Method Article

手動受粉、顕微鏡検査、および S遺伝子型分析を使用した柑橘類の自己(非)適合性および相互(非)適合性関係の決定

DOI:

10.3791/65056

⸱

June 30th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Key Laboratory for Germplasm Innovation & Utilization of Horticultural Crops, Huazhong Agricultural University

In This Article

Summary

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このプロトコルは、柑橘類の品種における花粉の適合性と非適合性を決定するための迅速な方法を提供します。

Abstract

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柑橘類はS-RNaseベースの自己不適合を使用して自家花粉を拒絶するため、受粉と受精を成功させるには近くの花粉症の木が必要です。ただし、花粉症として機能するのに適した品種を特定することは、時間のかかるプロセスです。この問題を解決するために、我々は、アガロースゲル電気泳動とアニリンブルー染色を利用した受粉適合柑橘類品種を迅速に同定する方法を開発しました。花粉の適合性は、全DNAを抽出し、特異的プライマーを用いてPCRベースのジェノタイピングアッセイを行うことにより、 S 遺伝子型の同定に基づいて決定されます。さらに、手動受粉の3〜4日後にスタイルを収集し、アニリンブルー染色を行います。最後に、花粉管の成長状況を蛍光顕微鏡で観察する。花粉の適合性と非適合性は、花粉管の成長が正常であるか抑制されているかをそれぞれ観察することによって確立できます。この方法は、その単純さと費用対効果のために、異なる柑橘類品種の花粉適合性および非適合性を決定して、異なる品種間の非適合性グループおよび非適合性関係を確立するための効果的なツールである。この方法は、適切な花粉媒介者の木の選択を成功させるために不可欠な情報を提供し、したがって、新しい果樹園の設立と繁殖プログラムのための適切な親の選択を容易にします。

Introduction

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自己不適合(SI)は、被子植物種の約40%に存在する遺伝的に制御されたメカニズムです。このプロセスでは、雌しべは同じSI遺伝子型を持つ植物からの花粉を拒絶し、したがって自家受精を防ぎます1,2。Ma jia pummeloは、中国の金蘇省の地元の品種で、大きくてピンク色の果実、豊富な果汁、甘酸っぱい味、厚い皮の優れた品質を備えています3。SIは交配を促進しますが、果物の収量と品質に悪影響を及ぼし4、信頼性の高い結実率と高収量のために、異なるSI遺伝子型を持つ適切な花粉症の木を必要とします。現在、SIには、アブラナ科に代表される胞子体自己不適合(SSI)と、バラ科、パパベラ科、ミカン科、ナス科に代表される配偶体自己不適合(GSI)の2つの主要なタイプがあります5,6,7,8。

柑橘類は世界で最も重要な果物作物の一つです。S-R....

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Protocol

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1.アニリンブルー染色の準備

  1. 実験用の試薬とツールを準備します:花粉媒介者ブラシ、ピンセット、鉛筆、硫酸塩紙、受粉バッグ、ジップロックバッグ、ペーパークリップ、ホルムアルデヒド、氷酢酸、無水エタノール、遠心管、鉗子、接着剤スポイト、スライドガラス、カバーガラス、メス、およびポリエチレングリコール。
  2. 0.02%MgSO4、0.01%KNO 3、0.03%Ca(NO 3)2、0.01% H 3 BO 3、20%PEG-4000、および15%スクロースを含むin vitro発芽培地を調製します。KOHでpHを6.0〜6.2に調整します。PEG-4,000は溶解しにくいためマグネチックスターラーを使用してください。
  3. 無水エタノールと氷酢酸を3:1の比率で混合したCarnoyの固定液を調製します。40%ホルムアルデヒド、80%エタノール、および氷酢酸(1:8:1)であるFAA固定溶液を調製します。4 M 水酸化ナトリウム(NaOH)および0.1 M K3PO 4中の0.1%アニリンブルーであるアニリンブルー溶液を調製する。 アニリンブルー溶液は感光性であるため、琥珀色のボトルを使用して保管してください。

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Results

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ここで行われた実験では、成熟した花を選び、葯を集めてオーブンで乾燥させ、花粉を28°Cで12時間発芽させました。花粉生存率と発芽率を 図1に示すように定量化した。

柑橘類は手作業で受粉し、花粉の適合性と不適合性をアニリンブルー染色と蛍光顕微鏡を使用して評価しました。互換性のある花粉は柱頭の表面で発芽し、成長し、最終的に卵巣の受精につながる可能性のある正常な花粉管を生成する可能性があります。対照的に、互換性のない花粉管は、スタイルの約3分の2で成長し、その後成長を停止しました(図2)。

S遺伝子型を同定するために、植物から全DNAを抽出した。特異的プライマーは、PCR反応においてS遺伝子座の一部を増幅するのに有用なS遺伝子座の配列に基づいて設計した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動を用いて分析した。増幅されたバンドが検出された(500〜1,000bpの間)。.......

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Discussion

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果物作物では、単為結果性とSIの両方が種なし果実への道を開くため、重要な形質です-消費者から高く評価されている形質です。自己不適合は自家花粉の拒絶を促進し、したがって近親交配を防ぎます20。柑橘類の中で、プメロは自己不適合品種です7。すべての被子植物種のほぼ40%がSI21を示します。この特性は結実を妨げ、収量を低下させ、生産者に莫大な経済的損失をもたらします。この問題を解決するために、農家は果樹園全体に花粉症の木を含めます。しかし、適切な花粉症の木の選択は、時間のかかる実験室実験を必要とする困難な作業です。これらの問題を解決するために、花粉症の木の正確な選択を容易にするために、SI遺伝子型を特定し、異なる柑橘類品種の花粉の適合性と非互換性を決定するための迅速な方法を開発しました。さらに、花粉生存率および発芽率は、このプロトコルに記載されている in vitro 方法を使用して決定することもできる。

梅と杏の

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Disclosures

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著者は、開示するものは何もないと宣言しています。

Acknowledgements

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このプロジェクトは、中国国家自然科学財団(32122075、32072523)によって財政的に支援されました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
絶対エタノールSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218
アニリンブルーSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd
ホウ酸, H3BO3Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10004818
Brown bottleLabgic Technology Co., Ltd
硝酸カルシウム四水和物、Ca(NO3)2Sinopharm Chemical ReagentCo.、Ltd80029062
遠心管Labgic Technology Co.、Ltd
遠心分離管Labgic Technology Co.、Ltd
CTABGEN-VIEW SCIENTIFIC INC57-09-0(CAS)
DroppingJiangsu Songchang Medical Equipment Co.、Ltd
エチレンジアミン四酢酸、EDTAシノファーム化学試薬株式会社 10009617
鉗子LUXIANZIバイオテクノロジー株式会社
ホルムアルデヒドシノファーム化学試薬株式会社10010018
全自動サンプル高速グラインダー上海Jingxin工業開発有限公司Tissuelyser-96
氷酢酸Sinopharm Chemical ReagentCo.、Ltd10000218
研削管Shanghai Jingxin Industrial Development Co.、Ltd
イソアミルアルコールSinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd10003218
Isopropyl alcoholSinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd80109218
ラベルM&G Chenguangステーショナリー株式会社
ライカDMi8上海ライカCo.,Ltd21903797
マグネシウム硫酸塩七水和物, MgSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10013018
顕微鏡カバーガラス浙江泰工業有限公司
NaClSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10019318
ペーパークリップエム&G Chenguangステーショナリー株式会社
ペンシルM&G Chenguangステーショナリー株式会社
花粉媒介ブラシ上海Yimeiプラスチックス株式会社
グリコール、PEG 6000北京Dingguo Changshengバイオテクノロジー株式会社DH229-1
ポリエチレングリコール、PEG-4000広州saiguoバイオテクノロジー株式会社1521GR500
酸化カリウム、KOHシノファーム化学試薬株式会社10017008
硝酸カリウム、KNO3Sinopharm Chemical ReagentCo.、Ltd10017218
ScalpelJiangsu Songchang Medical Equipment Co.、Ltd Slide
Zhejiang Shitai Industrial Co.、Ltd
水酸化ナトリウム、NAOHSinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd10019718
スクロースSinopharm化学試薬Co.、Ltd
10021418硫酸塩紙泰州金農メッシュ工場
サーモスタットウォーターバス上海Jinghong実験装置有限公司L-909193
クロロメタンSinopharm化学試薬有限公司10006818
トリカリウム三塩基性三水和物、K3PO4上海霊風化学試薬株式会社20032318
Tris-HClGEN-VIEW SCIENTIFIC INC1185-53-1
ジップロックバッグM&G Chenguangステーショナリー株式会社
β-メルカプトエタノールGEN-VIEW SCIENTIFIC INC60-24-2(CAS)
ポリエチレン水トリリン酸

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
  2. Goldberg, E. E., et al.

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