方法論記事

蛍光活性化核ソーティングを用いた脂肪組織を用いた脂肪細胞特異的ATAC-Seq

DOI：

10.3791/65033

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2023年3月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Indiana University School of Medicine

この記事について

サマリー

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トランスジェニックレポーターマウスから単離された脂肪組織との核ソーティングを使用して、脂肪細胞上で特異的にトランスポザーゼアクセス可能なクロマチン(ATAC-seq)を核蛍光標識でアッセイするためのプロトコルを紹介します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ハイスループットシーケンシングによるトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイ(ATAC-seq)は、ゲノムワイドなクロマチンアクセシビリティプロファイリングを可能にする堅牢な技術です。この技術は、さまざまな生物学的プロセスにおける遺伝子発現の制御メカニズムを理解するのに役立っています。ATAC-seqはさまざまな種類のサンプルに対して修飾されていますが、脂肪組織に対するATAC-seq法の効果的な修飾はありませんでした。脂肪組織の課題には、複雑な細胞の不均一性、大きな脂質含有量、および高いミトコンドリア汚染が含まれます。これらの問題を克服するために、トランスジェニックレポーターの核タグ付けおよび翻訳リボソームアフィニティー精製(NuTRAP)マウスの脂肪組織との蛍光活性化核ソーティングを使用することにより、脂肪細胞特異的ATAC-seqを可能にするプロトコルを開発しました。このプロトコルは、核入力と試薬の量を減らしながら、無駄なシーケンシングリードを最小限に抑えて高品質のデータを生成します。この論文は、マウス脂肪組織から分離された脂肪細胞核の使用について検証されたATAC-seq法の詳細なステップバイステップの説明を提供します。このプロトコルは、多様な生物学的刺激による脂肪細胞のクロマチン動態の調査に役立ち、新しい生物学的洞察を可能にします。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂質分子の形で余分なエネルギーを蓄えることに特化した脂肪組織は、代謝調節の重要な器官です。脂肪細胞の形成と維持の厳密な制御は、脂肪組織の機能と全身のエネルギー恒常性に不可欠です1。多くの転写調節因子は、脂肪細胞の分化、可塑性、および機能の制御において重要な役割を果たします。これらの調節因子のいくつかは、ヒトの代謝障害に関与しています2,3。遺伝子発現およびエピゲノム解析のためのハイスループットシーケンシング技術の最近の進歩により、脂肪細胞生物学の分子調節因子の発見がさらに促進されました4。脂肪組織を用いた分子プロファイリング研究は、これらの組織の不均一性のために実施が困難です。脂肪組織は主に脂肪貯蔵を担う脂肪細胞で構成されていますが、線維芽細胞、内皮細胞、免疫細胞など、他のさまざまな細胞タイプも含まれています5。さらに、脂肪組織の細胞組成は、温度や栄養状態などの病態生理学的変化に応じて劇的に変化します6。これらの問題を克服するために、私たちは以前に、GFPタグ付きリボソームとmCherryタグ付きビオチン化核をCreリコンビナーゼ依存的に生成するトランスジェニックレポーターマウス「核タグ付けおよび翻訳リボソームアフィニティー精製(NuTRAP)」を開発しました7。二重標識システムにより、組織を用いて細胞種特異的なトランスクリプトーム解析およびエピゲノム解析を行うことができます。脂肪細胞特異的アディポネクチン-Cre株(Adipoq-NuTRAP)と交配したNuTRAPマウスを使用して、in vivoで純粋な脂肪細胞集団からの遺伝子発現プロファイルとクロマチン状態を以前に特徴付け、肥満時にそれらがどのように変化するかを決定しました7,8。以前、茶色とベージュ色の脂肪細胞特異的Ucp1-Cre株(Ucp1-NuTRAP)と交配したNuTRAPマウスにより、温度変化に応答したまれな熱発生脂肪細胞集団であるベージュ脂肪細胞のエピゲノムリモデリングを特徴付けることができました9。

ATAC-seqは、ゲノム全体のクロマチンアクセシビリティを評価するために広く使用されている分析方法です。ATAC-seqで使用される超反応性Tn5トランスポザーゼは、核10のクロマチンアクセス可能な領域のシーケンシングアダプターにタグを付けることにより、開いたクロマチン領域の同定を可能にします。ATAC-seqはシンプルなメソッドですが、ロバストな結果が得られ、低インプットのサンプルでも非常に効率的です。したがって、それは最も人気のあるエピゲノムプロファイリング方法の1つになり、多様な生物学的文脈における遺伝子発現の制御メカニズムの理解に貢献してきました。オリジナルのATAC-seqプロトコルが作成されて以来、様々なタイプのサンプルに対してプロトコルを修正および最適化するために、様々なATAC-seq派生技術がさらに開発されてきた。例えば、Fast−ATACは血球サンプル11の分析用に設計されており、Omni−ATACは凍結組織サンプル12用に最適化されたプロトコルであり、MiniATAC−seqは初期段階の胚分析13に有効である。しかし、ATAC-seq法を脂肪細胞、特に組織サンプルに適用することは依然として困難です。脂肪組織の不均一性に加えて、その高い脂質含有量は、核単離後もTn5トランスポザーゼによる効率的な組換え反応を妨げる可能性があります。さらに、脂肪細胞、特に茶色とベージュ色の脂肪細胞における高いミトコンドリア含有量は、高いミトコンドリアDNA汚染と無駄なシーケンシングリードを引き起こします。この論文では、Adipoq-NuTRAPマウスを用いた脂肪細胞特異的ATAC-seqのプロトコルについて説明します(図1)。蛍光標識された核ソーティングを利用することにより、このプロトコルは、他の交絡細胞タイプから離れた脂肪細胞核の純粋な集団の収集と、脂質、ミトコンドリア、および組織破片の効率的な除去を可能にします。したがって、このプロトコルは、標準プロトコルと比較して少ない入力量と試薬を使用しながら、細胞タイプ固有の高品質データを生成し、ミトコンドリアリードからの無駄を最小限に抑えることができます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

動物の世話と実験は、インディアナ大学医学部の施設内動物管理および使用委員会によって承認された手順に従って実施されました。

1.実験開始前の準備

  1. ティッシュの準備
    1. 脂肪細胞の核標識のために、NuTRAPマウスを脂肪細胞特異的アディポネクチン-Cre株(Adipoq-Cre)と交配して、Adipoq-CreとNuTRAPの両方で半接合性であるAdipoq-NuTRAPマウスを作製します。
    2. 先に説明したようにAdipoq−NuTRAPマウスから目的の脂肪組織を解剖する14。
    3. 組織を液体窒素で急速凍結し、使用するまで-80°Cで保管します。
      注:各脂肪パッドは全体として保存することができ、凍結した組織は後でドライアイスで実験のためにより小さな断片(~50 mg)に切断することができます。あるいは、脂肪組織を切断し、分注し、チューブで凍結して保存することもできます(チューブあたり~50 mg)。凍結したサンプルは、凍結後、使用するまで解凍することはできません。
  2. バッファー調製
    注:実験中はバッファーを氷上に保ちます。
    1. 核調製バッファー(NPB)の調製:250 mM スクロース、10 mM HEPES(pH 7.5)、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、および0.1% NP40。サンプルあたり7 mLのNPBを調製します。使用前に、新鮮な100倍プロテアーゼ阻害剤カクテル(最終1倍)、DTT(最終1 mM)、およびヘキスト(最終1 μg/mL)をNPBに加えます。
      注:新鮮なNPBを準備することをお勧めしますが、4°Cで最大1か月間保存できます。
    2. 0.1%NP-40(PBS-N)を含む1xリン酸緩衝生理食塩水を調製します。

2.核の分離

  1. 氷上で、サンプルごとに1つのガラスのダウンスを備えたチルガラスダウンスホモジナイザー。次に、7 mLのNPBミックスを各ガラスのダウンスに加えます。
    注:各実験で最大8つのサンプルを使用することをお勧めします。8つ以上のサンプルを扱うと、すべてのステップが大幅に遅れ、特にソーティング中に核の品質が低下する可能性があります。
  2. 凍結脂肪組織(50〜100 mg)をグラスDounceに入れ、すぐに長いハサミを使っていくつかの小さな断片に切ります。すべてのサンプルについて緩い乳棒で10倍ストロークし、次にタイトな乳棒で10倍ストロークします。
    注:脂肪組織は柔らかいので、いくつかの小片に切るだけで十分です。まれなサンプルの場合、より小さな断片(10〜20 mg)を使用できますが、収集された脂肪細胞の核数は異なる場合があります。
  3. 100 μmストレーナーを通して新しい50 mLチューブにろ過します。ろ過したホモジネートを注いで新しい15 mLチューブに移します。スイングバケット遠心分離機で200 × g で4°Cで10分間回転します。上清をできるだけ取り除きます。
    注意: 最初に真空を使用して吸引し、次にマイクロピペットを使用して残りの容量を取り除きます。
  4. ペレットを500 μLのPBS-Nに、穏やかかつ徹底的なフィンガータッピングで再懸濁します。
    注意: ピペッティングは核を損傷する可能性があるため、避けてください。
  5. 穏やかなピペッティングを使用して、40 μmストレーナーを通して新しい50 mLチューブにろ過します。ストレーナーを250 μLのPBS-Nですすいでください。ろ過した核再懸濁液を、マイクロピペットを使用して蛍光活性化セルソーティング(FACS)チューブに移します。
    注:可能であれば、チューブとセルストレーナーを少量に使用して、サンプルの損失を最小限に抑えることができます。

3. 核選別

  1. 収集チューブの準備
    1. 500 μLのPBS-Nを新しい1.5 mLチューブに加え、数回反転させてすべての内面をバッファーで濡らします。
    2. チューブを短時間回転させてすべての液体を降ろし、選別するまで氷の上で冷やします。
  2. FACS(図2)
    1. シングレットにはFSC-A / FSC-Hゲーティングを使用し、大小の破片の除去にはFSC-A / SSC-Aを使用します。
    2. mCherry/GFP陽性脂肪細胞核集団のゲート。
    3. ステップ3.1で準備した各収集チューブに10,000個の核を採取します。
  3. 選別後の核調製
    1. 各回収チューブに500 μLのPBS-Nを加え、数回反転させて混合します。
    2. 収集チューブを200 × g で、スイングバケット遠心分離機で4°Cで10分間回転させます。上清を完全に除去する。
      注意: 最初に掃除機を使用して気泡を取り除き、上澄みを注ぎ、紙のワイプを使用して残りの液体を完全に取り除きます。この時点ではペレットは見えません。以下に説明するように、遠心分離ステップ中にTn5マスター混合物を調製する。

4. Tn5 タグメンテーション(表 1)

  1. 25 μLのTn5マスター混合物を調製するには、12.5 μLの2xタグメンテーションDNAバッファー(TDバッファー)、1.25 μLのTn5トランスポザーゼ(TDE I酵素)、および11.25 μLのヌクレアーゼフリー水を混合します。
  2. 25 μLのTn5マスター混合物を各核ペレットに加え、穏やかなピペッティングで再懸濁します。サーモミキサーを使用して、600rpmで37°Cで30分間インキュベートします。

5. DNA精製

注:次の手順では、 材料表に記載されているPCR精製キットを使用します。他の任意の同様のDNA精製方法を使用することができる。

  1. ステップ4.2の後に得られたTn5核再懸濁液の混合物25 μLに25 μLのヌクレアーゼフリー水を加えます。最終容量はサンプルあたり50μLです。
  2. 250 μLのバッファーPBを追加します。
  3. 5 μLの3 M酢酸ナトリウム(NaOAc)(pH 5.2)を加えます。
  4. 混合物をカラム(参照キットに付属)に移し、室温(RT)で1分間17,900 × g で遠心分離します。
  5. フロースルーを破棄し、スピンカラムを同じ収集チューブに戻します。無水エタノール(EtOH)を含むバッファーPEを750 μL加え、17,900 × g でRTで1分間遠心分離します。
  6. フロースルーを破棄し、スピンカラムを同じ収集チューブに戻します。17,900 × g でRTで1分間遠心分離し、フロースルーのある回収チューブを廃棄します。
  7. DNA断片を溶出するには、カラムに新しい1.5 mLチューブを装備し、10 μLのバッファーEBを加えて、RTで3分間放置します。17,900 × gでRTで1分間遠心分離します。
    注:サンプルは、4°Cで数日間、または-20°Cで数週間保存できます。

6. PCR増幅(表2)

注:この研究で使用したプライマーを 表3に示します。

  1. 転置されたDNA断片を増幅するには、固有のAd2.nバーコードプライマー(プライマー#2)を追加せずにPCRマスター混合物を調製します。サンプルあたり38 μLのPCRマスター混合物を使用します:11 μLのヌクレアーゼフリー水、2 μLの25 μM Ad1_noMXプライマー(プライマー#1)、および25 μLの2x PCRマスターミックス。
  2. 38 μLのPCRマスター混合物を0.2 mL PCRチューブに加えます。
  3. ステップ5.7から溶出したDNA断片を10 μL追加します。
  4. 各サンプルに固有の25 μMプライマー#2を2 μL追加します。
  5. 表2に示すサイクリング条件に従ってPCRを実行します。

7.リアルタイム定量PCR(qPCR)テスト(表4)

注:このステップは、DNAを増幅するために必要な追加のサイクルを決定することを目的としています。これはオプションですが、特に新しい実験を行うことを強くお勧めします。

  1. プライマー #2 を添加せずに qPCR マスター混合物を調製します。サンプルあたり9.975 μLのqPCRマスター混合物を使用します:4.41 μLのヌクレアーゼフリー水、0.25 μLの25 μMプライマー#1、5 μLの2x PCRマスターミックス、および0.09 μL 100x SYBR Green I。
    注:100倍のSYBR Green Iを調製するには、10,000倍のストックをヌクレアーゼフリーの水で希釈します。qPCRマスター混合物に使用した100倍のSYBRグリーンIの体積はごくわずかであるため、希釈した100倍のSYBRグリーンIの追加のマスター混合物を作成する方が簡単です(例:8〜10サンプル用)。
  2. 9.975 μLのqPCRマスター混合物をqPCRプレートの各ウェルに加えます。
  3. 0.25 μLの25 μMプライマー#2を各ウェルに加えます。
    注:手順2で特定の各サンプルに追加されたものと一致するように、同じプライマー#6.4を必ず追加してください。
  4. ステップ6.5でPCR増幅後に得られたPCR反応液を5 μL加え、ピペッティングにより混合する。
    注:PCR反応の残りの45μLは、2回目のPCR増幅に使用されます。
  5. 表5に示すサイクリング条件に従ってqPCRを実行します。
  6. 増幅曲線を確認し、最大値の~35%に達したサイクル数を推定することにより、必要な追加のPCRサイクル数を特定します(図3A)。
    注:通常、10,000個の核には5〜8回の追加のPCRサイクルが必要です。

8.追加のPCR増幅

  1. ステップ7.6(表6)の計算に従って、残りの45 μLのPCR反応をすべて使用してPCRを実行します。
    注:各サンプルには、異なる数の増幅サイクルが必要になる場合があります。

9. PCR精製キットを用いた2回目のDNA精製

  1. セクション5と同じ手順を使用しますが、増幅されたDNA断片を20 μLのバッファーEBで溶出します。

10. DNAフラグメントサイズの選択

注:以下に説明するように、固相可逆固定化ビーズを使用してください。他の同様のDNA精製ビーズは、製造元の指示に従って使用できます。SPRIビーズ懸濁液は、使用前に完全に再懸濁し、回転しながらRTで平衡化する必要があります。

  1. 溶出したDNAを新しいPCRチューブに移し、80 μLのバッファーEBを加えて最終容量を100 μLにします。
  2. 55 μLのSPRIビーズ(サンプル量の0.55倍)を加え、ピペッティングで混合します。RTで5分間インキュベートした後、PCR8チューブストリップ用のミニ磁気スタンドで5分間分離します。
  3. 150 μLの上清を新しいPCRチューブに移します。95 μLのSPRIビーズを加え、ピペッティングで混合します。
    注:上清には、約500bp以下のDNAが含まれています。
  4. RTで5分間インキュベートした後、ミニ磁気スタンドで5分間分離します。上清は慎重に捨ててください。
  5. ビーズを200 μLの70%EtOHで1分間洗浄します。合計3回の洗浄で2回繰り返します。
    注意: 洗浄中は、PCRチューブを磁気スタンドから動かさないでください。
  6. 最後の洗浄後、チューブを1,000 × g で1分間スピンダウンし、残りのEtOHをピペットで取り出します。蓋を開けた状態でペレットを37°Cで2分間PCRマシンで乾燥させます。
    注意: ビーズペレットは、乾燥するといくつかの小さな亀裂のみを表示する必要があります。過度の乾燥は避けてください。
  7. ピペッティングによりペレットを20 μLのバッファーEBで再懸濁し、RTで5分間インキュベートします。 ミニ磁気スタンドで5分間分離し、最終ライブラリを含む上清18 μLを新しい1.5 mLチューブに移します。
    注 ライブラリは、品質チェックの実行中に-20°Cで保存できます。

11. 蛍光光度計を用いたDNA定量

  1. マスター混合物を調製するには、dsDNA HSバッファーで200倍のdsDNA高感度(HS)試薬を最終濃度1倍に希釈します。
  2. 標準の場合は、190 μLの1xマスター混合物と10 μLの標準1または標準2を蛍光光度計チューブに追加します。
    注:定量を開始する前に、暗闇の中でRTで標準を平衡化してください。
  3. ライブラリサンプルの場合、1xマスター混合物198 μLと各サンプル2 μLを別々の蛍光光度計チューブに追加します。
    注:サンプル量が限られている場合は、サンプル量を1 μLに減らし、1xマスターミックス量を199 μLに増やすことができます。
  4. 蛍光光度計チューブを渦巻きまたは振って、暗闇の中でRTで5分間放置します。蛍光光度計のdsDNA HSアッセイを使用してDNA濃度を測定します。

12. 高感度電気泳動装置によるライブラリ品質チェック

  1. ATAC-seqライブラリを採取し、ヌクレアーゼフリーの水で最終濃度1〜5 ng / μLに希釈します。
  2. ATAC-seqライブラリのサイズ分布を、メーカーのプロトコルに従った高感度自動電気泳動システムを使用して解析します。

13. ターゲットqPCRによるATAC-seqライブラリの品質チェック

  1. ATAC-seqライブラリを5〜10 ng取り、50 μLのヌクレアーゼフリー水で希釈します。
  2. 表7に示すサイクリング条件に従って、脂肪細胞で活性であることが知られているプロモーターおよびエンハンサーを標的とするプライマーを使用してqPCRを実行します。
  3. 閉鎖/サイレントゲノム領域を標的とするネガティブコントロールプライマーを使用してください(表7)。
  4. ネガティブコントロールに対するプロモーター/エンハンサーの濃縮を計算します(表8)。
    注:成功したサンプルで≥10〜20倍の濃縮が見込まれます。

14. シーケンシング

  1. シーケンシングのためにATAC-seqライブラリを提出してください。ペアエンドシーケンシング(2 x 34 bp、2 x 50 bp以上)を使用し、サンプルあたり平均リード数は1,000万から3,000万リードです。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このATAC-seqプロトコルを使用して脂肪組織を分析するために、飼料を与えられたAdipoq-NuTRAPマウスを生成しました。次に、フローサイトメトリーを用いて精巣上体白色脂肪組織(eWAT)、鼠径白脂肪組織(iWAT)、褐色脂肪組織(BAT)から脂肪細胞核を単離した。単離された核をタグ付けに使用し、続いて上記のようにDNA精製、PCR増幅、品質チェックステップ、シーケンシング、およびデータ分析を行いました。この代表的な実験の目的は、異なる脂肪蓄積物から単離された純粋な脂肪細胞集団のクロマチンアクセシビリティをプロファイリングすることでした。

mCherry標識およびGFP標識脂肪細胞核は、フローサイトメトリーを用いてAdipoq-NuTRAPマウスの脂肪組織から単離された他の細胞タイプの核と明確に区別できることを観察しました(図2A-C)。脂肪細胞画分は、脂肪デポーの種類によって、eWATで~50%、iWATで~30%、BATで~65%と差がありまし...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この論文では、 in vivoでの脂肪細胞特異的クロマチンアクセシビリティを評価するための最適化されたATAC-seqプロトコルを提示しました。Adipoq-NuTRAPマウスを用いたこのATAC-seqプロトコルは、脂肪細胞特異的クロマチンアクセシビリティプロファイルの生成に成功しました。ATAC-seq実験の成功と再現性の最も重要な要素は、核の品質です。解剖した脂肪組織を液体窒素中で直ちに急速凍結し、使用するまで解凍せずに-80°Cで安全に保管することが重要です。また、核の単離および選別中の脂肪細胞核の損傷を防ぐことも重要です。サンプルは、核分離の全プロセスを通して、低速遠心分離と最小限のピペッティング によって 穏やかに取り扱う必要があります。

核選別中の慎重なゲーティングは、mCherry/GFPタグ付き脂肪細胞核を選択的に単離するために重要です(図1)。mCherry/GFP陽性集団と陰性集団を明確に分離することが重要です。同様に、核内のクロマチンの性質を維持するためには、穏...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、この論文で説明されている研究に関連する、または重要な金銭的利益がないことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、IUSMショーウォルター研究信託基金(H.C.R.)、IUSM糖尿病および代謝性疾患センターのパイロットおよび実現可能性助成金(H.C.R.)、国立糖尿病および消化器および腎臓病研究所(R01DK129289からH.C.R.)、および米国糖尿病学会ジュニアファカルティ賞(7-21-JDF-056からH.C.R.)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Animals
アディポネクチン-CreマウスThe Jackson Laboratory28020
NuTRAPマウスThe Jackson Laboratory29899
試薬&材料
1.5 mL DNA-LoBindチューブEppendorf86-923
100 µm細胞ストレーナーFalcon352-360
15 mL tubesVWR525-1071
2x TD bufferIllumina15027866
384-well PCR plateApplied biosystem4483285
40 µm細胞ストレーナーFalcon352-340
50 mL tubesVWR525-1077
AMPure XP reagent (SPRI beads)Beckman CoulterA63881
Bioanalyzer High Sensitivity DNA kitAgilent Technologies5067-4626
透明粘着フィルムApplied biosystem4306311
DNase/RNase-free 蒸留水Invitrogen10977015
Dounce tissue grinderDWK Life Sciences357542
DTTSigmaD9779
DynaMag-96 サイドスカートマグネットThermo Fishers12027
FACS tubesFalcon 
HEPESBoston BioProductsBBH-75
Hoechst 33342Invitrogen2134015
KCl (2 M)Boston BioProductsMT-252
PCR 8チューブストリップ用磁気分離ラックEpiCypher10-0008
MgCl2 (1 M)Boston BioProductsMT-200
MinElute PCR 精製キットQiagen28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mixBioLabsM0541S
NP40Thermo Fishers28324
PCR 8-tube stripUSA scientific1402-4708
Protease inhibitor cocktail (100x)Thermo Fishers78439
Qubit dsDNA HS assay kitInvitrogenQ32851
スクロースSigmaS0389-1KG
SYBR Green I (10,000x)InvitrogenS7563
TDE I enzymeIllumina15027865
Instruments
Flow cytometerBD BiosciencesFACSAria Fusion
Qubit 蛍光光度計InvitrogenQ33226
リアルタイム PCR システムThermo FishersQuantStudio?5
28719128

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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