方法論記事

グリコーゲン代謝の研究方法

DOI：

10.3791/65023

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2023年3月3日

1Indiana University School of Medicine-Muncie and Ball State University

この記事について

要約

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議論された記事:

Wilson、WA真核生物グリコーゲン代謝の研究のための分光光度法。視覚化された実験のジャーナル。(174)、E63046(2021)。

Wang, J. J. et al.細菌のグリコーゲン粒子の分子構造特性評価のための非分解的抽出法です。視覚化された実験のジャーナル。(180)、E63016(2022)。

Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A.グリコーゲン構造決定のための肝臓グリコーゲン分子の抽出。視覚化された実験のジャーナル。(180)、E63088(2022)。

Jensen, R., Ortenblad, N., di Benedetto, C., Qvortrup, K., Nielsen, J. 透過型電子顕微鏡を用いた骨格筋線維における細胞内グリコーゲン分布の定量化.視覚化された実験のジャーナル。(180)、E63347(2022)。

Fermont, L., Szydlowski, N., Colleoni, C. 蛍光色素補助炭水化物電気泳動(FACE)法を用いたグリコーゲンのグルカン鎖長分布の決定.視覚化された実験のジャーナル。(181)、E63392(2022)。

編集記事

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分岐グルコースポリマーであるグリコーゲンは、原核生物および真核生物のエネルギー代謝において重要な役割を果たします。栄養制限の条件下では、細菌と酵母は細胞の生存のためにグリコーゲンを利用します1。哺乳類では、グリコーゲンは、収縮を促進するための筋肉での局所使用や、血糖値を調節するための肝臓での局所使用など、組織特異的な役割を果たします2。グリコーゲンの合成は、アルファ 1,4 結合 を介して グルコース残基を結合するグリコーゲンシンターゼと、アルファ 1,6 結合を形成する分岐酵素によって触媒され、グリコーゲン高分子に分岐が形成されます。このエネルギー貯蔵の利用は、グリコーゲンホスホリラーゼと脱分岐酵素の組み合わせによって促進され、その結果、グリコーゲンのリモデリングとグルコース-1-Pの放出がもたらされます。粒子サイズや分岐を含むグリコーゲンの構造は、分岐がグリコーゲンの溶解度に影響を与え、グリコーゲン粒子のサイズがグリコーゲン粒子の分解速度に影響を与え、グリコーゲンの構造の不安定性が糖尿病に関与していることが一因として興味深いものです。さらに、グリコーゲンの細胞内局在を調査することは、運動中のこの燃料の役割に関する情報を得るために、筋肉などの組織で重要です。

グリコーゲンの蓄積は、グリコーゲン合成酵素と高分子を分解する酵素の相対的な活性によって制御されます。Wilson3 では、グリコーゲンシンターゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、分岐酵素、および脱分岐酵素の酵素活性を測定する技術について説明しています。これらの生化学的方法では、分光光度計を使用して、NADH/NADPHまたは比色変化の生成または消費を測定します。これらは、放射性同位元素を利用するより高感度な方法に関連する高コスト、特殊な機器、規制上の負担を回避するスケーラブルなアプローチです。記載されている方法は、精製酵素による酵素活性の測定に最も適していますが、十分なホモジネート希釈と適切なコントロールにより、組織サンプルで使用されています。ウィルソン3 は、グリコーゲン分岐を測定するための簡単な比色アッセイについても説明しています。この方法は、より手間のかかる分離技術よりもグリコーゲンの微細構造に関する情報が少ないですが、分岐の相対的な程度を簡単かつ迅速に測定できます。

Fermontら4は 、グリコーゲン粒子サイズと分岐の割合を反映する鎖長分布(CLD)を決定する方法である蛍光色素支援炭水化物電気泳動(FACE)の使用について説明しています。グリコーゲンの構造は細菌が飢餓から生き残る能力に影響を与え、異常なグリコーゲンはいくつかのグリコーゲン蓄積症に蓄積するため、この燃料源のサイズと分岐を研究する方法の重要性が浮き彫りになります。FACE には、8-アミノ 1,3,6 ピレン トリスルホン酸 (APTS) によるヘミアセタール基の還元的アミノ化が含まれます。FACEは、CLDに関する情報を提供するだけでなく、さまざまな供給源からの分岐酵素の触媒特性の測定にも役立ちます。主要な競合技術であるHPAEC-PADには、非還元端を必要としないという利点がありますが、この技術には質量バイアスの問題があります。

分岐の程度とグリコーゲン粒子のサイズはどちらもグルコースポリマーの重要な特性です。グリコーゲンは、複数のガンマ粒子(3 nm)を含む球状ベータ粒子(~20 nm)と、ベータ粒子で構成されるより大きなロゼット状のアルファ粒子(~300 nm)の3つの構造で存在することが電子顕微鏡を使用して観察されています5。グリコーゲン濃度を測定するには、グリコーゲンを単離する従来の方法で十分ですが、グリコーゲンの微細構造が損なわれるため、より穏やかな技術の開発が必要です。スクロース密度勾配遠心分離を使用した冷水抽出は、Wang、Wang et al.6によって細菌での使用について説明されています。この技術は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって測定されるより大きなグリコーゲン分子と、蛍光色素支援キャピラリー電気泳動(FACE)6によって測定されるより長い鎖の両方を保存する点で、他の方法よりも優れています。Wang、Liu et al.7 も同様の方法を肝臓に適用しています。グリコーゲン構造を理解することの重要性は、糖尿病では肝臓グリコーゲンアルファ粒子が「壊れやすい」ため、安定したアルファ粒子に比べて分解が速くなり、血糖コントロールに影響を与える可能性があることを示す最近の報告によって実証されています。これらのスクロース勾配ベースの単離方法の限界には、スクロース濃度を下げることで軽減できる上清中のグリコーゲンの損失、および使用される穏やかな条件によるグリコーゲンの一部の酵素分解が含まれます。後者は、関連するタンパク質を破壊しますが、短い沸騰ステップによって軽減されます。

最後に、Jensenら8は 、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して、単一の骨格筋線維におけるグリコーゲンの細胞内分布と粒子サイズを画像化する方法について説明しています。この方法は、筋膜下、筋原線維間、および筋原線維内グリコーゲンプールの調査に利用できる唯一の方法であり、さまざまな動物の筋肉組織に使用されています。一部の細胞内プロセスではグリコーゲンを燃料として優先的に利用するため、これらの燃料貯蔵庫の位置を特徴付けることが重要です。さらに、この方法は、疲労が特定の繊維のみでグリコーゲンに依存する運動において重要な、異なる筋繊維タイプのグリコーゲン代謝を調べる機能を提供します。TEM法の1つの制限は、小さなグリコーゲン粒子を検出できないことであり、これは特に筋肉の収縮中など、グリコーゲンが分解されている状態で懸念されます。

結論として、このメソッドコレクションは、グリコーゲンの構造と、この高分子の同化作用と異化作用を調節する酵素を調べるために使用される技術のサンプルを提供します。これらの方法は、生理学的状態と病理学的状態の両方におけるグリコーゲン代謝の理解を深めるのに役立ちます。

開示事項

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著者は開示するものは何もありません。

謝辞

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著者は確認されていません。

参考文献

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  1. Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
  2. Pederson, B. A. Mammalian Glycogen Metabolism: Enzymology, Regulation, and Animal Models of Dysregulated Glycogen Metabolism. Enzymology of Complex Alpha-Glucans. , CRC Press. Baca Raton. First edition 84-137 (2021).
  3. Wilson, W. A. Spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism. Journal of Visualized Experiments. (174), e63046(2021).
  4. Fermont, L., Szydlowski, N., Colleoni, C. Determination of glucan chain length distribution of glycogen using the fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) method. Journal of Visualized Experiments. (181), e63392(2022).
  5. Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
  6. Wang, J. J., et al. A non-degradative extraction method for molecular structure characterization of bacterial glycogen particles. Journal of Visualized Experiments. (180), e63016(2022).
  7. Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. The extraction of liver glycogen molecules for glycogen structure determination. Journal of Visualized Experiments. (180), e63088(2022).
  8. Jensen, R., Ortenblad, N., di Benedetto, C., Qvortrup, K., Nielsen, J. Quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e63347(2022).

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Spectrophotometric MethodsBacterial Glycogen ParticlesLiver Glycogen ExtractionGlycogen Structure DeterminationSubcellular Glycogen DistributionSkeletal Muscle FibersTransmission Electron MicroscopyGlucan Chain Length DistributionFluorophore assisted Carbohydrate Electrophoresis

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