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動物は、数十の異なる組織や器官に組織化された数百の異なる細胞型で構成される非常に複雑なシステムです。胚発生中に細胞群が互いにどのように相互作用するか、またその環境とどのように相互作用するかを研究することで、成人の体がどのように構築されているかをより深く理解できるだけでなく、病気や先天性欠損症の分子的および細胞的基盤を明らかにすることもできます。特定のモデルシステムは、他のモデルシステムよりも特定の生物学的問題に対処するのに適しており、科学者は生物生物学の多様性を完全に調査するために、さまざまな種と実験技術を採用しています。たとえば、特定の発生生物学実験には、遺伝子工学、動物解剖、分子生物学、生化学、および高解像度顕微鏡法が含まれる場合があります。このような方法は、書面による説明や図だけで再現することは困難な場合があるため、適切な技術と分析方法の普及を促進するために、それらをビデオ形式で文書化することが重要です。
特に神経系における発達メカニズムと再生の関係は強い関心分野であり、ゼブラフィッシュである ダニオレリオは、その生涯にわたる成長と再生能力により、この分野の重要なモデルとなっています。特に、網膜の細胞と視神経蓋の間には複雑な相互作用があり、この相互作用は、新しいニューロンが目と脳に追加されるときに適切な接続を確立するために必要です1。Hagenらは、生きたゼブラフィッシュ胚の眼摘出後の除神経によって神経の成長と発達がどのように影響を受けるかを特徴付けるための技術を説明しています2。彼らは、1)摘眼手術を行う方法、2)手術後の幼虫を培養する方法、3)脳サンプルを固定、解剖、保存する方法、4)免疫蛍光を実行する方法、および5)サンプルを適切にマウントして画像化する方法を詳細に説明しています。この技術は、固定組織におけるさまざまな神経発達プロセスを研究するために使用でき、生きた胚での実験用に変更することもできます。
神経堤細胞(NCC)は、色素細胞、軟骨、骨、平滑筋、ニューロン、およびグリアを生じさせる重要な発生系統を表し、これらの細胞は多くの種類の先天性欠損症に関与しています3。NCCは、その印象的な多能性に加えて、発生中に上皮から間葉への移行とそれに続く広範な移動も経験するため、細胞の運命と形態の相互作用を理解するための魅力的なパラダイムになります4。ニワトリ胚は、NCCをin vivo で視覚化し、 ex vivoで培養できるため、他のシステムでは困難な多くの種類の分子処理を可能にするため、NCC生物学を研究するための強力なシステムです。Jacques-Frickeらは、頭蓋神経ひだを培養してフィブロネクチンでコーティングされたカバーガラス上に初代NCC培養物を生成するための柔軟な方法を説明し、その後、固定イメージングまたはライブイメージング実験を行うことができます5。彼らは、1)胚をインキュベートして単離する方法、2)神経ひだを解剖してプレート化する方法、3)NCCを固定して染色する方法、および4)NCC形態を定量化して分析する方法を説明しています。
基底膜(上皮細胞の基底表面に沿って生成される細胞外マトリックス)は、動物全体の組織形態と臓器機能の確立に重要です6。形成卵を取り囲むショ ウジョウバエ 濾胞上皮は、基底膜7の主要な保存成分をすべて分泌し、マトリックスが卵室の「外側」に向けられているため、基底膜がどのように形成されるかを研究するための優れたモデルであり、顕微鏡ベースの分析を容易にします8。ShahとDevergneは、最も一般的なタイプの超解像顕微鏡の1つであるAiryscanを使用して、小胞輸送が基底膜形成にどのように影響するかを調べることを説明しています9。彼らは、1)ショ ウジョウバエ の卵巣を収集して固定する方法、2)免疫蛍光を実行する方法、3)サンプルを適切にマウントする方法、および4)3次元分析用の高品質の超解像データセットをキャプチャする方法を示しています。この記事には、不飽和の3次元共焦点データセットの適切な取得に関する非常に有用で簡潔なチュートリアルが含まれており、蛍光画像を定量化したい人にとって一般的な関心事であるはずです。
顕微鏡ベースの超解像技術(STED、SIM、Airyscanなど)10 はますます一般的になってきていますが、標準的な共焦点顕微鏡よりも高価であり、すべての研究者が利用できるわけではありません。超解像画像を取得するための代替技術は、膨張顕微鏡(ExM)であり、これは、生体サンプルを膨潤可能なヒドロゲル11に埋め込んで結合することにより、生体サンプルを3次元で物理的に拡大することを含みます。次に、拡張されたサンプルを標準的な共焦点顕微鏡を使用して視覚化し、他のタイプの超解像顕微鏡に匹敵する数十ナノメートルオーダーの横方向の解像度で画像を生成できます12。私たちのグループは、標準的な共焦点顕微鏡では検出できないアクトミオシン細胞骨格およびミトコンドリアネットワークの細胞内特徴を明らかにするために、全マウントショ ウジョウバエ 胚にExMを実装する方法を説明しています13。1)適切にステージングされた胚を選択する方法、2)免疫蛍光を実行する方法、3)増殖のために胚を準備してマウントする方法、3)胚を消化して増殖する方法、および4)超解像データセットを収集する方法について説明します。この技術は、1 mm オーダーの幅広い生体標本に対して変更可能であり、幅広い生物学研究室で利用できるようにする必要があります。
発生生物学は、必然的に、動物で発生する細胞生物学を定量化するために、さまざまな科学分野の技術を利用する、非常に独創的で学際的な分野です。ここでは、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ショウジョウバエの4つの発生生物学的方法に焦点を当て、動物の発生中の細胞形態と細胞内タンパク質の局在を調査するための古典的および最先端の技術の両方を特徴としています。現在、この分野は、細胞の形態と挙動の定量的分析をトランスクリプトームおよびプロテオミクス実験と融合させて、動物の発育を制御する分子と生体力学的力の多様性を完全に明らかにすることに焦点を当てています。