方法論記事

定量質量分析を推進する最先端技術

DOI：

10.3791/65012

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2023年3月3日

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

この記事について

要約

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議論された記事:

Correa, C. N., Fiametti, L. O., Esquinca M. E. M., de Castro, L. M. ペプチドミクス研究のためのアミンの還元的メチル化を用いたサンプル調製と相対定量.視覚化された実験のジャーナル。(177)、DOI:10.3791/62971(2021年)。

Vanderwall, D. et al. JUMPn: プロテオミクスにおけるタンパク質共発現クラスタリングとネットワーク解析のための合理化されたアプリケーション。視覚化された実験のジャーナル。(176)、DOI:10.3791/62796 (2021年)。

Qiu, D., Eisenbeis, V. B., Saiardi, A., Jessen, H. J. キャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化質量分析によるイノシトールピロリン酸の絶対定量.視覚化された実験のジャーナル。(174)、DOI:10.3791/62847(2021年)。

Smolen, K. A., Kettenbach, A. N.リン酸化タンパク質ホスファターゼとその相互作用因子を同定するための質量分析ベースのアプローチ。視覚化された実験のジャーナル。(182)、DOI:10.3791/63805 (2022年)。

編集記事

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プロテオミクスのアプローチには、特定の細胞状態に存在するペプチド、タンパク質、特定の翻訳後修飾(PTM)、および特定の細胞小器官または高分子タンパク質複合体に集まるタンパク質の検出と定量が含まれます。プロテオミクスは、一般的なワークフローと定量的なワークフローに分割できる多様な分野です。定量的プロテオミクスは、サンプル中のタンパク質またはタンパク質PTMの量を決定することに焦点を当てています。プロテオミクス実験を行う前に、生物学的な質問に答えるために必要な最も適切なサンプル調製、シーケンス、およびデータ分析方法を決定する必要があります。タンパク質は非常に動的であり、質量分析計は、存在量の少ないPTMよりも存在量の高いタンパク質のシーケンスに敏感です。したがって、サンプル前処理とシーケンシングのワークフローの選択が重要です。このメソッドコレクションでは、最先端のMSメソッドを使用して特定の種類のタンパク質を定量するアプローチを説明し、タンパク質ネットワークのデータ解析ワークフローを提供します。

ペプチドミクスは、正常な細胞プロセス中および疾患条件下で自然に生成されるペプチドの研究であり、このアプローチは、液体クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせた質量分析とペプチド抽出プロセスが現在の状態に進むまで、歴史的に抗体ベースの定量に限定されていました1。これらの進歩は、内因性プロテアーゼの熱不活化の応用とともに、現在では数百の細胞内ペプチドの同定と定量を可能にします。Correa et al.2では、著者らは、熱不活化、ペプチド結合を保存するための穏やかな条件下でのペプチド抽出、およびアミンの安定同位体標識による相対定量を含むサンプル調製ワークフローについて説明しています。著者らは、細胞培養および組織標本からの天然および生物学的に活性なペプチドの同定と定量を可能にする安価なアプローチを開発しました。このアプローチは、疾患特異的ペプチドバイオマーカー、抗菌ペプチド、または将来の治療法開発のための標的を発見するために使用できます。

質量分析およびバイオインフォマティクスのアプローチの進歩により、さまざまな生体材料源からのプロテオームの詳細な特性評価が可能になりました3。これらの複雑なサンプルのプロテオミクス発現パターンから生物学的重要性を解読することは、この分野で依然として重要な課題です。この課題に対処するために、Vanderwallらは、プロテオミクスデータをタンパク質共発現クラスターと関連するタンパク質間相互作用(PPI)ネットワークノードを接続するモジュール(すなわち、タンパク質複合体)にプロテオミクスデータを整理するシステム生物学プログラムであるJUMPnとそれに関連するワークフローを導入します4。著者らは、既存のプロテオミクスデータセットとシミュレートされたデータを使用してこのツールの有効性を評価し、複雑なプロテオームデータセットの生物学的解釈を促進するための有用性を示しています。その結果は、このアプローチが転写因子とキナーゼカスケード活性化の測定に使用できることを示しており、ヒト疾患のドライバーを特定するための有用性や、深いプロテオームデータから生物学的メカニズムを決定しようとする他の研究に有用であることが実証されています。

イノシトールピロリン酸塩(PP-InsPs)は、すべての真核細胞に見られ、代謝シグナル伝達分子として機能し、多様なプロセスを調節します5。歴史的に、PP-InsPの物理的特性と存在量が少ないため、分析は高価で特別な注意と保管を必要とする放射性トレーサーの使用に限定されてきました。別の方法として、Qiuらは、キャピラリー電気泳動結合エレクトロスプレーイオン化質量分析(CE-ESI-MS)6によって、細胞培養または組織ソース材料からのイノシトールピロリン酸のハイスループットの絶対定量を可能にするプロトコルを開発しました。彼らのレポートでは、このアプローチを使用して、標本に存在するすべてのPP-InsPをプロファイリングし、種を分離し、位置異性体を特定して、さまざまな条件や病態下での空間的および時間的変化を特定する方法を示しています。

細胞プロセスの大部分はタンパク質リン酸化によって制御されており、これらのシグナル伝達経路のエラーは多くの異なる疾患状態に関連しています7。しかし、さまざまな細胞型およびさまざまな条件下でプロテインホスファターゼとキナーゼを調節する完全なメカニズムを理解するには、まだ大きなギャップがあります。これらの理解のギャップに対処するために、Smolenらは、質量分析(PIB-MS)8と組み合わせたホスファターゼ阻害剤ビーズを利用した新しいワークフローを導入しています。著者らは、非選択的リンタンパク質ホスファターゼ阻害剤であるミクロシスチン-LRと共役トセファロースビーズを使用して、これらの標的タンパク質を濃縮することができます。さらに、穏やかな洗浄条件を使用して非特異的な封じ込めを除去することにより、タンパク質相互作用器を捕捉することもできました。彼らは、このアプローチを使用して、リンタンパク質ホスファターゼ、それらのリン酸化状態、および細胞培養と組織の両方における潜在的なタンパク質間相互作用を同定および定量する方法を示しています。

内因性ペプチドの定量化戦略、ホスファターゼとキナーゼの濃縮、タンパク質相互作用、イノシトールピロリン酸などのサンプル前処理方法の進歩により、生物学的プロセスにおけるタンパク質ダイナミクスの知識ベースが拡大しています。データ依存の取り込みとは対照的に、データに依存しない取り込みなどの質量分析計の進歩により、データ収集中に存在量の多いペプチドが存在量の少ないペプチドを隠さないようにペプチドを同定するためのシーケンシング能力の深さが向上し、他のクラスのタンパク質を同定できるようになります。timsTOF質量分析計は、液体クロマトグラフィーに加えてイオンモビリティーをペプチドの分離として組み込んで、さらに深いシーケンシングを可能にし、このコレクションで説明されているサンプル前処理戦略からペプチドを検出する可能性を高めることで、未来を前進させるのに役立ちます。プロテオミクスの分野は、生物学的複雑さと機能を理解するための新しいサンプル調製方法論、データ取得用質量分析計の進歩、JUMPnなどのバイオインフォマティクス分析ツールに基づいて前進し続けます。

開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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著者は、国立衛生研究所/国立総合医科学研究所(NIH/NIGMS)の助成金P20GM121293とR24GM137786、および国立科学財団賞No.OIA-1946391。

参考文献

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  1. Foreman, R. E., George, A. L., Reimann, F., Gribble, F. M., Kay, R. G. Peptidomics: A review of clinical applications and methodologies. Journal of Proteome Research. 20 (8), 3782-3797 (2021).
  2. Correa, C. N., Fiametti, L. O., Esquinca, M. E. M., de Castro, L. M. Sample preparation and relative quantitation using reductive methylation of amines for peptidomics studies. Journal of Visualized Experiments. (177), e62971(2021).
  3. Noor, Z., Ahn, S. B., Baker, M. S., Ranganathan, S., Mohamedali, A. Mass spectrometry–based protein identification in proteomics—a review. Briefings in Bioinformatics. 22 (2), 1620-1638 (2021).
  4. Vanderwall, D., et al. JUMPn: A streamlined application for protein co-expression clustering and network analysis in proteomics. Journal of Visualized Experiments. (176), e62796(2021).
  5. Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism. Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).
  6. Qiu, D., Eisenbeis, V. B., Saiardi, A., Jessen, H. J. Absolute quantitation of inositol pyrophosphates by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62847(2021).
  7. Chen, M. J., Dixon, J. E., Manning, G. Genomics and evolution of protein phosphatases. Science Signaling. 10 (474), (2017).
  8. Smolen, K. A., Kettenbach, A. N. A mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors. Journal of Visualized Experiments. (182), e63805(2022).

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ProteomicsPeptidomicsSample PreparationReductive MethylationProtein Co expressionNetwork AnalysisAbsolute QuantitationCapillary ElectrophoresisElectrospray IonizationPhosphoprotein PhosphatasesMass Spectrometry based Approach

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