Epimediiフォリウムマトン油加工技術の最適化とゼブラフィッシュ胚発生への影響の検証

Summary

このプロトコルでは、Box-Behnken実験計画応答表面法を適用してEpimedii folium(EF)の羊油処理技術を最適化し、ゼブラフィッシュの胚発生に対する粗水および最適化された水抽出EFの影響を予備的に調査しました。

Abstract

伝統的な漢方薬(TCM)として、エピメディフォリウム(EF)は、>2,000年前の医学と食品の歴史があります。臨床的には、マトンオイルで処理されたEFは薬としてよく使用されます。近年、EFを原料とした製品の安全性リスクや副作用の報告が徐々に増加しています。処理により、TCMの安全性を効果的に向上させることができます。TCM理論によれば、マトンオイル処理はEFの毒性を軽減し、腎臓に対するその調子効果を高めることができます。しかし、EFマトンオイル加工技術の体系的な研究と評価は不足しています。この研究では、Box-Behnken実験計画応答曲面法を使用して、複数のコンポーネントの内容を評価することにより、処理技術の主要なパラメーターを最適化しました。その結果、EFの最適なマトン油加工技術は、マトンオイルを120°C±10°Cで加熱し、粗EFを加え、均一に光沢があるまで189°C±10°Cまで穏やかに炒め、取り除いて冷却することであることが示された。EF100 kgごとに、15 kgのマトンオイルを使用する必要があります。粗精製および羊油処理EFの水性抽出物の毒性および催奇形性をゼブラフィッシュ胚発生モデルで比較した。結果は、粗ハーブグループがゼブラフィッシュ奇形を引き起こす可能性が高く、その半分の最大致死EF濃度が低いことを示しました。結論として、最適化されたマトンオイル処理技術は安定していて信頼性が高く、再現性も良好でした。EFの水性抽出物は、特定の用量ではゼブラフィッシュ胚の発生に対して毒性があり、毒性は加工薬よりも生薬の方が強かった。結果は、マトン油処理が粗EFの毒性を低下させることを示した。これらの知見は、マトン油処理EFの品質、均一性、および臨床的安全性を向上させるために使用できます。

Introduction

エピメディイフォリウム(EF)は、イカリソウブレビコルヌマキシム、イカリソウサジタタム(Sieb. et Zucc)の乾燥葉です。マキシム、エピカリソウ思春期マキシム、またはエピメディウムコリアナムナカイ。EFは、骨粗鬆症、更年期障害、乳房のしこり、高血圧、冠状動脈性心臓病、^{およびその他の疾患の治療}に使用できます1。伝統的な中国医学(TCM)として、EFは2,000年以上の医学と食品の歴史があります。その低価格と腎臓の緊張の顕著な効果のために、それは医薬品や健康食品に広く使用されています。EFは、羊肉油で炒めて加工されますが、これは劉宋時代の²年にレイシャオによって書かれたレイゴン加工理論で最初に説明されたプロセスです。粗EFとEF炒めの効果はかなり異なります。粗EFは主にリウマチを払拭しますが、炒めたEFは腎臓を温めて陽^を強化します3。現在、EFは医薬品や健康食品の原料として広く使用されています。中国の特許医薬品は399件、輸入健康食品は9件、EF^{を原料とする}国内健康食品は455件です。この医薬品は大きな応用の見通しがあります。しかし、近年、EFを原料とした健康食品や中国特許医薬品による副作用やヒト肝障害の報告が増えており、関連する毒性試験

Protocol

すべての動物関連実験は、重慶TCM研究所の実験倫理委員会の承認を得て実施されました(実験動物倫理審査証明書番号:ZJS2022-03)。

1.生理活性成分の測定

注:この研究で使用された種は イカリソウサジッタタムであり、サンプルは重慶市豊都県で収集されました。試料は、 E. sagittatum (Sieb. et Zucc)の乾燥した地上部分として同定された。諺。重慶中医薬研究所生物医学研究所の研究者による。

1. 電子分析天秤を用いて、各基準物質、すなわちイカリイン、エピメジンA(EA)、エピメジンB(EB)、エピメジンC(EC)、バオフオシドI(BI)の適量を正確に秤量し、メタノールに溶解して対照品溶液を調製する。これらを用いて、381.61 μg/mLのイカリイン、124.14 μg/mL EA、110.24 μg/mL EB、1091.75 μg/mL EC、および184.98 μg/mL BIを含む混合基準原液を調製します。
2. EFを3番の篩を通して粉砕することにより、試験生成物溶液を調製する。粉砕したEFの約0.2g(電子分析天秤を使用)を栓付き三角フラスコに入れ、20mLの希エタノールを加え、400Wの電力と50kHzの周波数で1時間超音波処理します。よく振とうし、0.22 μmのメンブレンフィルターを....

Results

方法論的調査結果
イカリインの濃度、EA、EB、EC、BI、およびクロマトグラフィーのピーク面積の間に線形関係が観察されました( 表3を参照)。イカリイン、EA、EB、EC、BIのクロマトグラフィーピーク面積のRSD%値(n=6)はそれぞれ0.28%、1.22%、0.65%、1.67%、1.06%であり、HPLC測定の精度が良好であった。イカリイン,EA,EB,EC,BIの含有量のRSD%値(n=6)はそれぞれ1.59%,1.46%,1.86%,2.29%,0.98%であり,再現性が良好であった。試料中のイカリイン、EA、EB、EC、BIのピーク面積のRSD%値(n=6)はそれぞれ1.49%、1.96%、1.42%、0.96%、0.81%であり、試料溶液が24時間以内に安定であったことが示された。イカリイン、EA、EB、EC、BIの平均回収率はそれぞれ99.98%、100.14%、100.09%、100.75%、100.94%であり、RSD%値はそれぞれ0.56%、0.78%、0.84%、1.10%、1.47%であった( 表4参照.......

Discussion

独立変数とその水準の決定
EF加工技術は、2020年版の中国薬局方と、全国^の26の省、市、自治区が発行している地元の漢方加工仕様書にのみ記載されています1。説明には、マトンオイルを取り、加熱して溶かし、EF細切りを加え、均一で光沢が出るまでゆっくりと火で炒め、取り出して冷まします。さらに、イカリソウ100kgごとに20kg(20%と略して)のマトンオイル(精製)が使用されます。ただし、EFの処理処理のパラメータは指定されていません。この実験の独立変数の中で、製造プロセスでは、マトン油の投与量、マトン油の温度、および揚げる温度の3つの重要な要素を定量化できました。値の範囲は、上記の説明に従って設定する必要があります。予備試験の結果から、マトンオイルの量が15%の場合、EFの葉をマトンオイルで均一にコーティングできることがわかる。投与量が35%を超えると、マトンオイルが多すぎます。最後に、マトンオイルの量の範囲は15%-35%でなければなりません。温度が50°Cに達すると、マトンオイルが溶けます。温度が>120°Cに達すると、マトンオイルが煙を出し始め、.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アセトニトリ	ルフィッシャー	197164
バオフオサイド (B )	成都マンストバイオテクノロジー株式会社	MUST-20042402
クロマトグラフィーカラム	Waters Corporation	Symmetry C18
Design Expert software	Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN	Trial Version8.0.6.1
Detector	Waters Corporation	2998
Disintegrator	Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.	S-FS553
電子分析天びん	メトラー・トレド・インターナショナル社
エピメディンA(EA)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-21112118
Epimedin B (EB)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20080403
エピメディン C (EC)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20080310
エタノール	慶Chuandong化学(グループ)Co.、株式会社
Graphpad ソフトウェア	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	6.02
高速液体クロマトグラフィー (HPLC)	Waters Corporation	2695
Icariin	Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.
メタノール	慶Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd.
微多孔質膜	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd.	0.22μm
マトンオイル	Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store	20211106
Office Excel オフィスソフトウェア	Microsoft	Office Excel 2021
薬局方ふるい	紹興市 Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.	R40/3
純水機	重慶アンダーセン環境保護設備有限公司	AT Sro 10A
定性濾紙	Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd.	18cm
実体顕微鏡	カールツァイス オーバーコッヘン ドイツ	Stemi 2000
超音波洗浄機	Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd.	BUG25-12
ゼブラフィッシュ	中国ゼブラフィッシュリソースセンター(CZRC)	AB株