方法論記事

バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

DOI：

10.3791/65032

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2023年3月17日

 ,  , 
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、生体適合性リポソームを生成するためのマイクロ流体技術であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)を記載する。OLAは、効率的なカプセル化を備えた単分散のミクロンサイズのリポソームを生成し、即時のオンチップ実験を可能にします。このプロトコルは、合成生物学および合成細胞研究に特に適していると期待されています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マイクロフルイディクスは、制御されたハイスループットな方法でさまざまな種類の液滴や小胞を生成するために広く使用されているツールです。リポソームは、脂質二重層に囲まれた水性内部で構成される単純な細胞模倣物です。それらは、合成細胞を設計し、 in vitro 方式で生物学的細胞の基礎を理解する上で価値があり、治療用途の貨物輸送などの応用科学にとって重要です。この記事では、単分散でミクロンサイズの生体適合性リポソームを製造するためのオンチップマイクロ流体技術であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)の詳細な作業プロトコルについて説明します。OLAは、内水(IA)相と周囲の脂質担持1-オクタノール相が界面活性剤を含む外液流によって挟まれる気泡吹きと同様に機能します。これにより、オクタノールポケットが突出した二重エマルジョン液滴が容易に生成されます。脂質二重層が液滴界面で集合すると、ポケットは自発的に剥離し、さらなる操作および実験の準備ができている単層リポソームを生じさせる。OLAは、安定したリポソーム生成(>10 Hz)、生体材料の効率的なカプセル化、単分散リポソーム集団など、いくつかの利点を提供し、貴重な生物学的製剤を扱う際に重要な非常に少量のサンプル(~50 μL)を必要とします。この研究には、ラボでOLA技術を確立するために必要な微細加工、ソフトリソグラフィ、および表面パッシベーションの詳細が含まれています。原理実証合成生物学の応用は、膜貫通プロトンフラックス を介して リポソーム内の生体分子凝縮物の形成を誘導することによっても示されています。この付随するビデオプロトコルは、読者がラボでOLAを確立してトラブルシューティングすることを容易にすることが期待されています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

全ての細胞はそれらの物理的境界として原形質膜を有し、そしてこの膜は本質的に両親媒性脂質分子の自己組織化によって形成される脂質二重層の形態の足場である。リポソームは、生物学的細胞の最小合成対応物です。それらはリン脂質で囲まれた水性内腔を有し、リン脂質は親水性の頭部基が水相に面し、疎水性の尾部が内側に埋もれている脂質二重層を形成する。リポソームの安定性は、疎水性効果、極性基間の親水性、疎水性カーボンテール間のファンデルワールス力、および水分子と親水性ヘッド間の水素結合によって支配されます1,2。脂質二重層の数に応じて、リポソームは、単一の二重層からなる単層小胞と複数の二重層から構築された多層小胞の2つの主要なカテゴリーに分類することができる。単層小胞は、そのサイズに基づいてさらに分類されます。典型的には球形であり、小さな単層小胞(SUV、直径30〜100 nm)、大きな単層小胞(LUV、直径100〜1,000 nm)、そして最後に巨大な単層小胞(GUV、直径>1,000 nm)を含むさまざまなサイズで製造できます3,4。リポソームを製造するために様々な技術が開発されており、これらはバルク技術5とマイクロ流体技術6に大きく分類することができる。一般的に実施されているバルク技術には、脂質膜の再水和、電鋳、反転エマルジョン転写、および押出7、8、9、10が含まれます。これらの技術は比較的単純で効果的であり、合成生物学コミュニティで広く使用されている主な理由です。しかしながら、同時に、それらは、サイズの多分散性、ラメラリティーに対する制御の欠如、および低いカプセル化効率に関して大きな欠点に苦しんでいる7,11。連続液滴界面交差カプセル化(cDICE)12や液滴撮影およびサイズろ過(DSSF)13などの技術は、これらの制限をある程度克服します。

マイクロ流体アプローチは、過去10年間で注目を集めています。マイクロ流体技術は、特徴的な層流と拡散が支配的な物質移動により、ユーザー定義のマイクロチャネル内の流体の流れを操作するための制御可能な環境を提供します。結果として得られるラボオンチップデバイスは、サンプル量を大幅に削減し、マルチプレックス機能を備え、分子の時空間制御に独自の可能性を提供します14。パルス噴射15、ダブルエマルジョンテンプレート16、一過性膜排出17、液滴エマルジョン転写18、および流体力学的焦点化19を含む、リポソームを作製するための多数のマイクロ流体法が開発されている。これらの技術は、高いカプセル化効率と高いスループットを備えた単分散の単層細胞サイズのリポソームを生成します。

この記事では、流体力学的ピンチオフとそれに続く溶媒デウェッティングメカニズム20に基づくオンチップマイクロ流体法であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)の手順について詳しく説明します(図1)。OLAの働きを泡を吹くプロセスに関連付けることができます。6方向ジャンクションは、内水(IA)相、2つの脂質担持有機(LO)ストリーム、および2つの界面活性剤含有外水性(OA)ストリームを1つのスポットに集中させます。これにより、水中水(脂質+オクタノール)の二重エマルジョン液滴が得られます。これらの液滴が下流に流れると、界面エネルギーの最小化、外部せん断流、およびチャネル壁との相互作用により、溶媒ポケットが剥離するにつれて界面に脂質二重層が形成され、単層リポソームが形成されます。オクタノールポケットのサイズに応じて、デウェッティングプロセスには数十秒から数分かかる場合があります。出口チャネルの終わりには、密度の低いオクタノール液滴が表面に浮遊しますが、より重いリポソーム(より高密度のカプセル化溶液による)は、実験の準備ができた視覚化チャンバーの底に沈みます。代表的な実験として、リポソーム内部の液-液相分離(LLPS)のプロセスが実証されています。そのためには、必要な成分がLLPSを防ぐ酸性pHでリポソーム内に封入されています。pH変化、したがって膜貫通プロトンフラックスを外部から引き起こすことによって、相分離凝縮液滴がリポソーム内部に形成される。これは、OLAシステムの効果的なカプセル化および操作機能を浮き彫りにします。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. マスターウェーハの作製

  1. 直径4インチ(10 cm)のクリーンシリコンウェーハを用意します( 材料の表を参照)。加圧空気を使用してさらに清掃し、ほこりの粒子を取り除きます。
  2. ウェーハをスピンコーターにマウントし、ウェーハの中央に~5 mLのネガフォトレジスト( 材料表を参照)を静かに分注します。気泡はウェーハの下流の印刷プロセスを妨げる可能性があるため、避けてください。
  3. 厚さ10μmのフォトレジスト層を得るには、ウエハを500rpmで30秒間、加速100rpm/sでスピンコートして初期拡散を行い、続いて3,000rpmで60秒間スピンし、加速度500rpm/sでスピンします。別の厚さが必要な場合は、製造元の指示に従って回転パラメータを変更してください。
  4. ウェーハを加熱プレートで65°Cで2分間、次に95°Cで5分間焼きます。
  5. ウェーハが冷えたら、直接描画光露光装置の印刷室にウェーハを取り付け( 材料表を参照)、OLA設計(図2A、 補足コーディングファイル1)をソフトウェアに送ります。
    注:OLA設計は、基本的に2つのOAチャネル、2つのLOチャネル、および1つのIAチャネルで構成され、これらがマージされて6方向ジャンクションを形成し、ポストプロダクションチャネルとして継続し、実験井(EW)に到達します。
  6. UVレーザー( 材料表を参照)を使用して、300 mJ / cm2の線量でコーティングされたウェーハにOLAデザインを印刷します。
  7. デザインが印刷されたら、ウェーハを65°Cで1分間焼き、続いて95°Cで3分間焼きます。
  8. この時点で、印刷されたデバイスの輪郭がウェーハに表示され、肉眼で見えることを確認します。未硬化のフォトレジストを洗い流すには、未硬化のフォトレジストが完全に除去されるまで、現像液( 材料の表を参照)を含むガラスビーカーにウェーハを浸します。
    メモ: 現像液の処理が過剰になると、デザインの解像度に影響を与える可能性があります。
  9. ウェーハをアセトン、イソプロパノール、脱イオン(DI)水で順に洗浄し、最後にブローガンを使用して加圧空気/N2 で洗浄します。
  10. ウェーハを150°Cで30分間ハードベークして、印刷されたデザインがウェーハ表面にしっかりと付着し、下流の製造プロセスで剥がれないようにします。その後、マスターウェーハをさらに使用する準備が整います(図2B)。

2. マイクロ流体デバイスの準備

  1. マスターウェーハを正方形のアルミニウム片の上に置き、アルミホイルをウェーハに巻き付けて、ウェルのような構造を形成します(図2C)。
  2. 40 gのポリジメチルシロキサン(PDMS)と4 gの硬化剤(10:1、重量比、 材料表を参照)を50 mLの遠沈管で測定し、スパチュラまたはピペットチップを使用して2〜3分間激しく混合します。
  3. PDMSと硬化剤を激しく混合することで、混合物内に気泡を閉じ込めます。チューブを100 x g で2〜3分間回転させて、大きな気泡の大部分を取り除きます。
  4. ステップ2.3で調製した混合物を約15〜20 gのマスターウェーハに注ぎ、デシケーターを使用して脱ガスします。余分な混合物を保存して、PDMSコーティングされたスライドガラスを作成します(ステップ3)。
  5. アセンブリを70°Cのオーブンで少なくとも2時間インキュベートします。
  6. マスターウェーハをオーブンから取り出し、冷まします。固化したPDMSブロックを取り外すには、アルミホイルを取り外し、ウェーハの端からPDMSブロックを慎重に剥がします。
    注意: ウェーハは壊れやすく、破損する可能性があるため、このプロセスを慎重に行うことが重要です。
  7. PDMSブロックを取り外したら、パターン化された構造を上向きに保ち、鋭利な刃またはメスを使用して、それぞれが単一のマイクロ流体デバイスを含む個々のPDMSブロックを切断します。
  8. PDMSブロックを暗い表面に置き、光の方向を調整して(これにはテーブルランプが便利です)、刻まれたチャンネルが光沢があり、その結果、見えるようにします。直径0.5 mmと3 mmの生検パンチを使用して、入口と出口チャネルに穴を開けます( 材料の表を参照)。
    注意: 後で漏れを引き起こす可能性のあるPDMSの亀裂を避けるために、鋭い生検パンチを使用してください。生検パンチをPDMSブロックにそっと押し込み、完全に通過することを確認します。生検パンチを取り外すには、交互方向に回転させながらゆっくりと引っ込めます。これで、OLAデザインが刻印されたPDMSブロックをPDMSコーティングされたスライドガラスにバインドする準備が整いました。

3. PDMSコーティングされたスライドガラスを作る

  1. 透明なガラスカバーガラスを取り、約0.5 mLのPDMS(ステップ2.4で過剰に調製)をスライドガラスの中央に注ぎ、スライドガラスを軽く傾けてカバーガラス全体に広げ、PDMSでスライドガラスを完全にカバーします。
  2. スライドガラスをスピンコーターに取り付け、スライドの中央に配置されていることを確認し(スライドの中央が圧力シャフトの中心と重なるように)、スライドガラスを500 rpmで15秒間(100 rpm / s刻み)、次に1,000 rpmで30秒間(500 rpm / sの増分で)回転させます。
  3. PDMSコーティングされたスライドガラス(コーティングされた面が上向き)を、蓋をしたシャーレ内のPDMSのブロック(1cm×1cm)のような隆起したプラットフォームに置き、70°Cで2時間焼きます。

4. マイクロ流体デバイスの接合

  1. 市販のスコッチテープ( 材料表を参照)を2回貼り付けて取り外して、PDMSブロック(手順2で準備)を清掃します。使用するまで、清掃した面を上に向けてください。
  2. PDMSコーティングされたスライドガラスをブローガンを使用して加圧空気/ N2で清掃し、清浄面を上に向けてください。
  3. PDMSブロック(彫刻されたチャネルを上向き)とPDMSコーティングされたスライドガラス(コーティングされた側を上向き)をプラズマクリーナーの真空チャンバーに配置します( 材料の表を参照)。
  4. 真空のスイッチを入れ、内容物を12 MHzの無線周波数(RFモードハイ)の空気プラズマに15秒間さらして、表面をアクティブにします。酸素プラズマはピンクがかった色合いの形で見ることができます。
  5. プラズマ処理の直後に、PDMSコーティングされたスライドガラスを、PDMS側を上に向けてきれいな面に置きます。マイクロ流体パターンをPDMSコーティングされたスライドガラスに向けてPDMSブロックをそっと置き、接着させます(図2D)。
    注意: デバイスに閉じ込められた空気を取り除くことは、完全な接着を確実にするために重要です。
  6. 接合したデバイスを70°Cで2時間焼きます。

5. マイクロ流体デバイスの表面機能化

注意: 表面機能化の前に、メーカーのプロトコルに従って圧力ポンプを校正し( 材料表を参照)、チューブを組み立ててマイクロ流体デバイスに接続することが重要です。

  1. マイクロ流体デバイスを圧力ポンプに接続する
    1. 圧力駆動フローコントローラを外部圧力源(最大6バール)に接続します。少なくとも4つの独立した空気圧チャネルが必要です:0-2バールの3つの個別モジュール、および-0.9-4バールの1つのモジュール。
    2. メーカーのプロトコルに従って圧力ポンプを校正します(材料表を参照)。
    3. チューブ(外径1/16 x 内径0.02)を長さ約20cmの同じサイズの4つにカットします。
    4. 各部品の一方の端に23Gステンレス鋼の90°曲げコネクタ( 材料表を参照)を挿入します。この端部は、後でマイクロ流体デバイスの3つの入口(OA、LO、およびIA)に挿入され、4番目の端部は過剰な溶液を除去するために使用される(ステップ5.2.5)。
    5. チューブのもう一方の端をマイクロ流体リザーバースタンドに挿入し、マイクロ流体フィッティングを使用してシールし、チューブがリザーバーの底に触れるのに十分な長さであることを確認します(1.5 mLチューブ、 材料の表を参照)。これにより、PVA処理/リポソーム製造中に不要な気泡がマイクロ流体デバイスに入るのを防ぎます。
  2. 出口チャネルのPVA処理
    注:リポソーム生成の前に、デバイスを生産接合部の下流で部分的に親水性にすることが重要です。これは、これらのチャネルを5%(w / v)ポリビニルアルコール(PVA)溶液で処理することによって行われます。PVA溶液は、PVA粉末( 材料の表を参照)を水に溶解し、マグネチックスターラーを用いて絶えず攪拌しながら80°Cで3時間調製する。表面処理に使用する前に溶液をろ過してください。デバイスの結合直後、マイクロ流体チャネルはプラズマ誘発表面活性化のために親水性であり、それらは徐々に再び疎水性になる。PVA処理を開始する前に、ベーキング後2時間待つことをお勧めします(ステップ4.6)。
    1. 200 μLの5%w/v PVA溶液を1.5 mLチューブに分注し、マイクロ流体リザーバースタンドに接続します。一方の端がPVA溶液に沈められ、もう一方の端がマイクロ流体デバイスのOAチャネルの入口に接続されるように、チューブ(ステップ5.1.3で説明したもの)を挿入します。
      注意: PVA濃度が低いと、表面機能が標準以下になる可能性があります。
    2. PVAなしで上記の手順を繰り返し(空の1.5 mLチューブ)、LOおよびIAチャンネルに接続します。
    3. OA相の圧力を100mbarに上げて、PVA溶液をOAチャネルに流します。IA相とLO相の圧力を120mbarに上げて、これらのチャネル内のPVA溶液の逆流を防ぎます(図2E)。
      注意: 必要に応じて、メニスカスを生産ジャンクションで安定させるために、個々のチャネルの圧力を調整します。
    4. この方法でPVA溶液を約5分間流し、出口チャネルの完全な機能化を保証します。
    5. PVA溶液を取り外すには、チューブをOAインレットから取り外し、すぐにLOおよびIAチャネルの圧力を2バールに上げます。同時に、負圧チャネル(-900 mbar)に接続されたチューブを使用して、最初に出口チャネルから余分なPVAを除去し、次にOA入口から除去します(図2F)。
    6. デバイスを120°Cで15分間焼き、冷ましてから使用します。デバイスは、周囲条件下で少なくとも1か月間保管できます。
      注:プラズマ処理後に未処理のPDMSが疎水性を取り戻すことを確認するために、OLAに進む前に1日(室温)待つことをお勧めします。

6.オクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)

  1. 脂質ストックの準備
    注:ここでは、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)と1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(リッサミンローダミンBスルホニル)(リスロードPE)脂質の混合物( 材料の表を参照)が例として使用されます。ユーザーは、同様の方法で必要な脂質組成を準備する必要があります。
    1. 76 μLのDOPC(25 mg / mL)と16.6 μLのリスロードPE(1 mg / mL)を別々のガラスシリンジを使用して丸底フラスコに分注します。
    2. 丸底フラスコを直立させ、圧縮されたN2ブローガンを使用して穏やかな窒素の流れを与え、クロロホルムを蒸発させ、フラスコの底に乾燥した脂質膜を形成します。
    3. フラスコをデシケーターに連続真空下で少なくとも2時間置き、残っているクロロホルムを取り除きます。
    4. 100 μLのエタノールを丸底フラスコに加え、その後、穏やかなピペッティングまたは振とうを行って、脂質が溶解して10%(w / v)の脂質ストックを形成することを確認します。
      注:特定の脂質組成がエタノールに完全に溶解しない場合は、クロロホルムの量をできるだけ少なくして、エタノール/クロロホルム混合物を使用してください。
    5. 溶液を暗いガラスバイアルにピペットで入れます。ブローガンを使用してバイアルを窒素で静かに洗い流し、空気を不活性雰囲気に置き換えます。蓋をパラフィンフィルムで密封し、-20°Cで保存します。
      注:ストック溶液は最大数か月間使用できます。バイアルを開けるたびに、空気を窒素で静かに交換し、パラフィンフィルムで蓋をして再密封します。
  2. OLA ソリューションの準備
    1. 必須成分のストック溶液を作る:20 mMデキストラン(Mw 6,000);60%(v / v)グリセロール;選択したバッファー。このとき、5xリン酸緩衝生理食塩水(0.68M NaCl、13.5mM KCl、50mM Na2HPO4、9mM KH2PO4;pH 7.4)を調製した(材料の表を参照されたい)。
      注:純粋なグリセロールは粘性が高いため、効果的なピペッティングのために、ピペットチップの端にある小片を斜めに切り取ることをお勧めします。
    2. 100 μLのIA、OA、および出口溶液(ES、EWを満たすための目的の溶液)サンプルを調製します。視覚化を容易にするために、黄色蛍光タンパク質(YFP)をこの特定のケースでIA溶液に添加した。カプセル化された成分の浸透圧を計算し、必要に応じてOAに適量の砂糖または塩を添加することにより、IAとOAの間の浸透圧バランスを確認します。これは、生産中のリポソームの破裂または収縮を防ぐために行われる。
      注:3つのフェーズの最終的な構成は次のとおりです。
      IA: 15% グリセロール, 5 mM デキストラン (Mw 6,000), 5.4 μM YFP, 1x PBS
      OA:15%グリセロール、5%F68界面活性剤、1x PBS
      ES:15%グリセロール、1x PBS
      F68界面活性剤の濃度が低いと、二重エマルジョンの生成に悪影響を及ぼします。
    3. 4 μLのストック脂質を76 μLの1-オクタノールにピペッティングして、80 μLのLO相を調製します( 材料表を参照)。DOPCの最終濃度は5 mg/mLです。
    4. マイクロ流体実験に進む前に、サンプルを700 x g で60秒間遠心分離して大きな凝集体を取り除きます。これにより、明らかな目詰まり要因がマイクロ流体チップに入るのを防ぎます。
  3. リポソーム生産
    1. 溶液(IA、LO、OA)を3本の1.5 mLチューブに分注し、組み立て(ステップ5.1で説明したように)、PVA処理されたマイクロ流体チップに接続します(ステップ5.2.6)。
    2. 3 つのチャネルに正圧を適用します: IA および LO チャネルでは ~100 mbar、OAチャネルでは~200 mbar。
      注:OA圧力は他のものよりも高いため、OAソリューションが最初にEWに到着します。これを強くお勧めします。
    3. OAソリューションがEWに到達したら、OA圧力を100mbarに下げ、LOを200mbarに上げます。 生産ジャンクションに到着するLOソリューションは、LOチャネルから空気が置換されるため、気泡が発生する可能性があります。気泡がEWに分配されたら、LO圧力を100mbarに調整します。最後に、IA圧力を200 mbarに上げ、IAチャネル内のすべての空気が除去されるまで待ちます。したがって、3つのフェーズの接合部に到達する理想的なシーケンスは、OA、LO、およびIAです。
    4. 3つのチャンネルから空気を除去した後、すべてのチャンネル圧力を50 mbarに調整し、10 μLのESを出口チャンバーにピペットで入れます。ESをピペッティングした後、蒸発を避けるために出口穴にカバースライドを置きます。LOが押し戻された場合は、LO圧力が接合部に流れ始めるまで、LO圧力を1mbar刻みで徐々に上げます。
    5. 3つの相すべてが接合部で共流し始めたら、二重エマルジョンの生成が開始されることを確認し、その品質に応じて調整します(図3A-C)。チャネル内の不要な詰まりを排除するために圧力が変更されていない限り、圧力を突然ではなく徐々に(0.1〜1 mbarのステップで)変更します。
      注意: 調整するチャネルは、ジャンクションで何が起こっているかによって異なります。たとえば、エマルジョンが大きすぎる場合はIAを減らす必要があります。二重エマルジョンが形成されても、挟まれる代わりに破裂する場合は、OAを増やす必要があります。オクタノールポケットが大きすぎる場合は、LOを減らす必要があります。
    6. ダブルエマルジョン液滴がEWの下流に流れることを確認します。それらが流れるにつれて、オクタノールポケットはますます目立つようになり、最終的につまんでリポソームを形成します(図3D-F)。ポストプロダクションチャネルが十分に長く、ダブルエマルジョンの移動がデウェッティングに十分遅いことを確認してください。
      注:適切な生産後数分以内に、リポソームとオクタノール液滴はポストプロダクションチャネルを出てEWに入ります。その結果、水よりも密度が低いため、オクタノール液滴はESの表面に浮遊します。IAにデキストランが添加されているため、リポソームは周囲よりも重く、チャンバーの底部に行き、観察とさらなる操作の準備が整います。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、代表的な実験として、リポソーム内の液-液相分離(LLPS)プロセス を介した 膜のない凝縮物の形成を実証しています。

サンプル調製
IA、OA、ES、およびフィード溶液(FS)は、次のように調製されます。

IA: 12% グリセロール、5 mM デキストラン、150 mM KCl、5 mg/mL ポリ L-リジン (PLL)、0.05 mg/mL ポリ-L-リジン-FITC標識 (PLL-FITC)、8 mM アデノシン三リン酸 (ATP)、15 mM クエン酸塩酸塩 (pH 4)

OA: 12% v/v グリセロール, 5% w/v F68, 150 mM KCl, 15 mM クエン酸塩酸塩 (pH 4)

ES: 12% グリセロール, 150 mM KCl, 15 mM クエン酸塩酸塩 (pH 4)

FS: 12% グリセロール, 150 mM KCl, 75 mM トリス塩酸塩 (pH 9)

リポソーム内部での凝縮物形成
正に帯電したポリ-L-リジン(PLL)と負に帯電した多価アデノシン三リン酸(ATP)のpH感受性複合コアセルベーションの簡単なアッセイを選択して、リポソームにおけるLLPSの現象を実証しました。カプセル化中のポリリジンとATPの相分離を防ぐために、溶液のpHはATPが中性である4に維持した。FS(pH9の緩衝液)を添加してESのpHを上昇させると、膜貫通プロトンフラックスによりリポソーム内のpHが上昇し、ATPが負に帯電し、正に帯電したPLL21との相分離が引き起こされます(図4A)。リポソーム生成の約2時間後、IAおよびLO圧力をオフにした。OAチャネル圧力を100mbarに保ち、残りのリポソームをゆっくりと観察チャンバーに流した。チャネル内のすべてのリポソームがEWで回収されると、圧力をオフにして流れを停止し、リポソームが動くのを防ぎます。より低いpHで生成されたリポソームは、それらの内腔に均一な蛍光(カプセル化された蛍光PLL-FITCから)を示しました(図4B、D)。表面に浮遊するオクタノール液滴は、さらなるピペッティングステップに影響を与えないように、上部から5 μLの溶液を慎重にピペッティングすることによって除去されました。続いて、10 μLのFSバッファーをEWに添加し、カプセル化されたPLLとATPの相分離を誘導しました。各リポソームからの均一なFITC蛍光は、徐々に異なる蛍光凝縮液滴に変換されました。最終的に、個々の液滴は1つの大きな凝縮液滴に融合し、リポソーム内で自由に拡散しました(図4C、E-G)。

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図1:OLAの組み立てと動作を示す概略図。圧力コントローラは、外側の水性、オクタノール中の脂質、および内側の水溶液を含むリザーバーに接続されています。リザーバーに挿入されたチューブは、OLAデバイスのそれぞれの入口に接続されています。3つのチャネル内の適切な流れは、水中水(脂質-インオクタノール)-水中ダブルエマルジョンの形成につながります。形成された二重エマルジョンは出口ウェルに移動し、その間にオクタノールポケットが剥離してリポソームを形成する。形成されたリポソームは、可視化およびさらなる実験のためにウェルの底に集められる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:OLAチップの作製(フォトリソグラフィ、微細加工、表面処理)。 (A)3つの入口、出口、および6方向の生産ジャンクションを含む、OLA設計の主要な機能を示すデジタル設計。(B)UVリソグラフィを用いて作製した複数のOLA設計を示すマスターウェーハの概略図。(c)マスターウェーハ上にPDMSエラストマーをキャストし、アルミホイルで作成したウェルに入れ、70°Cで2時間焼成して硬化させる。 (d)酸素プラズマ処理を用いて接合されたマイクロ流体デバイスであって、OLA設計を含むPDMSブロックをPDMS被覆スライドガラスに取り付ける。(e)作製したチップの表面機能化により、デバイスを部分的に親水性にする。これは、外側の水性チャネルから出口チャネルに向かって5分間5%w / v PVAを流すことによって行われます。他のチャネルの正の空気圧は、PVAソリューションがこれらのチャネルに入るのを防ぎます。(f)出口チャネルに真空を印加することによりPVAを除去する。デバイスを120°Cで15分間焼き、すぐに使用できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:OLAが単分散二重エマルジョンを効率的に生成し、最終的にはカプセル化に優れたリポソームを生成することを実証。 (A)二重エマルジョン液滴の急速な生成を示す明視野画像。(B)蛍光脂質チャネルは、部分的な脱湿によるオクタノールポケットの形成を示す。脂質インオクタノール相には、DOPC(5 mg/mL)とLis Rhod PEが1,000:1の比率で混合されていました。(c)黄色蛍光タンパク質(YFP)の封入を示す内水チャネル。(A-C)の挿入図は、それぞれのパネルの代表的なズームインビューを示しています(スケールバー= 10 μm)。(D-F)出口チャネルにおけるオクタノールポケットの脱湿は、リポソームを形成する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:リポソーム内のpLL/ATPのpHトリガー液-液相分離。 (A)リポソーム内に封入されたpLLとATPの均一溶液(左)から相分離したpLL/ATPコアセルベート(右)へのpH依存的な移行の模式図。リポソーム内の初期の酸性環境は、ATPの分子電荷を中性にし、コアセルベーションを阻害します。リポソーム内のpHが外部から加えられたpH上昇と平衡化すると、ATPは負電荷を獲得し、コアセルベーションを引き起こします。(B-C)pLL(緑チャンネル)とメンブレン(赤チャンネル)の空間分布を示す折れ線グラフ(それぞれパネル[D]と[G]の点線に対応)。(D-G)リポソーム内のpLL/ATPコアセルベートの形成を示すタイムラプス画像。塩基性バッファーの外用添加は、数分かけてリポソーム内のpHレベルを上昇させ、コアセルベーションを開始します。t=0分は、最初のコアセルベーション事象の発生直前の時間を指す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル1:OLAデザインのCADファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

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細胞の複雑さは、全体として研究した場合、生細胞を理解することを非常に困難にします。in vitroで主要成分を再構成することによって細胞の冗長性と相互接続性を減らすことは、生物学的システムの理解を深め、バイオテクノロジーアプリケーションのための人工細胞模倣物を作成するために必要です22,23,24。リポソームは、細胞現象を理解するための優れた最小限のシステムとして機能します。これらの現象の非網羅的なリストは、細胞骨格動態および結果として生じる膜変形25,26、生体分子凝縮物27,28の時空間調節およびそれらの膜との相互作用29、無細胞転写翻訳系30、無細胞脂質合成31、およびタンパク質の進化32を含む多種多様な生体分子のカプセル化を含み、33,34。リポソームは、薬物送達の担体としても広く使用されており、食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁(EMA)によって臨床使用が承認されています11。リポソームおよび脂質ベースのナノ粒子は、最近のCOVID-19ワクチン35のようなmRNAワクチンを含む薬物送達の担体として使用される。

この研究では、オンチップリポソームを生成するためにOLA技術を実行するためのフォトリソグラフィ、マイクロ流体アセンブリ、および表面機能化に関する詳細なプロトコルについて説明します(図1 および 図3)。OLAを使用して製造されたリポソームは、単分散(変動係数:平均の4%〜11%)および生物学的細胞サイズ範囲(典型的には直径5〜50μmの間)にあり、それらは、内側および外側の水性チャネル36の適切な流速を使用して調整することができる。例えば、 図1に見られるリポソーム集団は、23.3μm±1.8μm(n =50)のサイズ分布を有する。10〜30Hzの典型的な産生速度で、形成されたリポソームは、単一の二重層特異的膜貫通タンパク質、α-ヘモリシン36を膜に挿入することによって、ならびにジチオン酸漂白アッセイ37を使用することによって以前に確認されたように、単層である。OLAは、さまざまな脂質組成とも互換性があり、脂質の選択に柔軟性を提供します。重要なことに、最初に使用された脂質組成物は、最終的なリポソーム組成物38に反映される。

比較的新しいテクノロジーであるため、OLAを改善する余地はさらにあります。たとえば、PVAを使用した表面機能化は非常に重要ですが、実行するのは面倒です。デバイスを表面機能化するためのより簡単で簡単な方法は、チップ製造時間とチップ間のばらつきを大幅に削減します。プルロニックF68界面活性剤は、二重エマルジョンを最初に安定化させるための外水相の重要な成分です。それにもかかわらず、その使用は特定の場合に制限される可能性があります。Pluronic F68をより生体適合性の高い界面活性剤に置き換えるか、界面活性剤を完全に除去することで、システムの汎用性が向上する可能性があります。出口チャネルで生成された二重エマルジョンの移動中に、それらはせん断のために破裂する可能性があります。OLA設計をアップグレードして二重エマルジョンの安定性とオクタノールポケット分離を改善すると、スループットが向上する可能性があります。それにもかかわらず、OLAには、主に効率的なカプセル化、単分散および単層リポソーム、および制御されたオンチップ実験を含むいくつかの利点があります。

OLAは、リポソーム39の成長と分裂、液液相分離のプロセス27とその膜21との相互作用の研究、リポソーム40における細菌増殖バイオ産物形成の理解など、さまざまな研究で採用および適応されています。OLAベースのハイスループットアッセイは、膜41を横切るイオン輸送および脂質二重層37を横切る薬物透過性を理解するために、治療目的のための薬物送達システムとして42、膜43に対する抗菌剤の効果を研究するため、および液晶44を封入するためのツールとしても使用されている。OLA技術の幅広い用途に加えて、特定の目的に適したOLAの修正バージョンが開発されています45,46,47,48,49,50。全体として、長所と短所を考慮すると、OLAは合成生物学の用途の広いプラットフォームであると強く信じています。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ドルフ・ヴァイヤーズ、ヴェラ・ゴレロワ、マーク・ルーシェンがYFPを提供してくれたことに感謝します。S.D.は、オランダ研究評議会からの財政的支援を認めています(助成金番号:OCENW。クライン.465)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1-OctanolSigma-AldrichNo. 297887
1.5 mL チューブFisher scientific10451043Eppendorf 3810X ポリプロピレン微量遠心チューブ
ATPSigma-AldrichNo. A2383
バイオプシーパンチダーウィンマイクロフルイディクスPT-T983-05直径 0.5 mm および 3 mm
エン酸塩ベースSigma-AldrichNo. 71405
デキストランSigma-AldrichNo. 31388Mr~6,000
ダイレクトライト光リソグラフィー装置Durham Magneto Optics LtdMicroWriter ML3 Babysetup and software
DOPC lipidAvantiSKU:850375C
F68Sigma-AldrichNo. 24040032
ガラスカバースリップコーニング#1, 24 x 40 mm
グリセロールSigma-AldrichNo. G2025
塩酸Thermo Scientific AcrosNo. 124630010
Liss Rhod PE 脂質AvantiSKU:810150C
ParafilmSigma-AldrichNo. P7793
PhotoresistMicro resist technology GmbHEpoCore 10
フォトレジスト現像液マイクロレジストテクノロジーGmbHmr-Dev 600
プラズマクリーナーハリック プラズマPDC-32G
ポリジメチルシロキサンダウシルガード 184PDMS および硬化剤
ポリ-L-リジンSigma-AldrichNo. P7890
ポリ-L-リジン–FITCラベル:Sigma-AldrichNo. P3543
Polyvinyl alcoholSigma-AldrichNo. P8136分子量:30,000–70,000、87%–90%加水分解圧力
コントローラーElveflow OBK1 Mk3 +フローコントローラー
スコッチテープマジックテープ 見えないマットテープ
シリコンウェーハシリコン材料0620R16002
スピンコーター ローレル・テクノロジーズ・コーポレーションWS-650MZ-23NPP
型 ステンレス鋼 90°C;曲がったPDMSカプラーダーウィンマイクロ流体工学PN-BEN-23G
トリスベースシグマアルドリッチNo.252859
タイゴンチューブダーウィンマイクロ流体工学1/16 "OD×0.02"ID
紫外線レーザー 波長365nm
ク

参考文献

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