Method Article

ALS研究における現在の方法

DOI:

10.3791/65016

⸱

March 3rd, 2023

 ,  , 
1Experimental Neurology and Leuven Brain Institute (LBI), Department of Neurosciences, KU Leuven - University of Leuven, 2Laboratory of Neurobiology, Center for Brain & Disease Research, Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB), 3VIB-KU Leuven Center for Brain & Disease Research, Department of Neurosciences, KU Leuven, Leuven Brain Institute

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

議論された記事:

浅川 和彦, 半田 英, 川上 和彦 ゼブラフィッシュ幼生の脊髄運動ニューロンにおける TDP-43 の光遺伝学的相転移.視覚化された実験のジャーナル。(180)、E62932(2022)。

Coyne, A. N., Rothstein, J. D. ヒト神経変性におけるヌクレオポリンの変化を調べるための核分離および超解像構造化照明顕微鏡法.(175)、E62789(2021)。

Currey, H. N., Liachko, N. F. 筋萎縮性側索硬化症のC.エレガンスモデルにおける運動障害の評価.(175)、E62699(2021)。

Hayes, L. R., Duan, L., Vidensky, S., Kalab, P. 透過処理マウス皮質ニューロンにおける核輸送アッセイ.(173)、E62710(2021)。

Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. 筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定.(173)、E62813(2021)。

Loganathan, S., Ball H. E., Manzo, E., Zarnescu, D. C. TDP-43 タンパクノパチーのショウジョウバエモデルにおけるグルコース取り込みの測定.(174)、E62936(2021)。

Stilwell, G., Agudelo, A. 同定された運動ニューロンの神経筋接合部での変化を検出するためのショウジョウバエ成虫脚の解剖および免疫組織化学。(180)、E62844(2022)

Taga, A. 他 地域特異的なヒト多能性幹細胞由来のアストロサイトとニューロンを用いてALSをモデル化するための電気生理学的プラットフォームの確立。(174)、E62726(2021)。

Stoklund Dittlau, K. et al., マイクロ流体デバイスにおける機能的な神経筋接合部を持つ人間の運動単位の生成.(175)、E62959(2021)。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

筋萎縮性側索硬化症 (ALS) は、生涯で約 400 人に 1 人が罹患する壊滅的な神経変性疾患です。この疾患は、最初は上部および下部運動ニューロンの障害として現れ、最終的には症状の発症後2〜5年以内に呼吸不全の結果として麻痺および死亡に進行します。ALS は遺伝性である可能性があり、30 を超える異なる遺伝子変異がありますが、家族性 ALS の約 55% を占める遺伝子変異は 4 つ (C9orf72、FUS、SOD1、TARDBP) のみです。ALS 症例の大部分 (約 90%) は散発性 ALS であり、主な原因はまだ完全には理解されていません2。適切なツールやモデル生物を用いてALSのメカニズムを解明することが急務です。この方法コレクションでは、この病気を模倣し、最終的に治療選択肢を見つけるという観点から、最近の研究の進歩の概要を提供します。例えば、運動ニューロンまたは星状細胞に分化することができる人工多能性幹細胞(iPSC)の応用は、ヒト化モデルシステムを提供する3,4,5。さらに、この方法コレクションでは、グルコース取り込みと神経筋接合部 (NMJ) in vivo を研究するショウジョウバエ 6,7、皮質ニューロンを研究するマウス8、運動障害を調査する C. elegans またはゼブラフィッシュなどの動物モデルが提示されています 9,10 および死後の患者組織11。

ゼブラフィッシュの幼虫は透明で、運動ニューロンが直接見えるため、 非侵襲的な in vivo 研究に最適なツールです。Asakawa らは 、単一の脊髄運動ニューロンにおける光遺伝学的に発現したTDP-43の相転移を示しています9。照射後、TDP-43の細胞質転位を観察し、分析することができます。細胞質TDP-43の凝集は、ALSにおける変性運動ニューロンの特徴です。この方法により、ALS 関連タンパク質の機能研究と分析が細胞内、時間的方法で可能になります。

CoyneとRothsteinは、超解像構造化照明顕微鏡(SIM)を使用して、核を単離するプロトコルを詳述し、ヌクレオポリン複合体を調査する方法を説明します11。ヌクレオポリン複合体は、約30の異なるヌクレオポリンタンパク質(Nups)の複数のコピーで構成されています。核細胞質輸送 (NCT) 障害と Nup の変化は、ALS を含む多くの神経変性疾患の初期の特徴であることが示されています。核を抽出することで、NPCおよび核質内の個々のNupタンパク質を3Dで調べることができます。興味深いことに、これはiPS細胞由来の細胞だけでなく、死後の組織にも適用できます。

CurreyとLiachkoは、ALS10のC.エレガンスモデルにおける軽度、中等度、および重度の運動障害を区別するための2つのアッセイについて説明しています。橈骨運動アッセイでは、表面の這い方を測定するため、簡単で費用対効果の高いアッセイになります。2番目の方法である水泳アッセイでは、コンピューターベースの追跡方法を使用してスラッシングの動きを測定できます。著者らはこれを使用して、TDP-43とタウを研究しています。

Hayes らは 、NCT8を研究する方法についても説明しています。彼らは神経培養に透過処理法を適用します。彼らは、初代マウス皮質ニューロンを使用して、ウシ血清アルブミンクッションと組み合わせた低張溶解を使用して核膜の完全性を維持する方法を説明しています。そうすることで、原子力輸入は依然としてエネルギー依存的に機能し、ハイコンテントの顕微鏡および分析プラットフォームを提供します。このプラットフォームは、一次ニューロンにおける受動的および能動的核輸送を研究するために、将来的に広く適用可能になります。

操作、疾患関連タンパク質、またはRNAがシナプスプロセスにどのような影響を与えるか、および治療薬がこれらの機能を回復できるかどうかを迅速に評価することは、ALS研究に不可欠です。Krishnamurthy ら は、iPS細胞由来の運動ニューロンとマウスの初代ニューロンを使用して、シナプス前カルシウム流入ダイナミクスとシナプス小胞膜融合のリアルタイムモニタリングを可能にするプロトコルを提示します3。著者らは、C9orf72-(GA)50 トランスフェクションがシナプス伝達を損なうことを実証し、シナプス機能の変異に基づく違いを検出するためのこれらの方法の適合性を強調しています。

グルコース取り込みの変化は、ALS の病態生物学的特徴の 1 つです。この ショウジョウバエ モデルでは、Loganathan らは 、特定の細胞におけるグルコース取り込みの細胞内変化を測定するためのFRETベースの方法を説明しています6。遺伝的にコードされたグルコースFRETセンサーを使用して、より高いグルコース取り込みを示すTDP-43発現ニューロンで方法を検証します。TDP-43G298S 変異株では、グルコース取り込みの増加はグルコース刺激時にのみ検出されます。この方法は、ALSだけでなく、運動ニューロンの再生に関連して解糖系を研究するための重要なツールを提供します。

NMJ構造を維持する解剖技術は、ショ ウジョウバエ の脚に沿った運動ニューロンの経時的な変化を研究するために最も重要です。StilwellとAgudeloは、免疫細胞化学を使用して運動ニューロンアーバーを同定するためのNMJの特性評価を可能にする技術を利用しています7。興味深いことに、成体のニューロンはハエの生涯(約90日)を通して存在します。SOD1H71Y 変異を野生型と比較すると、著者らは、年齢依存性のブトン腫脹、タンパク質凝集体、およびミトコンドリアの肥大についてさまざまなマーカーを実証しました。

共培養システムを使用してNMJを模倣するという革新は、運動ニューロンと筋管の間の解離を研究する緊急のニーズを満たしています。この方法に関して、Stoklund Dittlau らは 、ヒトiPS細胞由来の運動ニューロンとヒト初代中血管芽細胞由来の筋管を培養して、機能的に活性なNMJを形成する方法を説明しています4。著者らは、その後、NMJ遮断薬の投与によって廃止されたFluo-4標識筋管内の塩化カリウムとカルシウム流入による運動ニューロンの活性化によってそれらの機能を示しています。

最近、共培養システムへの注目が高まっています。1つの皿で1つだけでなく複数の細胞型を研究すると、単培養細胞を使用する方法よりも生理学的条件をよりよく模倣できるという利点があります。星状細胞を介した毒性やニューロンの過興奮性などの ALS 関連の病態生物学は、このアプローチを使用して研究できます。Taga らによるビデオでは、電気生理学をモニタリングするために、多電極アレイ(MEA)セットアップと組み合わせた共培養における皮質ニューロンと星状細胞の生成が示されています5。機能活性を経時的に監視できるため、細胞組成やさまざまな培養条件に柔軟に対応できます。これはさらに、薬物の治療可能性と機能活性への影響をテストするためのプラットフォームを提供します。

現在、FDA が承認した ALS の治療法は 3 つしかなく、いずれも応用の可能性は限られています。より有望な治療法を見つけるには、将来の研究では、複数のモデルシステムとアプローチを採用することにより、病態生物学をよりよく理解する必要があります。間違いなく、ヒトiPS細胞由来モデルは、根底にある分子メカニズムを調査するための興味深いプラットフォームを提供するでしょう。これをゼブラフィッシュ、 C.エレガンス、 ショウジョウバエ、げっ歯類などのモデルシステムと組み合わせることで、この分野の進歩につながります。さらに、将来の疫学研究により、環境要因が ALS12 の発症にどのように関与するかについて、より多くの洞察が得られることが期待されます。データセットの拡大とバイオインフォマティクスの高速発展により、今後は神経変性疾患の共通点を解明しやすくなるでしょう。これは、治療や予防のための新しい道につながるでしょう。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このコレクションに貢献してくださったすべての著者に感謝し、この分野の進歩に対して同僚に感謝します。また、フランダース科学研究基金(FWO-Vlaanderen)にも感謝いたします。Y.E.K.はFWO博士フェローSB(#1S50320N)です。また、VIB、KU Leuven(C1および「Opening the Future」基金)、"Fund for Scientific Research Flanders"(FWO-Vlaanderen)、Thierry Latran Foundation、"Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires – aide à la recherché ASBL"(ABMM)、筋ジストロフィー協会(MDA)、ALS Liga België(ALSの治療)、 ALSとALS協会(ALSA)を対象とします。

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. What causes amyotrophic lateral sclerosis. F1000Res. 6, 317(2017).">Martin, S., Al Khleifat, A., Al-Chalabi, A. What causes amyotrophic lateral sclerosis. F1000Res. 6, 317(2017).
  2. The epidemiology of amyotrophic lateral sclerosis. Handbook of Clinical Neurology. 138, 225-238 (2016).">Talbott, E. O., Malek, A. M., Lacomis, D. The epidemiology of amyotrophic lateral sclerosis. Handbook of Clinical Neurology. 138, 225-238 (2016).
  3. Real-time fluorescent measurements of synaptic functions in models of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Visualized Experiments. (173), e62813(2021).">Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-time fluorescent measurements of synaptic functions in models of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Visualized Experiments. (173), e62813(2021).
  4. Generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (175), e62959(2021).">Stoklund Dittlau, K., et al. Generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (175), e62959(2021).
  5. Establishment of an electrophysiological platform for modeling ALS with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons. Journal of Visualized Experiments. (174), e62726(2021).">Taga, A., et al. Establishment of an electrophysiological platform for modeling ALS with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons. Journal of Visualized Experiments. (174), e62726(2021).
  6. Measuring glucose uptake in Drosophila. models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936(2021).">Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo, E., Zarnescu, D. C. Measuring glucose uptake in Drosophila. models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936(2021).
  7. Dissection and immunohistochemistry of the Drosophila. adult leg to detect changes at the neuromuscular junction for an identified motor neuron. Journal of Visualized Experiments. (180), e62844(2022).">Stilwell, G., Agudelo, A. Dissection and immunohistochemistry of the Drosophila. adult leg to detect changes at the neuromuscular junction for an identified motor neuron. Journal of Visualized Experiments. (180), e62844(2022).
  8. Nuclear transport assays in permeabilized mouse cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (173), e62710(2021).">Hayes, L. R., Duan, L., Vidensky, S., Kalab, P. Nuclear transport assays in permeabilized mouse cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (173), e62710(2021).
  9. Optogenetic phase transition of TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments. (180), e62932(2022).">Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic phase transition of TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments. (180), e62932(2022).
  10. Evaluation of motor impairment in C. elegans. models of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Visualized Experiments. (175), e62699(2021).">Currey, H. N., Liachko, N. F. Evaluation of motor impairment in C. elegans. models of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Visualized Experiments. (175), e62699(2021).
  11. Nuclei isolation and super-resolution structured illumination microscopy for examining nucleoporin alterations in human neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (175), e62789(2021).">Coyne, A. N., Rothstein, J. D. Nuclei isolation and super-resolution structured illumination microscopy for examining nucleoporin alterations in human neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (175), e62789(2021).
  12. The epidemiology of ALS: A conspiracy of genes, environment and time. Nature Reviews Neurology. 9 (11), 617-628 (2013).">Al-Chalabi, A., Hardiman, O. The epidemiology of ALS: A conspiracy of genes, environment and time. Nature Reviews Neurology. 9 (11), 617-628 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

ALS ResearchTDP 43Spinal Motor NeuronsZebrafish LarvaeNucleoporinsNeurodegenerationC Elegans ModelsMotor ImpairmentNuclear Transport AssaysSynaptic FunctionsDrosophila ModelsGlucose UptakeNeuromuscular JunctionHuman Pluripotent Stem CellsMicrofluidic Devices

Related Articles