方法論記事

無細胞発現システム:製造および使用方法

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2023年7月28日

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1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

この記事について

要約

議論された記事:

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE無細胞システム. 視覚化された実験のジャーナル。(172)、DOI:10.3791/62625 (2021年)。

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P.細胞から無細胞タンパク質合成まで、無細胞自己誘導ワークフローを使用して24時間以内に行うことができます。視覚化された実験のジャーナル。(173)、DOI:10.3791/62866(2021年)。

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. 迅速で、手頃な価格で、細菌の無細胞溶解物の簡単な生産。視覚化された実験のジャーナル。(176)、DOI:10.3791/62753(2021年)。

Dopp, J. L., Reuel, N. F. 無細胞システムを用いたタンパク質プロトタイピングのための最小限の線形テンプレートの増幅のための迅速で酵素的方法.視覚化された実験のジャーナル。(172)、DOI:10.3791/62728(2021年)。

McManus, J. B. et al. 無細胞システムによる遺伝部分の迅速な特性評価.視覚化された実験のジャーナル。(174)、DOI:10.3791/62816 (2021年)。

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J.合成生物学および天然物アプリケーション向けの高収量ストレプトマイセス転写翻訳ツールキット。視覚化された実験のジャーナル。(175)、DOI:10.3791/63012(2021年)。

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. ライセートベースの無細胞系における代謝物プロファイリングのための屈折率または質量分析検出と組み合わせた液体クロマトグラフィー。視覚化された実験のジャーナル。(175)、DOI:10.3791/62852 (2021年)。

Drachuk、I.、Harbaugh、S.、Kelley-Loughnane、N.、Chávez、JLRNAアプタマーとリボスイッチをコードするDNAプラスミドをロードした多機能シルクベースのマイクロカプセルの調製。視覚化された実験のジャーナル。(176)、DOI:10.3791/62854 (2021年)。

Jaenes, K. et al. 紙ベースのトーホールドスイッチ診断の開発と患者検証のための設計から実装研究まで。視覚化された実験のジャーナル。(184)、DOI:10.3791/63223 (2022年)。

編集記事

無細胞発現(CFE)システムは、転写、翻訳、代謝の主要な細胞プロセスを細胞の範囲外で再構成する一連のツールです1。このような方法は、細胞膜の除去 による 実験の簡素化と、ゲノムDNAの除去 による 複雑さの軽減、および遺伝子構築物と宿主の間の相互作用の対応する複雑さを提供することにより、急速に人気が高まっています。CFEシステムは現在、基礎研究、センシング、バイオ製造、教育に使用されています。このメソッドコレクションでは、セルフリーシステムを製造および使用する新しい方法の9つの例を紹介します。

そのうちの3つの方法は、セルフリーシステムの製造をよりアクセスしやすくすることに焦点を当てています。Grasemannらは、細胞ライセートを使用するのではなく、転写と翻訳に必要なすべての成分を再構成するCFEシステムであるPUREシステムを作るより簡単な方法を説明しています2。著者らは、36種類のタンパク質成分のそれぞれを発現および精製する代わりに、発現株をプールし、1週間以内に機能的なPUREシステムの生産を提供します。Smithらは、通常の作業時間内に達成可能な、総ワークフローを24時間に短縮する合理化された培養アプローチを使用して、ライセートベースのCFEシステムを製造するための簡素化されたプロセスを提供します3。Cooperらは、凍結融解による細胞溶解を可能にする改変大 腸菌 株を使用した方法を説明し、他の方法に必要な特殊な機器の必要性を排除します4。これらの方法はすべて、複雑な従来のプロトコルに関するインフラストラクチャと専門知識が少ないラボで無細胞システムの製造を達成できるようにする取り組みの傾向に貢献しています。競合する市販キットが利用可能になったことで、ますます多くのラボがほとんどリスクを負わずにCFEシステムの利点を探求できるようになりました。ここで紹介したような方法を使用すると、これらのラボは、機器や時間に多額の投資をすることなく、ニーズに合わせた独自のCFEシステムを作成することを選択できます。

2つの方法は、CFEシステムで可能な迅速かつハイスループットの実験の利点に焦点を当てています。Doppらは、遺伝子構築物の迅速なスクリーニングのために線状DNAテンプレートを増幅する方法を提示します5。彼らのアプローチを使用すると、遺伝子デザインをDNA合成会社に注文し、24時間以内に増幅してスクリーニングすることができます。McManusらは、レポーター遺伝子が異なる調節成分をコードするさまざまなプライマーで増幅される同様のアプローチを説明しています6。オリゴを低コストでCFEシステムと組み合わせることで、プロモーターなどの成分の迅速かつ費用対効果の高いスクリーニングが可能になります。どちらの方法も、迅速な実験のためのCFEシステムの可能性を強調しており、従来のクローニングを使用して構築物を設計およびテストするタイムラインを数週間から数日または数時間に短縮します。

次の3つの方法は、CFEシステムを特殊に使用するためのツールを提供します。 Streptomyces venezuelae7からCFEシステムを作成する方法を提供します。CFE プロトコルの大部分は、このコレクションの他のすべての方法を含め、 大腸菌に基づいています。この新しい方法 S . ベネズエラ 天然物生産に広く関心のある生物に CFE システムの利点をもたらします。無細胞反応における代謝産物濃度を測定する方法を提供します8。このような測定は、CFEシステムの無傷の代謝を使用して目的の非タンパク質産物を生成する無細胞代謝工学のアプリケーションにとって重要です。第三に、Drachukらは、CFE反応9に付加するためのDNAのマイクロカプセル化を提示しています。このアプローチは、CFE システムの製造中に天然膜を除去した後、区画化の利点を CFE システムに合理的に再導入できるようにする一連の技術の代表です。これらの方法はそれぞれ、CFE システムが適用できるアプリケーションの範囲を多様化します。

最後に、Jaenesらは、CFEシステムに基づいてジカウイルスの実際の診断を作成する方法を説明しています10。検査と機器は、PCRなどの競合技術と比較して低コストであり、著者らは複数の国の患者サンプルを使用して診断のテストに成功しています。この研究は、おそらくCFEシステムが現実世界に最も直接的な影響を与える準備ができている分野であるポイントオブニーズセンシングアプリケーションの強力な例です。

コレクションとして、これらの方法は、近年のCFEシステムにおける活発な研究の主要な分野の代表的な範囲を捉えています。CFEシステムの製造を改善し、ハイスループット実験を可能にする方法がよく表されており、CFEシステムのより具体的な用途の例が多数あります。その他の関心分野には、医療用途向けの複雑なタンパク質の製造、非標準アミノ酸の組み込み、長期保存の最適化、人工細胞の開発などがあります。CFEシステムの採用は、参入障壁の低減、迅速な実験の可能性、およびより幅広い機能により、すべてこのコレクションで紹介されているような方法によって可能になることを考えると、今後も加速すると予想されます。残りの課題は、アプリケーション分野によって異なります。バイオ製造では、より安価な基材への移行とリサイクルの改善による大規模なコスト削減が重要になります。センシングについては、さまざまなポイントオブニーズアプリケーションで堅牢なパフォーマンスを実証するために、Jaenesらの例に基づいて構築された重要な作業が必要です。広く言えば、この分野は、CFE システムでできることのレパートリーを拡大しながら、コア技術を洗練し続ける必要があります。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者は、このコレクションにつながった協力を支援してくれた国防長官室のS&T優先事項の進歩のための応用研究プログラムに感謝します。

参考文献

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

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