い、外傷性末梢神経損傷 (TPNI) に関連する筋萎縮を逆転させる正確な治療法は、とらえどころのないままです3。したがって、マウスモデルでの研究は、治験中の TPNI 治療の有効性を評価するのに役立ちます。しかし、この分野には、信頼性の高い機能回復測定や神経再生の特徴付けを可能にする予測可能な神経切断動物モデルが不足しています。このメソッド コレクションに含まれる研究では、Lee らは、固定された損傷パターンを保証し、機能回復の測定を容易にする TPNI モデルについて説明しています4。一般に、TPNI 後の機能回復は損傷の重症度に依存し、Lee ら 4 によって説明されたプロトコルの主な利点は、神経破砕手術中の圧力変化をリアルタイムで監視する校正済みデジタル デバイスの使用です。これにより、誘発された損傷の重症度の変動が制限され、その後の回復が制限されます。

変形性関節症 (OA) は、高齢者の下肢に影響を与える障害の主な原因であり、したがって、主要な社会的および経済的負担を構成します5。外傷後OAの内側半月板(DMM)モデルの広く使用されている不安定化など、OA発症の段階を模倣したマウスモデルが存在します6,7。Dunningらによる論文は、DMMモデルの修正版であり、軟骨表面に3つの傷を導入することにより軟骨にさらなる損傷を与えることを含みます8。DCS モデルは OA の加速モデルを表し、OA の初期段階における骨棘形成、滑膜炎症、骨リモデリング、および疼痛測定に焦点を当てた研究に適しています。このモデルは、関節鏡視下手術やその他の臨床介入中に軟骨に直接与えられた損傷も要約しています。

マウスでは実行不可能ないくつかの機構研究を培養細胞で実行できるため、in vivo研究を補完するin vitro実験の重要性が強調されています。初代細胞は、安定した細胞株よりも内因性のin vivo条件をより忠実に再現するため、重要な研究ツールです。したがって、この分野の研究を進めるには、さまざまな筋骨格組織から生存初代細胞の単離を容易にするプロトコルの開発が不可欠です。Jagadeeshaprasadらによる論文は、ケラチノサイト、線維芽細胞、シュワン細胞(SC)の3種類の初代細胞を同時に単離するために、ヒト新生児包皮の酵素的および機械的消化の方法論を詳述しています9。皮膚からの SC の単離は、このプロトコルがケラチノサイトと線維芽細胞を単離するための確立されたプロトコルに導入する大きな進歩を表しています。このプロトコルは、ケラチノサイトと線維芽細胞の恒常性と機能の調節におけるSCの潜在的な役割を調査する研究に不可欠な、3つの細胞型の共培養を容易にします。

過剰発現とノックダウンは、遺伝子機能を研究するために一般的に使用されるアプローチです。これらの実験は、 in vitroでの細胞培養で簡単かつ日常的に実施されますが、プラスミドDNAまたは低分子干渉RNAを標的細胞/組織に効率的に送達することが課題であるため、 in vivoで 遺伝子発現を操作することはより困難です。HainとWaningは、DNAプラスミドをマウス骨格筋にエレクトロポレートして、筋線維10でコードされたタンパク質を過剰発現させる簡単なプロトコルを説明しています。骨格筋に DNA プラスミドを注入またはエレクトロポレーションするための既存のプロトコルの主な欠点は、これらの手順が筋肉の収縮性に悪影響を与えることです。Hain と Waning10 によって導入されたプロトコルは、骨格筋の収縮性を損なわないため、この制限に対処し、さまざまなタンパク質発現の機能的結果として筋肉の収縮性を評価できます。

マイクロコンピューター断層撮影法 (μCT) は、骨11 の 3 次元 (3D) 構造を評価するために一般的に使用される画像診断法です。μCT は、臨床におけるヒト骨イメージングのゴールド スタンダードであり、前臨床研究における骨構造と骨再生の評価に非常に広く使用されています12。μCTは、本質的にX線とのコントラストに優れた石灰化骨から得られるX線画像を多数含みます。骨折治癒過程での骨形成を評価するために使用すると、μCT は治癒カルスの 3D 構造と密度に関する詳細な情報を提供します。μCT を使用した無傷の骨の定量は十分に確立されていますが、骨折カルスを評価するための μCT プロトコルについてはコンセンサスがありません。Wee et al. 骨折治癒のさまざまな段階で骨折カルスを正確に評価するための標準化された段階的なプロトコルを提供します13。このプロトコルは、画像の視覚化、再調整、カルスセグメンテーションを可能にする最先端の分析プラットフォームを利用しています。この貢献は、現場全体で骨折カルス分析のためのより標準化された一貫したアプローチを確立するのに役立ちます。

要約すると、この方法コレクションは、骨、軟骨、末梢神経、骨格筋、皮膚など、幅広い筋骨格組織で使用される実験プロトコルを提示します。このコレクションが、急成長している筋骨格系研究分野の専門家だけでなく、初心者にとっても役立つことを願っています。この分野の将来は、新しい研究方法論の開発を目指す継続的な努力によって大きく強化されるでしょう。筋骨格系疾患の新しいマウスモデルを確立し、筋骨格系組織への治療薬の局所的および標的を絞った送達のための革新的なアプローチを開発する取り組みは特に価値があります。

開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この作業は、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01 DK121327によって支援されました。

参考文献

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  1. Liu, S., et al. Global burden of musculoskeletal disorders and attributable factors in 204 countries and territories: A secondary analysis of the Global Burden of Disease 2019 study. BMJ Open. 12 (6), 062183(2022).
  2. Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23 (6), 863-873 (2000).
  3. Faroni, A., Mobasseri, S. A., Kingham, P. J., Reid, A. J. Peripheral nerve regeneration: Experimental strategies and future perspectives. Advanced Drug Delivery Reviews. 82-83, 160-167 (2015).
  4. Lee, J. I., Govindappa, P. K., Wandling, G. D., Elfar, J. C. Traumatic peripheral nerve injury in mice. Journal of Visualized Experiments. (181), e63551(2022).
  5. Katz, J. N., Arant, K. R., Loeser, R. F. Diagnosis and treatment of hip and knee osteoarthritis: A review. Journal of the American Medical Association. 325 (6), 568-578 (2021).
  6. Pinamont, W. J., et al. Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model. Journal of Visualized Experiments. (159), e60991(2020).
  7. Carlson, E. L., et al. Paroxetine-mediated GRK2 inhibition is a disease-modifying treatment for osteoarthritis. Sci Transl Med. 13 (580), 8491(2021).
  8. Dunning, L., McCulloch, K., Lockhart, J. C., Goodyear, C. S., Huesa, C. Destabilization of the medial meniscus and cartilage scratch murine model of accelerated osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (185), e64159(2022).
  9. Jagadeeshaprasad, M. G., Govindappa, P. K., Nelson, A. M., Elfar, J. C. Isolation, culture, and characterization of primary Schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin. Journal of Visualized Experiments. (181), e63776(2022).
  10. Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of plasmid DNA into mouse skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (182), e63916(2022).
  11. Muller, R., et al. Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed. Bone. 23 (1), 59-66 (1998).
  12. Christiansen, B. A. Effect of micro-computed tomography voxel size and segmentation method on trabecular bone microstructure measures in mice. Bone Reports. 5, 136-140 (2016).
  13. Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. Assessment of bone fracture healing using micro-computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (190), e64262(2022).

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