Method Article

クライオ電子顕微鏡ステータスの更新と革新的な開発

DOI:

10.3791/65021

⸱

March 3rd, 2023

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1Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Abstract

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議論された記事:

Truong, C. D. et al. 電子結晶学研究のための脂質単層法を用いたサンプル調製.視覚化された実験のジャーナル。 (177)、E63015(2021)。

ジョンソン、MC、グラント、AJ、シュミット·クレイ、I.ピールブロット法:多層または濃縮された生物学的サンプルから単層を分離するクライオEMサンプル調製法。視覚化された実験のジャーナル。 (184)、E64099(2022年)。

Chang, Y.-C., Chen, C.-Y., Tsai, M.-D.クライオ電子顕微鏡用の高温サンプルグリッドの作製。視覚化された実験のジャーナル。 (173)、E62772(2021)。

Kang, M.-H., Lee, M., Kang, S., Park, J. ハイスループット極低温電子顕微鏡のための制御された厚さのマイクロパターンチップの作製.視覚化された実験のジャーナル。 (182)、E63739(2022年)。

Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, F., Plitzko, J., Erdmann, P. S. 高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製.視覚化された実験のジャーナル。 (176)、E62886(2021)。

DiCecco, L.-A. et al. 液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩.視覚化された実験のジャーナル。 (185)、E63856(2022)。

Kumar, A., P, S., Gulati, S., Dutta, S. ユーザーフレンドリーでハイスループットな、全自動の単一粒子クライオ電子顕微鏡用データ取得ソフトウェアです。視覚化された実験のジャーナル。 (173)、E62832(2021)。

Discussion

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生体分子のクライオ電子顕微鏡(cryoEM)が2017年にノーベル賞を受賞する前から、この分野は盛り上がりを生み出していました。分解能革命は順調に進んでおり、構造生物学はX線結晶学のゴールドスタンダードに近づく特性評価方法としてクライオEMに注目していました1。初期のクライオEMの分野は、主にクライオ透過型電子顕微鏡(クライオTEM)によって生成されたデータを網羅していました。現在、顕微鏡、サンプル前処理機器、サンプル前処理方法が進歩し、生成されるデータの種類はより多様化しています。クライオEMは、クライオTEMによるタンパク質の特性評価のために予約されなくなりました。この分野は成長し、現在ではクライオ走査型電子顕微鏡と集束イオンビーム(cryoSEM/FIB)から生成されたデータで構成されています。その影響は、分子、細胞、組織、ハイドロゲルなどの合成材料のイメージング研究など、複数の分野にわたってより広く感じられます。

イメージング能力の進歩は、クライオEM開発の原動力となっています。カメラ、検出器、画像処理の改良により、より少ないエネルギー入力でイメージングできる道が開かれ、繊細な生体サンプルがイメージングプロセスに耐えられるようになった。TEMでは、低線量ビーム露光は、単一のサンプルを複数の角度で繰り返し画像化して3D再構成を生成する断層撮影の応用に変換されています2,3。SEM/FIBの進歩により、より少ないエネルギーで解像度も向上しました。重要なことに、これにより非導電性サンプルのイメージングが改善され、SEM/FIBの体積イメージングが向上しました4,5。これらの改善により、すべての生体電子顕微鏡イメージングが進歩しましたが、サンプルが繊細で、コントラストを向上させるために追加の重金属が添加されていないクライオイメージングが特に改善されました。

イメージング機能が進歩するにつれて、サンプル前処理装置も進歩しています。クライオEMサンプル調製では、最初のステップはサンプルのガラス化を成功させることです。水和したサンプルは凍結してアモルファス氷を形成し、氷の結晶の形成による損傷を回避します。主な戦略は、分子や小細胞の液体エタンでのプランジ凍結、または厚さ数百ミクロンの大きなサンプルの高圧凍結(HPF)です。プランジ凍結技術の進歩により、空気/水界面に沿った自己組織化を減らすことにより、あらゆる方向の分子をよりよく捕捉することができます6。さらに、HPF技術の進歩により、凍結する直前にサンプルに光と電気を刺激することができます7。ごく最近では、蛍光顕微鏡とインターフェースできる新しいHPF技術が開発され、生細胞の蛍光イメージングとHPF凍結の間に短い時間遅延(<2秒)が可能になりました8。

上記の進歩はクライオEMの分野に活力を与え、新しい方法の開発にインスピレーションを与えました。確立された技術の再活性化もありました。ここでは、急速に拡大する研究分野にこれらの戦略を普及させることを目的として、クライオ電子顕微鏡の進歩に焦点を当てた方法のコレクションを紹介します。

イメージング能力とサンプル前処理機器の向上は、クライオ電子顕微鏡分野の進歩の大きな原動力となっていますが、この研究における大きなハードルは、依然としてサンプルの実践的な前処理です。Truongら9は 、空気/水界面での脂質単層形成を利用する方法を提示しています。脂質層はTEMグリッド上に形成され、目的の膜タンパク質の足場として機能します。多層または積層膜サンプルの場合、Johnson et al.10 は、余分な層を「剥がす」戦略を提示し、TEM イメージングに適したグリッド上に 1 つの層を残します。別の論文で、Changら11 は、一部のタンパク質が温度依存性であり、関連する構造が高温で観察されることを認識しています。彼らは、プランジ凍結後もガラス質の氷を達成しながら、サンプルを高温でグリッドに適用できる修正されたプランジ凍結法について説明しています。クライオグリッド調製のプロセスをさらに制御するために、Kangら12 は、細孔の深さが制御可能なTEMグリッド用のマイクロパターンチップを製造するハイスループット法を提示しています。この方法は、グリッドの準備中にアモルファス氷の厚さを制御するための別の変数を提供する可能性があります。

複数の画像診断法の相関関係は影響力があります。Bieber et al.13 は、凍結グリッドをクライオ蛍光顕微鏡で画像化して、関心のある蛍光領域を特定するクライオ ワークフローについて説明しています。次に、グリッドはクライオSEM/FIBに転送され、そこで基準点を使用して蛍光画像をSEM画像に位置合わせし、蛍光領域をFIBミリングのターゲットにすることができます。ターゲット領域を数百ナノメートルに薄くし、グリッドをクライオTEMに移して、薄くなったターゲット位置でトモグラフィーを行います。DiCecco ら 14 は、液体 TEM とクライオ TEM の相関関係を実証し、高解像度のクライオTEM データと動的運動中の分子の TEM データを結合するという目標に近づいています。

大規模なデータセットの自動取得も興味深い分野です。貴重な機器時間を最大限に活用する必要があり、自動化は重要なステップです。Kumarら15 は、クライオTEMイメージング用の自動データ収集ソフトウェアのクリックバイクリックセットアップについて説明しています。

クライオEMの分野が発展し続けるにつれて、サンプル調製がさらに進歩し、クライオEMの影響はより多くの分野で広く感じられるでしょう。いくつかの進歩には、新しい技術ではなく、既存の技術の強化が含まれます。この手法は、より速く、より簡単で、より堅牢で、より高いスループットを実現します。自動化によりデータ出力が増加するにつれて、開発の重要な分野は画像解析とデータ処理になります。さらに、AIも重要な役割を果たすでしょう。計装コストと設置面積の削減が期待され、これらの開発の実現は遅れる可能性がありますが、このテクノロジーにより広く利用できるようになります。

Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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このコレクションに貢献してくださったすべての著者と、この分野での継続的な進歩に対する同僚に感謝します。この研究は、国立がん研究所のKoch Institute Support(コア)助成金P30-CA14051によって部分的に支援されました。技術サポートを提供してくれたコッホ研究所のロバート・A・スワンソン(1969)バイオテクノロジーセンター、特にピーターソン(1957)ナノテクノロジー材料コアファシリティに感謝します。

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. McEwen, B. F., Marko, M. The emergence of electron tomography as an important tool for investigating cellular ultrastructure. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (5), 553-563 (2001).
  3. Dover, S. D., Elliott, A., Kernaghan, A. K. Three-dimensional reconstruction from images of tilted specimens: the paramyosin filament. Journal of Microscopy. 122, 23-33 (1981).
  4. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  5. Wu, G. H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).
  6. Darrow, M. C., Moore, J. P., Walker, R. J., Doering, K., King, R. S. Chameloen: Next generation sample preparation for cryoEM based on Spotiton. Microscopy and Microanalysis. 25, 994-995 (2019).
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  8. Heiligenstein, X., et al. HPM live μ for a full CLEM workflow. Methods in Cell Biology. 162, 115-149 (2021).
  9. Truong, C. D., et al. Sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies. Journal of Visualized Experiments. (177), e63015(2021).
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  11. Chang, Y. -C., Chen, C. -Y., Tsai, M. -D. Preparation of high-temperature sample grids for cryo-EM. Journal of Visualized Experiments. (173), e62772(2021).
  12. Kang, M. -H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of micro-patterned chip with controlled thickness for high-throughput cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (182), e63739(2022).
  13. Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, F., Plitzko, J., Erdmann, P. S. Sample preparation by 3D-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments. (176), e62886(2021).
  14. DiCecco, L. -A., et al. Advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice. Journal of Visualized Experiments. (185), e63856(2022).
  15. Kumar, A., P, S., Gulati, S., Dutta, S. User-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (173), e62832(2021).

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