in vitro および in vivo モデルを用いた細胞外小胞媒介血管石灰化の解析

Summary

本論文では、マウス大動脈を単離し、石灰化した細胞外小胞を抽出して石灰化の可能性を観察することにより、血管石灰化を取得および評価するための方法論を提示します。

Abstract

心血管疾患は世界の主要な死因であり、血管石灰化は心血管イベントの最も重要な予測因子です。しかし、現在、血管石灰化の治療または治療の選択肢はありません。石灰化は、カルシウムイオンとリン酸イオンを凝集させることによって核形成病巣として機能する特殊な細胞外小胞(EV)内で始まります。このプロトコルでは、マウス大動脈の石灰化を取得および評価し、関連する抽出されたEVを分析する方法について説明します。まず、マウスの肉眼的解剖を行い、腎臓、肝臓、肺などの関連臓器を採取します。次に、マウス大動脈を単離し、大動脈根から大腿動脈まで切除します。次に、2〜3個の大動脈をプールして消化液中でインキュベートした後、超遠心分離を受けて目的のEVを分離します。次に、EVの石灰化ポテンシャルは、高リン酸塩溶液中でインキュベートし、波長340nmの光吸光度を測定することによって決定されます。最後に、コラーゲンヒドロゲルを使用して、EVによって生成された石灰化したミネラルの形成と成熟を in vitroで観察します。

Introduction

石灰化は、心血管疾患の死亡率と罹患率の最も重要な予測因子です¹。石灰化は、カルシウムとリン酸ミネラルの蓄積により動脈壁の力学を変化させます²。アテローム性動脈硬化症では、石灰化は局所的なストレスを悪化させ、心臓発作の主な原因であるプラーク破裂を引き起こす可能性があります。多くの場合、慢性腎臓病に起因する内側石灰化はより広範囲に及んでおり、重大な動脈硬化、機能障害、および心臓過負荷を引き起こします^2,3。現在、血管石灰化の治療または予防のための治療選択肢はない。

血管平滑筋細胞(VSMC)は、骨芽細胞様表現型を採用し、新生ミネラルを核とする石灰化細胞外小胞(EV)を放出し、石灰化を促進します^4,5,6。このプロセスは、骨⁷の骨芽細胞の生理学的石灰化に似ています。石灰化のエンドポイントは血管壁と骨基質で類似しているが、石灰化EVが発生するメカニズムは2つの組織で異なる⁸。血管石灰化の研究に使用されるモデルには多くの種類があります。in vitroでは、細胞培養モデルは、VSMCの骨形成移行とそれに続く特殊な培地によるミネラル形成を模倣しています。

in vivo石灰化を研究する場合、使用されるモデルは研究されている石灰化の種類によって異なります。高脂血症マウスモデルは、アテローム硬化性石灰化の研究によく使用され、これは脂質が豊富なプラーク内でより焦点が当てられているようです⁹。対照的に、内側石灰化は血管系全体でより広範囲に及んでおり、腎不全を誘発するためにアデニンが豊富な食事療法を採用する慢性腎臓病モデルまたは腎臓のかなりの部分を除去する外科的技術を使用して研究される^{ことがよくあります10,11}。血管石灰化の攻撃的なモデルは、高脂血症モデルと慢性腎臓病モデルの両方の組み合わせを使用しています¹²。このプロトコルは、内側およびアテローム硬化性石灰化の両方についてマウス大動脈の血管石灰化を評価し、大動脈壁からEVを抽出し、in vitro細胞培養モデルから得られたEVの石灰化の可能性を観察する方法を提供します。将来の研究では、血管石灰化の機構分析にこれらの手順を使用し、潜在的な治療介入を評価することができます。

Protocol

in vivoでの作業は、フロリダ国際大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認および監督され、現在の国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに準拠していました。このプロトコルでは、手順はマウスの系統、体重、年齢、および性別によって異ならない。研究されている石灰化の種類、食事、および治療は、研究の長さと使用されるマウスの体重を変える可能性があり、研究で使用されるマウスの特定の系統と性別に依存する可能性があります。このプロトコルでは、雄と雌の両方のC57BL / 6Jマウスを使用し、石灰化食を与えました。マウスを20週齢から24週齢の間に屠殺した。

1.大動脈の単離と切除

1. 蛍光マーカー
   1. 安楽死の48時間前に、蛍光イメージング剤である20 μMのOsteoSense 680を、静脈内注射 により 25 gあたり100 μLの推奨用量でマウスに注射します。
   2. ヒュームフードの下に、4つのTピンが付いた発泡スチロールボード、ペーパータオルで裏打ちされたバケツ、ペーパータオルを詰めた50 mLチューブ、1.5 mLマイクロ遠心チューブ、解剖ツール( 材料表を参照)、およびエタノールをスプレーボトルに入れます。PBSを入れたビーカーを氷の上に置きます。
2. 採血
   1. ペーパータオルを詰めた50 mLのコニカルチューブに2 mLのイソフルランを加えます。チューブをバケツに入れ、蓋で閉じます。
      注意:イソフルランは、短期間の暴露の毒性のために排気の再循環のない換気の良い空間で取り扱う必要があります。.
   2. 一度に1匹のマウスをバケットに移します。鎮静したら、マウスを背側のペーパータオルの上に置きます。利き手でない手のひらでマウスを持ち、親指と人差し指を使って耳を元に戻します。
   3. ピンセットを使用して、片方の目を切除します。マウスを1.5 mLチューブの上に保持して採血を開始し、その間に1 mLの血液を採取する必要があります。血液の排出が止まったら、マウスをバケツに戻し、さらに鎮静させます。
3. 安楽死
   1. 解剖マットの上にペーパータオルを置きます。マウスが鎮静されたら、マウスを仰臥位でマットの上に置きます。Tピンを使用してマウスを仰臥位に固定し、各手足を押さえます。
   2. マウスの腹部にアルコールをスプレーします。ピンセットを使用して、胸部の皮膚を持ち上げます。はさみで、胸腔の内側線を切り落とします。胸骨が中央で切断されたら、胸郭の両側にある横隔膜を切断します。
   3. 必要に応じて、胸郭の前部を切り取り、心臓と肺を露出させます。
4. 臓器摘出
   1. ピンセットを使用して、皮膚を持ち上げ、正中線を切開します。余分な皮膚や脂肪を取り除きます。生殖器官と膀胱、および正中線の外側の脂肪を取り除きます。
   2. 胃腸(GI)器官を右側に移動し、正中線の腸に従います。見つかったら、正中線を持ち上げ、消化管を胃まで切除します。
   3. 腎臓を正中線から持ち上げて切除します。できるだけ腎臓の近くで切ります。
   4. 次に、葉を持ち上げて正中線から切り離すことによって肝臓の除去を開始します。
   5. 心臓と大動脈を灌流します。10 mLシリンジを使用して、冷たいPBSを右心室に注入します。肺が膨らんで白くなるのを待ちます。肺、および余分な横隔膜または胸郭を取り除きます。
5. 骨の除去
   1. はさみを大きく開き、尾の上のマウスの下部領域に置きます。下向きに切り、背骨を皮膚から持ち上げ始めます。正中線の側面から脂肪を取り除きます。皮膚が剥離したら、心臓の真上を切って脊椎と無傷の臓器を切除します。ステレオスコープに輸送する場合は、背骨と無傷の臓器をアイスバケットのPBSのビーカーに入れます。
   2. 背骨と臓器を解剖皿に移します。氷のように冷たいPBSを入れます。針を使って背骨と胸郭を固定します。
   3. 解剖顕微鏡で、ピンセットを使用して心臓を注意深く持ち上げ、脊椎の上と大動脈の下を切断し始めます。背骨の下部に達するまでこれを続けます。解剖皿から背骨を取り除き、心臓と無関係な脂肪や筋肉を固定します。
6. マイクロダイセクション
   1. 心臓の真下の領域から始めて、食道、大静脈、大動脈の3つの管状構造を特定します。食道と大静脈を取り除き、大動脈の明確な視野を作ります。
   2. マイクロダイセクション鉗子とはさみを使用して、脂肪組織を持ち上げ、大動脈のできるだけ近くで切断を開始します。大動脈を切らないように注意してください。すべての大動脈と大腿動脈が露出するまで、これを内側線に沿って続けます。
   3. 心臓で、すべての脂肪組織を取り除き、大動脈弓の3つの枝を露出させます。左心室にマイクロダイセクションはさみを挿入し、大動脈周囲の筋肉を切断することにより、左心室から大動脈根を取り除きます。
   4. 大動脈を分離して洗浄したら、近赤外線スキャナーを使用して大動脈を画像化し、血管石灰化を視覚化します。
   5. カスタムMATLABスクリプト(補足ファイル1)を使用して、スキャンされた大動脈領域の合計に正規化されたカルシウムトレーサーの総信号を定量化します。MATLAB スクリプトは、バイオインフォマティクス ツールボックス アドインを使用して機能します。MATLABは、最初に大動脈の近赤外線スキャンからTIFFファイルの場所に送られ、次に個々のファイルが開かれ、ピクセル強度値がTIFFファイルから抽出されます。
      1. 画像がカラーマップでユーザーに提示されたら、石灰化が最も大きい大動脈を最大スケールとして選択します。
      2. MATLABがコマンドウィンドウで「画像内の標本はいくつありますか?」と尋ねられたら、現在の画像にある大動脈の数を入力し、各大動脈を1つずつ選択します。大動脈が選択されると、MATLABは大動脈の総面積のマスクを持つバイナリ画像と、大動脈の石灰化領域のマスクを持つ別のバイナリ画像を作成します。次に、これらのマスクされた画像の値を使用して、石灰化領域の合計、大動脈の総面積、石灰化に陽性のパーセンテージ領域、および石灰化領域の平均強度を決定します。
      3. 大動脈を選択するには、左クリックで4つの角を選択し、画像の周囲にボックスを作成して、画面上の最新の図の関心のある大動脈の周りにボックスを作成します。ボックスを閉じるには、最初のコーナーをダブルクリックします。
         注意: しきい値は、使用する石灰化のモデルによって異なる場合があります。どの値が血管石灰化の正のシグナルを決定するかを決定するのはユーザーの責任です。実験のしきい値が設定されたら、実験の期間中ずっと同じままである必要があります。
   6. 定量的データが抽出されたら、Tukeyの事後検定を使用して一元配置分散分析を実行し、グループ間の有意性を示します。

2. 大動脈からのEVの分離と抽出

注:大動脈を分離して除去したら、組織からEVを抽出することができます。消化液と複数の遠心分離サイクルを使用して、EVを収集し、石灰化アッセイ、ゲル電気泳動、イムノブロッティングなど、さまざまな技術に使用できます¹³。EVを分離および抽出するためのプロトコルは次のとおりです。

1. 大動脈をスキャンした直後に、2〜3個の大動脈をプールして十分なタンパク質濃度を得る。
2. 0.25 Mショ糖、0.12 M塩化ナトリウム(NaCl)、0.01 M塩化カリウム(KCl)、0.02 Mトリス塩酸塩、および600 U/mLコラゲナーゼ¹³を含む消化液を調製します。
3. 2〜3個のプール大動脈を1.5 mLの消化液中で37°Cで2時間インキュベートします。 ソリューションを収集します。溶液を1,000 × g で15分間遠心分離し、細胞破片を除去します。
4. 上清を33,000 × g でさらに30分間遠心分離し、微小胞を除去します。石灰化の可能性について上清を収集して評価します(セクション3を参照)。
   注:EVのゲル電気泳動とタンパク質イムノブロッティングを実行する場合は、次の手順に従ってください。
5. 上清を100,000 × g で1時間超遠心分離し、目的のEVを分離します。
6. 上清が超遠心分離を受けている間に、プロテアーゼ阻害剤を添加し、溶解するまでボルテックスすることにより、RIPA溶解および抽出バッファー( 材料表を参照)を調製します。
7. 超遠心分離が完了したら、上清を吸引し、EVを含むペレットを残します。調製したRIPA溶解およびプロテアーゼ阻害剤混合物中にペレットを懸濁する。サンプルは、ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングの準備ができています。

3. 光散乱吸光度による細胞外小胞の石灰化能の評価

注:EVのミネラル形成をリアルタイムで測定するために、細胞培養からの成長板軟骨EVからのミネラル形成を研究するために独自に開発されたアッセイを使用し^ました14。リン酸カルシウム沈着は石灰化の特徴であるため、リン酸カルシウム化合物形成の結果としての光散乱吸光度の増加は、石灰化電位¹⁴の指標となる。 インビトロ VSMCモデルは、EVの石灰化電位を測定するのに便利です。この技術では、短波長フィルタを備えたプレートリーダーは、EVの in vitro 石灰化を定量化することができます。吸光度の読み取り値は340 nmで記録され、吸光度が高いほどリン酸カルシウムのミネラル形成が多いことを示しています。光散乱吸光度アッセイのプロトコルは次のとおりです。

1. VSMCsの馴化回収培地を1,000 × g で5分間遠心分離し、細胞残渣¹⁴を除去した。
2. 上清を33,000 × g で30分間遠心分離し、上清を回収して新しいチューブに移します。
   注:収集された上清中のEVの存在は、動的光散乱(DLS)またはナノ粒子追跡分析(NTA)によって確認できます。
3. 300 mMリン酸ナトリウム一塩基性(NaH₂PO₄)滅菌溶液を調製します。必要に応じて溶液をろ過して無菌状態を確保します。
4. EVサンプルに1%(v/v)の300 mM NaH₂PO₄ を加え、溶液を穏やかにピペットでよく混合します。200 μLの混合溶液を96ウェルプレートに移します。96ウェルプレートをマイクロプレートリーダーで37°Cでインキュベートします。
5. プレートリーダーを設定して、1分ごとに波長340nmの吸光度を記録します。

4. コラーゲンハイドロゲルを用いた細胞外小胞の石灰化ミネラル形成の評価

注:EVの凝集と微小石灰化の形成は、コラーゲンヒドロゲルを介して観察されます。これらのヒドロゲルは、 インビボ¹⁵で観察されるコラーゲン密度を模倣する足場として作用する。これは、石灰化の成長に対するコラーゲンの効果を示しています。ヒドロゲル中のEVの鉱物形成を評価するためのプロトコルは次のとおりです。

1. 1日目
   1. DMEMで2.5 mg/mLのコラーゲン溶液を調製します。色が赤に変わるまで、コラーゲン/ DMEM混合物に5 M水酸化ナトリウムをゆっくりと加えます。溶液のpHが約7であることを確認してください。
      注: ソリューションが紫色に変わり、基本的になりすぎた場合は、プロセスを再開します。
   2. pH 7 の 2.5 mg/mL コラーゲン溶液 300 μL を 8 ウェルチャンバーガラスの各ウェルにピペットで入れます。37°C、5%CO2制御湿度で₇₂ 時間インキュベートします。
2. 4日目
   1. コントロールとして300 μLのDMEMをウェルに加えます。
   2. 以前に収集した300 μLのEV培地サンプルを残りのウェルに追加します。
   3. 37°C、5%_CO2 制御湿度で6日間インキュベートします。
3. 10日目
   1. 22.5 μLのDMEMを含む2.5 μLのオステオセンス680EXを調製します。
   2. 2.5 μLのオステオセンスとDMEMの混合物を各ウェルにピペットで入れます。37°C、5%_CO2 制御湿度で24時間インキュベートします。
4. 11日目
   1. オステオセンス蛍光に適したフィルターでヒドロゲルを画像化します。倒立顕微鏡を使用してカバーガラスチャンバーの底部から、または作動距離の長い対物レンズを使用して上部から画像化します。
   2. ImageJで使用可能な 粒子分析 オプションを使用して、収集された画像の石灰化の数と石灰化サイズを評価します。
      1. 画像を使用する |調整 | Osteosense信号のみが白く見えるように画像を二値化するしきい値コマンド。分析を使用する |[パーティクルを解析 ]コマンドを使用して、画像内の各石灰化に関する情報を取得します。一貫性を保つために、分析された各画像に同じしきい値パラメーターを使用してください。

Results

大動脈が抽出されると、近赤外光学スキャナーを使用したイメージングは、大動脈と血管石灰化の視覚的表現を示します(図1)。スキャンされた蛍光画像内のピクセル強度値は石灰化の分布を表し、ここでは色付きのヒートマップを使用して示されています。定量化方法には、正の閾値を特定し、この閾値より大きい値を有する大動脈のパーセンテージ領域を報告すること、および/または大動脈内のピクセルの平均蛍光強度を報告することが含まれる。 図2 および 図3に示すように、市販の初代ヒト冠動脈平滑筋細胞を用いて、その技術を実証した。VSMCからのコンディショニングされた媒体は、EVの石灰化電位を測定するために使用できます。経時的な鉱物形成は、マイクロプレートリーダーを用いた480nmでの光吸光度によって測定されます(図2A、B)。石灰化の急速な段階での線形回帰により、吸光度の増加は、対照サンプルと比較...

Discussion

プロトコルを実行するときは、正常な結果を得るための重要な手順に注意することが重要です。マウス大動脈の単離中は、灌流が適切に行われることが重要です。PBSを注射するときは、右心室に穴を開けないように注意する必要があります。これにより、液体が心室から直接漏れ、肺を循環できず、大動脈内に血液が残ります。灌流が適切に行われ、微小解剖が開始されたら、完了してスキャンする前に、すべての脂肪組織と脂肪組織を大動脈から取り除く必要があります。脂肪が残っていると、データを総組織サイズに正規化するときに大動脈が大きく見えます。

解剖中のマウス大動脈のサイズが限られているため、大動脈を半分に穿刺または切断するのが一般的です。これが発生した場合は、通常どおり解剖を続けることをお勧めします。大動脈片は、イメージングのために互いに近くに配置することができる。大動脈は、EV分離のためにバラバラに消化液に入れることもできます。EVの単離を開始する場合、十分なタンパク質を生成するために複数の大動脈が必要です。この制限は、信頼できる結果を得るために適切な量の組織を収集するために、より多くのマウスを解剖する必要がある...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
8ウェルチャンバーカバーグラス	Thermo Scientific	155409PK
10 mL シリンジ	BD	302995
20 G 1 インチ ニードル	BD	305175
コラーゲン、高濃縮、ラットテール	コーニング	354249
コラゲナーゼ	ワージントン 生化学	LS004174
湾曲鉗子	Roboz 手術器具	RS-8254
解剖皿	リビングシステム計装	DD-90-S
解剖パンとワックス	ユナイテッドサイエンティフィックサプライズ	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.
イソフルラン	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR オデッセイ	LI-COR	DLx
マイクロ解剖湾曲ハサミ (24 mm ブレード)	ロボズ手術器具	RS-5913
マイクロ解剖スプリングハサミ(13mm刃)	ロボズ手術器具	RS-5677
マイクロ解剖スプリングハサミ(5mm刃)	ロボズ 手術器具	RS-5600
マイクロ解剖ピンセット(0.10 x 0.06 mmチップ)	ロボズ手術器具	RS-4976
オプティマMAX-TL超遠心分離機	ベックマン・コールター	B11229
オステオセンス 680EX	パーキン・エルマー	NEV10020EX
ピアス プロテアーゼ阻害剤	サーモサイエンティフィック	A32963
塩化カリウム	フィッシャーケミカル	P217
RIPA 溶解・抽出バッファー	G バイオサイエンス	786-489
塩化ナトリウム	フィッシャーケミカル	BP358
水酸化ナトリウム	Thermo Scientific	A4782602
リン酸ナトリウム 一塩基性	Sigma-Aldrich	S0751
スクロース	Sigma	S7903
Synergy HTX マルチモードリーダー	Agilent
組織培養プレート、96 ウェル	サーモフィッシャー	167008
T-ピン	ユナイテッドサイエンティフィックサプライ	ズTPIN02-PK / 100
トリス塩酸塩	フィッシャーケミカル	BP153