Epimediiフォリウムマトン油加工技術の最適化とゼブラフィッシュ胚発生への影響の検証

Summary

このプロトコルでは、Box-Behnken実験計画応答表面法を適用してEpimedii folium(EF)の羊油処理技術を最適化し、ゼブラフィッシュの胚発生に対する粗水および最適化された水抽出EFの影響を予備的に調査しました。

Abstract

伝統的な漢方薬(TCM)として、エピメディフォリウム(EF)は、>2,000年前の医学と食品の歴史があります。臨床的には、マトンオイルで処理されたEFは薬としてよく使用されます。近年、EFを原料とした製品の安全性リスクや副作用の報告が徐々に増加しています。処理により、TCMの安全性を効果的に向上させることができます。TCM理論によれば、マトンオイル処理はEFの毒性を軽減し、腎臓に対するその調子効果を高めることができます。しかし、EFマトンオイル加工技術の体系的な研究と評価は不足しています。この研究では、Box-Behnken実験計画応答曲面法を使用して、複数のコンポーネントの内容を評価することにより、処理技術の主要なパラメーターを最適化しました。その結果、EFの最適なマトン油加工技術は、マトンオイルを120°C±10°Cで加熱し、粗EFを加え、均一に光沢があるまで189°C±10°Cまで穏やかに炒め、取り除いて冷却することであることが示された。EF100 kgごとに、15 kgのマトンオイルを使用する必要があります。粗精製および羊油処理EFの水性抽出物の毒性および催奇形性をゼブラフィッシュ胚発生モデルで比較した。結果は、粗ハーブグループがゼブラフィッシュ奇形を引き起こす可能性が高く、その半分の最大致死EF濃度が低いことを示しました。結論として、最適化されたマトンオイル処理技術は安定していて信頼性が高く、再現性も良好でした。EFの水性抽出物は、特定の用量ではゼブラフィッシュ胚の発生に対して毒性があり、毒性は加工薬よりも生薬の方が強かった。結果は、マトン油処理が粗EFの毒性を低下させることを示した。これらの知見は、マトン油処理EFの品質、均一性、および臨床的安全性を向上させるために使用できます。

Introduction

エピメディイフォリウム(EF)は、イカリソウブレビコルヌマキシム、イカリソウサジタタム(Sieb. et Zucc)の乾燥葉です。マキシム、エピカリソウ思春期マキシム、またはエピメディウムコリアナムナカイ。EFは、骨粗鬆症、更年期障害、乳房のしこり、高血圧、冠状動脈性心臓病、^{およびその他の疾患の治療}に使用できます1。伝統的な中国医学(TCM)として、EFは2,000年以上の医学と食品の歴史があります。その低価格と腎臓の緊張の顕著な効果のために、それは医薬品や健康食品に広く使用されています。EFは、羊肉油で炒めて加工されますが、これは劉宋時代の²年にレイシャオによって書かれたレイゴン加工理論で最初に説明されたプロセスです。粗EFとEF炒めの効果はかなり異なります。粗EFは主にリウマチを払拭しますが、炒めたEFは腎臓を温めて陽^を強化します3。現在、EFは医薬品や健康食品の原料として広く使用されています。中国の特許医薬品は399件、輸入健康食品は9件、EF^{を原料とする}国内健康食品は455件です。この医薬品は大きな応用の見通しがあります。しかし、近年、EFを原料とした健康食品や中国特許医薬品による副作用やヒト肝障害の報告が増えており、関連する毒性試験^5,6,7では、EFを原料とする潜在的な安全性リスクが報告されています。

漢方加工とは、毒性を効果的に軽減または排除し、TCMの安全性を向上させることができる製薬技術を指します。EFの伝統的な加工方法は、マトン油で炒めることで、EFの毒性を軽減し、腎臓を温め、陽⁸を促進する効果を高めます。この処理方法は、中国薬局方および各種処理仕様に含まれています¹.EFのプロセスは次のようにのみ指定されています:EF100 kgごとに20 kgの羊水(精製)が追加され、均一で光沢がある¹になるまで穏やかに焼成されます。上記の標準には厳密なEF処理メソッドパラメータがないため、一貫性を提供するためにローカル処理仕様が統一されていません。したがって、EFプロセスの体系的な研究を行うことは有用でしょう。本論文では、Box-Behnken実験計画応答曲面法を用いてEFの処理技術を最適化した。

Box-Behnken実験計画は、工程の因子を最適化するために通常使用される方法です。抽出パラメータは、重回帰式適合因子と効果値の間の関数関係を確立することによって最適化できます。最近、この方法は、TCM抽出⁵、^6、7および処理⁹、^10、11の研究に広く使用されています。塩加工ソラレ科フルクタス¹²、ワイン加工フルータス¹³、ローストシナモミラムルス¹⁴など、ボックスベンケン設計に従った塩加工、ワイン加工、炒め物を含むTCM調製方法がさまざまな研究で報告されています。この方法は、テスト時間が短縮され、テスト精度が高く、多要素およびマルチレベルのテストに適しています。この方法は、直交計画試験方法よりも単純であり、均一設計方法¹⁵よりも包括的である。得られた関係は、テスト範囲内の任意のテストポイントの予測値を決定することができ、これは大きな利点である。ゼブラフィッシュモデルを使用して、EFが処理後に毒性が低いかどうかをテストできます。

TCM毒性試験において、ゼブラフィッシュモデルには、細胞実験のハイスループットとげっ歯類実験との類似性という2つの利点があります¹⁶。このモデルは、サイズが小さく、産卵率が高く、繁殖サイクルが短く、繁殖が容易であることが特徴です。このモデルは、細胞培養プレートでの大規模な同期実験に使用でき、実験薬の投与量が少なく、実験サイクルが短く、コストが低く、実験プロセス全体の観察と操作が容易です¹⁷。ゼブラフィッシュの胚は透明で急速に成長します。したがって、異なる発生段階における内臓組織に対する薬物の毒性および催奇形性効果は、顕微鏡下で直接観察することができる¹⁸。ゼブラフィッシュとヒトの遺伝子相同性は85%^{にもなります18}。ゼブラフィッシュのシグナル伝達経路はヒトのそれと類似している¹⁸。ゼブラフィッシュの生物学的構造と生理学的機能は、哺乳類のものと非常に類似しています¹⁸。したがって、薬物検査用のゼブラフィッシュモデルは、信頼性が高く、ヒトに完全に適用可能な実験動物を提供することができます¹⁹。

本研究では,イカリイン,エピメジンA,エピメジンB,エピメジンC,バオフオシドIの含有量を評価指標として,EF加工技術で使用するマトン油の量と温度,揚げ温度を最適化するためにBox-Behnken設計応答曲面法を用いた。ゼブラフィッシュモデルを用いて、EFに対する処理の減衰効果を評価するために、処理前後のゼブラフィッシュ胚発生に対するEF水抽出物の効果を予備的に調査した。

Protocol

すべての動物関連実験は、重慶TCM研究所の実験倫理委員会の承認を得て実施されました(実験動物倫理審査証明書番号:ZJS2022-03)。

1.生理活性成分の測定

注:この研究で使用された種は イカリソウサジッタタムであり、サンプルは重慶市豊都県で収集されました。試料は、 E. sagittatum (Sieb. et Zucc)の乾燥した地上部分として同定された。諺。重慶中医薬研究所生物医学研究所の研究者による。

1. 電子分析天秤を用いて、各基準物質、すなわちイカリイン、エピメジンA(EA)、エピメジンB(EB)、エピメジンC(EC)、バオフオシドI(BI)の適量を正確に秤量し、メタノールに溶解して対照品溶液を調製する。これらを用いて、381.61 μg/mLのイカリイン、124.14 μg/mL EA、110.24 μg/mL EB、1091.75 μg/mL EC、および184.98 μg/mL BIを含む混合基準原液を調製します。
2. EFを3番の篩を通して粉砕することにより、試験生成物溶液を調製する。粉砕したEFの約0.2g(電子分析天秤を使用)を栓付き三角フラスコに入れ、20mLの希エタノールを加え、400Wの電力と50kHzの周波数で1時間超音波処理します。よく振とうし、0.22 μmのメンブレンフィルターを通過させて試験溶液を得た。
3. 以下のようにクロマトグラフィーを行う。寸法 4.6 mm x 250 mm、内径 5 μm の C₁₈ カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を使用してください。移動相Aとしてアセトニトリルを使用し、移動相Bとして超純水を使用します。 以下のグラジエント溶出パラメータを使用します:0〜30分、24%A〜26%A;30〜31分、26%A〜45%A;31〜45分、45%A〜47%A.220nmの検出波長を使用します(使用する検出器については、 材料の表を参照してください)。カラム温度を30°C、流速を1.0 mL/minに保ち、サンプルサイズは10 μLです。
4. 線形関係を調べるには、ステップ1.1と同様に、イカリイン、EA、EB、EC、BIについてそれぞれ2倍、4倍、8倍、16倍、32倍に希釈した混合参照溶液を使用します。移動相Aにはアセトニトリルを、移動相Bには超純水を使用します。
5. 以下のグラジエント溶出パラメータを使用してください:0-30分、24%Aから26%A;30〜31分、26%A〜45%A;31〜45分、45%A〜47%A.220nmの検出波長を使用します(使用する検出器については、 材料の表を参照してください)。カラム温度を30°C、流速を1.0 mL/minに保ち、サンプルサイズ10 μLを使用します。最後に、ピーク領域を記録します。専門のソフトウェアを使用して、基準濃度(x軸、μg/mL)を横軸、ピーク面積(y軸)を縦軸として線形回帰をプロットします( 材料表を参照)。
6. ステップ1.3に示すクロマトグラフィー条件を用いてHPLCにより混合対照溶液を6回連続して測定することにより精密試験を行う。各化学組成の検出時間とピーク面積を記録し、ピーク面積の相対標準偏差(RSD)を計算し、以下の式を使用して精度(再現性)を評価します。
   RSD% = 標準偏差 (SD)/計算結果の算術平均 (X) x 100 %
7. 再現性試験を行うには、EF粉末を正確に秤量し、ステップ1.2の方法に従って6部の試験生成物溶液を並行して調製する。調製した溶液を、ステップ1.3で提示したクロマトグラフィー条件下でHPLCにかけます。各化学組成の保持時間とピーク面積を記録し、標準曲線(ピーク面積対濃度)から各化合物の量を計算します。上記のようにRSD%を計算します。
8. 安定性試験を行うには、試験溶液を室温で保存し、調製後0時間、2時間、4時間、8時間、12時間、および24時間にステップ1.3に記載したHPLC法によってその内容物を測定し、安定性を評価します。各化学組成の保持時間とピーク面積を記録し、上記のようにピーク面積のRSD%を計算します。
9. サンプル回収試験を実施するには、0.2 gのEF粉末を栓付き三角フラスコに入れて6回の反復を行います。適量の参照溶液(サンプルに添加される参照物質の量は、サンプルの既知の含有量の100%に相当します)を追加し、ステップ1.2で提示された方法に従って試験溶液を調製します。
10. サンプルをクロマトグラフに注入し、ステップ1.3のクロマトグラフィー条件に従って分析します。ピーク面積を記録し、以下のように平均回収率とRSD%値を計算します。
    スパイクサンプル回収率=(スパイクサンプル含有量-サンプル含有量)/サンプル量x100%

2. Box-Behnken設計応答曲面法を用いたEF羊油加工技術の最適化

1. マトンオイルの量(A; 15%-35%)、マトンオイルの温度(B; 50-120°C)、揚げ温度(C; 80-300°C)など、EF処理の主要なパラメータを影響力のある要因として選択します。評価指標として、イカリイン、EA、EB、EC、およびBIコンテンツの包括的なスコアを使用します。ここでのマトンオイルの割合は質量百分率です。
2. 応答曲面解析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、Box-Behnken応答曲面実験を設計し、2次応答曲面を探索し、2階多項式モデルを構築します。新しいボックス-ベンケン計画を選択し、数値因子オプションを3に設定します。因子A、B、Cを設定し、[ 続行]をクリックします。回答 オプションを 1 (包括的なスコア) に設定します。 [続行 ]をクリックしてデザインを完了します。合計17の実験が計画されました( 表1を参照)。
   注: 独立変数と従属変数、およびそれらの低水準、中水準、高水準については、 表 2 を参照してください。
3. 表 1 の特定のパラメーターに従って EF を処理します。たとえば、注文番号1の場合、精製マトンオイルを15%V / Vとして計量し、50°Cに加熱して溶かします。溶かした羊肉に粗EFを加え、弱火(190°C)で均一に光沢が出るまで炒め、取り出して冷まします。17回の実験操作を実行しました。この作業では、合計17グループのEF加工製品が得られました。
   注意: マトンオイルは室温(25°C)で固体であり、加熱すると液体に溶けます。液体状態のマトン油を賦形剤として使用することができる。
4. ステップ1.2で説明した方法に従って、処理された製品のテスト溶液を調製します。次に、ステップ1.3に記載したクロマトグラフィー条件に従ってHPLCを用いてそれらを分析します。各化学組成の保持時間とピーク面積を記録し、外部標準曲線に対して各試験溶液中のイカリイン、EA、EB、EC、およびBIの含有量を計算します。以下の総合スコア計算式を使用して、17の実験グループの総合スコアを計算します。
   総合スコア = Z/Z_最大 × 0.5 + BI/BI_最大 × 0.5
   ここで、Zはイカリイン、EA、EB、およびECコンテンツの合計です。Z_max は、17の実験群におけるイカリイン、EA、EB、およびEC含有量の合計の最大値です。BI は BI コンテンツです。BI_max は、17の実験グループにおけるBIコンテンツの最大値です。
5. 17グループの実験の包括的なスコアリング結果をデータ解析ソフトウェア( 材料表を参照)にインポートして、実験データを分析します。評価項目で、2次プロセス次数オプションと多項式モデルタイプオプションを選択します。

3. ゼブラフィッシュの胚発生に対する加工効果の試験

1. サンプル調製
   1. 粗製および処理済みのEFを3番のふるいで粉砕します( 材料表を参照)。各EFサンプル100gに、1,000mLの超純水を加えます。EFを0.5時間浸し、水をそれぞれ30分間2回沸騰させてから、ろ紙でろ過します。
   2. ろ液を混ぜ合わせ、加熱してサンプルを濃縮します。最終容量100 mLまで超純水を加えて、処理済みEF(PEF、1 g/mL)および粗EF(CEF、1 g/mL)ストック溶液を得ます。各原液中の生薬量を測定します。
   3. 1 mL、1.5 mL、2.5 mL、5 mL、および7.5 mLのストック溶液を10 mLメスフラスコに入れ、超純水を容量まで加えて、ゼブラフィッシュ胚毒性試験用の濃度100 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL、250 mg/mL、500 mg/mL、および750 mg/mLの濃度の試験溶液を調製します。
      注:試験溶液の濃度は、関連文献^20,21を参照し^、予備実験を実施して、通常の毒物学で使用される10倍の濃度勾配を与えることによって調製されました。CEFは未処理のサンプルであり、PEFはセクション2で説明されている最高の処理技術で調製されたサンプルでした。
2. ゼブラフィッシュの飼育と胚処理²¹
   1. 野生型ゼブラフィッシュ( 材料表参照)を制御された温度で2日間適応させ、pH 7.0〜7.4のフロースルー水槽に保管し、1日2回給餌します。
      注:ゼブラフィッシュのメラニン生成抑制は、1-フェニル-2-チオ尿素を0.003%(質量/体積)の濃度で培地に添加し、形態観察のために体を透明に保つことによって達成されました。
   2. 夕方に成体の肥沃な野生型ゼブラフィッシュを選択し、交配ボックスのバッフルを使用してそれらを分離します。翌朝バッフルを外し、魚を30分間産卵させます。15分ごとにスポイトで受精卵を集めた。合計で520個の健康な野生型胚が収集された。ゼブラフィッシュの胚を28.5°Cのインキュベーターで24時間保管します。
   3. 受精後24時間(hpf)の健康な胚を13のグループにランダムに割り当て、1つの対照群とともに、培養皿に次の各溶液の10 mLを別々に浸します:PEF:100 μg / mL、150 μg / mL、200 μg / mL、250 μg / mL、500 μg / mL、750 μg / mL;CEF: 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL .ブランクコントロールグループを溶液として培地で処理します。この研究では、各グループに40個の胚が含まれていました。
      注:培地組成は、0.15 M NaCl、5 mM KCl、0.25 mM Na 2 HPO 4、0.45 mM KH 2 PO 4、1.3 mM CaCl₂、1.0 mM MgSO 4、および ₄ mM NaHCO₃です。
   4. ゼブラフィッシュを恒温インキュベーターで最大120 hpfまで培養します。毎日死んだ幼虫の数を数え、実体顕微鏡(スケールバー= 500μm、材料表を参照)で各実験群の幼虫の主な器官形態を観察し、データ解析ソフトウェアを使用して72hpfでのゼブラフィッシュの半死濃度(_LC50)を計算します(材料表を参照)。

Results

方法論的調査結果
イカリインの濃度、EA、EB、EC、BI、およびクロマトグラフィーのピーク面積の間に線形関係が観察されました( 表3を参照)。イカリイン、EA、EB、EC、BIのクロマトグラフィーピーク面積のRSD%値(n=6)はそれぞれ0.28%、1.22%、0.65%、1.67%、1.06%であり、HPLC測定の精度が良好であった。イカリイン,EA,EB,EC,BIの含有量のRSD%値(n=6)はそれぞれ1.59%,1.46%,1.86%,2.29%,0.98%であり,再現性が良好であった。試料中のイカリイン、EA、EB、EC、BIのピーク面積のRSD%値(n=6)はそれぞれ1.49%、1.96%、1.42%、0.96%、0.81%であり、試料溶液が24時間以内に安定であったことが示された。イカリイン、EA、EB、EC、BIの平均回収率はそれぞれ99.98%、100.14%、100.09%、100.75%、100.94%であり、RSD%値はそれぞれ0.56%、0.78%、0.84%、1.10%、1.47%であった( 表4参照...

Discussion

独立変数とその水準の決定
EF加工技術は、2020年版の中国薬局方と、全国^の26の省、市、自治区が発行している地元の漢方加工仕様書にのみ記載されています1。説明には、マトンオイルを取り、加熱して溶かし、EF細切りを加え、均一で光沢が出るまでゆっくりと火で炒め、取り出して冷まします。さらに、イカリソウ100kgごとに20kg(20%と略して)のマトンオイル(精製)が使用されます。ただし、EFの処理処理のパラメータは指定されていません。この実験の独立変数の中で、製造プロセスでは、マトン油の投与量、マトン油の温度、および揚げる温度の3つの重要な要素を定量化できました。値の範囲は、上記の説明に従って設定する必要があります。予備試験の結果から、マトンオイルの量が15%の場合、EFの葉をマトンオイルで均一にコーティングできることがわかる。投与量が35%を超えると、マトンオイルが多すぎます。最後に、マトンオイルの量の範囲は15%-35%でなければなりません。温度が50°Cに達すると、マトンオイルが溶けます。温度が>120°Cに達すると、マトンオイルが煙を出し始め、...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アセトニトリ	ルフィッシャー	197164
バオフオサイド (B )	成都マンストバイオテクノロジー株式会社	MUST-20042402
クロマトグラフィーカラム	Waters Corporation	Symmetry C18
Design Expert software	Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN	Trial Version8.0.6.1
Detector	Waters Corporation	2998
Disintegrator	Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.	S-FS553
電子分析天びん	メトラー・トレド・インターナショナル社
エピメディンA(EA)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-21112118
Epimedin B (EB)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20080403
エピメディン C (EC)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20080310
エタノール	慶Chuandong化学(グループ)Co.、株式会社
Graphpad ソフトウェア	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	6.02
高速液体クロマトグラフィー (HPLC)	Waters Corporation	2695
Icariin	Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.
メタノール	慶Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd.
微多孔質膜	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd.	0.22μm
マトンオイル	Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store	20211106
Office Excel オフィスソフトウェア	Microsoft	Office Excel 2021
薬局方ふるい	紹興市 Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.	R40/3
純水機	重慶アンダーセン環境保護設備有限公司	AT Sro 10A
定性濾紙	Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd.	18cm
実体顕微鏡	カールツァイス オーバーコッヘン ドイツ	Stemi 2000
超音波洗浄機	Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd.	BUG25-12
ゼブラフィッシュ	中国ゼブラフィッシュリソースセンター(CZRC)	AB株