PINK1/パーキン経路を介したマイトファジー を介した クロセチンによる酸化ストレスからのH9c2心筋細胞の保護

Summary

本研究では、 クロ セチンが心筋細胞の酸化ストレス損傷を修復するメカニズムを、PINK1/Parkinシグナル伝達経路が重要な役割を果たすマイトファジーに影響を与えることで明らかにしました。

Abstract

この研究は、in vitro実験を通じて、H 2 O₂を介したH9c2心筋細胞に対するクロセチンの酸化ストレス保護効果を調査し、そのメカニズムがマイトファジーの影響に関連しているかどうかをさらに調査することを目的としています。この研究はまた、心筋細胞の酸化ストレスに対するベニバナ酸の治療効果を実証し、そのメカニズムがマイトファジーの効果に関連しているかどうかを調べることも目的としています。ここでは、_H2O2ベースの酸化ストレスモデルを構築し、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、クレアチンキナーゼ(CK)、マロンジアルデヒド(MDA)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、カタラーゼ(CAT)、およびグルタチオンペルオキシダーゼ(GSH Px)のレベルを検出することにより、心筋細胞の酸化ストレス傷害の程度を評価しました。活性酸素種(ROS)検出蛍光色素DCFH-DA、JC-1色素、およびTUNEL色素を使用して、ミトコンドリアの損傷とアポトーシスを評価しました。オートファジーフラックスは、Ad-mCherry-GFP-LC3Bアデノウイルスをトランスフェクトすることによって測定した。次に、マイトファジー関連タンパク質をウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光法で検出しました。しかしながら、クロセチン(0.1〜10μM)は、細胞生存率を有意に改善し、H 2 O₂によって引き起こされるアポトーシスおよび酸化ストレス損傷を減少させる可能性がある。過剰なオートファジー活性化を有する細胞では、クロセチンはオートファジーの流れとマイトファジー関連タンパク質PINK1およびパーキンの発現を減少させ、パーキンのミトコンドリアへの移行を逆転させる可能性がある。クロセチンは、H 2O₂を介した酸化ストレス損傷およびH9c2細胞のアポトーシスを減少させることができ、そのメカニズムはマイトファジーと密接に関連していた。

Introduction

急性心筋梗塞(AMI)は、冠状動脈への重度で持続的な虚血と低酸素によって引き起こされる生命を脅かす心筋壊死です^1,2。経皮的冠動脈インターベンション(PCI)は、AMIの第一選択治療戦略の1つであり、通常、心筋細胞を虚血性損傷から保護します^3,4。遠位心筋は、AMI後に迅速かつ効果的に治療されない場合、血液と酸素の供給が不足し、虚血性壊死とさらなる心血管合併症を引き起こします^5,6。心筋細胞の回復を促進し、PCI手術の機会を逃した後の不可逆的な心筋損傷を最小限に抑えることは、研究のホットスポットとなっています。AMI後、心筋細胞は虚血と低酸素状態にあり、その結果、ミトコンドリアの酸化的リン酸化が阻害され、NAD+がNADPHに還元され、単電子還元が増加します⁷。その結果、酸素の不完全な還元反応は過剰な活性酸素種(ROS)を生成し、最終的には心筋細胞⁸への酸化ストレス損傷につながる。ROSの過剰な蓄積は脂質過酸化を引き起こし、ミトコンドリア膜の構造と機能をさらに破壊します。その結果、ミトコンドリア透過性遷移孔が連続的に開き、ミトコンドリア膜電位が低下し、アポトーシスとネクローシスが誘発されます。

AMIのアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬(ARB)、βアドレナリン受容体の阻害剤、アルドステロン拮抗薬、およびその他の標準薬は、心筋梗塞後の心機能を高め、不整脈や左心室^{リモデリングなどの}悪性イベントの発生を防ぐのに役立ちます9。しかし、梗塞後の生存率や予後は梗塞の大きさに大きく影響され、心筋細胞のアポトーシスを減少させる上で満足のいく結果は得られていない^10,11。このように、心筋梗塞後の心筋細胞回復を促進する薬剤の開発が喫緊の課題となっている。

伝統医学は、長年にわたって現代の製薬研究のインスピレーションの源となっています^12,13,14,15。漢方薬(TCM)はAMIの治療に長い歴史があり、近年の一連のランダム化比較試験では、TCMが実際に患者の予後を改善できることが確認されています^16,17。TCM理論によれば、AMIはうっ血によって引き起こされるため^18,19、^血液循環を促進するための薬物は通常、急性期²⁰のAMIの治療に使用されます。その中でもサフランは血液の活性化やうっ滞に強力な効果があると考えられており、AMIの急性期治療によく用いられています。サフランの主成分であるクロセチンは、心筋細胞を保護する上で重要な役割を果たす可能性があります²¹。

本研究では_、AMIの心筋細胞傷害を引き起こす心筋虚血/再灌流を模擬するためにH2O2によってH9c2心筋細胞を誘導し、酸化ストレス誘発性心筋傷害に対するその保護効果を調べるための介入としてクロセチンを使用した。クロセチンが心筋細胞を保護するメカニズムは、マイトファジーを通じてさらに調査されました。さらに重要なことに、この記事では、マイトファジーの研究への技術的アプローチのリファレンスを提供し、実験手順全体を詳細に説明します。

Protocol

実験は、中国の北京中医薬大学の生理学研究室で行われました。すべての研究方法は、北京大学の関連ガイドラインおよび規制に従って実施されました。

1. 細胞培養

1. 10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンをダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)基本培地(4.5 g/L D-グルコース、4.g.g/L L-グルタミン、および110 mg/Lピルビン酸ナトリウムを含む; 材料表を参照)に添加して、DMEM完全培地を調製します。
2. 液体窒素凍結H9c2心筋細胞( 材料表を参照)を37°Cの温水で解凍し、氷が溶けるまですばやく均一に攪拌します。
3. 細胞を遠沈管に移し、DMEM完全培地の4倍の容量を加えます。358 x g で室温で5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を廃棄します。
4. 得られた細胞懸濁液を培養液で希釈し、穏やかに吹き、培養フラスコに細胞を接種する。インキュベーター内で37°C、5%_CO2で培養する。

2.細胞生存率の決定

1. クロセチン( 材料表参照)をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、0.05 mM、0.1 mM、0.5 mM、1 mM、5 mM、10 mM、50 mM、100 mM、および200 mMの濃度にします。
2. トリプシンによってH9c2心筋細胞を解離し、次いで混合物をDMEM完全培地で中和する。
3. 細胞を遠沈管に移し、179 x g で室温で5分間遠心分離します。上清を捨て、穏やかに吹き付けることによりDMEM完全培地中の細胞を混合する。
4. 血球計数プレート²² ( 材料表を参照)を使用して細胞を計数し、DMEM完全培地で5 × 10⁴ 細胞/ mLに希釈します。
5. セルを9つの等しい部分に分割します。DMSO(DMEM完全培地で1:1,000の比率に希釈)を対照群に加え、残りの群に1:1,000の比率で異なる濃度のクロセチンを加えます。
6. 細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり100 μLで播種します。24時間のインキュベーション後に上清を捨て、細胞をPBSで3回洗浄します。
7. 100 μLのDMEM基礎培地を添加した後、細胞を4時間インキュベートし、20 μLのMTSを添加します( 材料表を参照)。
8. 細胞をさらに2時間インキュベートし、波長490nmの吸光度を測定し、細胞生存率を計算します。
   注:細胞生存率=(OD処理-ODブランク)/(ODコントロール-ODブランク)×100。

3.乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、クレアチンキナーゼ(CK)、マロンジアルデヒド(MDA)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH Px)、およびカタラーゼ(CAT)の測定

1. H9c2細胞を6ウェルプレートに1 × 10⁵ 細胞の密度で播種します。介入後に上清を収集し、製造元の指示に従ってLDHおよびSODレベルを検出します( 材料表を参照)。
2. 上清を採取し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で一度洗浄します。細胞ライセートを培養皿に加え、氷の上に20分間放置します。培養皿から遠沈管に液体を採取する。
3. 製造元の指示に従って、CK、MDA、GSH-PX、およびCATレベルを検出します²³(材料および補足ファイルの表1を参照)。
4. ビシンコニン酸(BCA)法により溶解の全タンパク質濃度を検出し、CK、MDA、GSH-PX、およびCAT²⁴の濃度を補正します( 材料表参照)。

4. ROSの測定

1. H9c2細胞を48ウェルプレートに5 × 10³ 細胞の密度で播種します。DCFH-DA( 材料表参照)を無血清培地で1:1,000の比率で希釈します。細胞上清を捨て、無血清培地で細胞を2回洗浄します。
2. 150 μLの希釈DCFH-DAを各ウェルに加え、37°Cで20分間インキュベートします。無血清培地で細胞を3回洗浄し、蛍光顕微鏡で画像を撮影します( 材料表を参照)。

5. ミトコンドリア膜電位の検出

1. JC-1ミトコンドリア膜電位アッセイキット²⁵ を用いてミトコンドリア膜電位を検出する( 材料表参照)。培養液を廃棄し、無血清培地で一度洗浄します。
2. JC-1作業溶液を各チューブに追加し、よく混ぜます。37°Cで20分間インキュベートし、JC-1染色バッファーで細胞を2回洗浄します。各ウェルに完全な培地を添加し、蛍光顕微鏡で写真を撮影します。

6. TUNEL染色アッセイ

1. TUNELアポトーシスアッセイキット( 材料表を参照)を使用して、アポトーシス率を測定します²⁶。上清を捨て、ペレットを無血清培地で一度洗浄します。
2. 細胞固定液を加え、室温で30分間インキュベートした後、PBSで1回洗浄します。
3. 各ウェルに0.3%トリトン-100を加え、室温で5分間インキュベートします。細胞をPBSで2回洗浄します。TUNEL検出作業溶液を加え、暗所で37°Cで60分間インキュベートします。
4. 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI; 材料表参照)を含む抗蛍光消光シーリング錠剤を添加し、蛍光顕微鏡で写真を撮影します。

7. mCherry GFP-LC3Bアデノウイルスのトランスフェクションによるオートファジーフローのモニタリング

1. 各ウェルの培地の半分を新しい培地と交換します。Ad-mCherry GFP-LC3Bアデノウイルス(感染多重度[MOI]2)を培地に加え、5 μg/mLポリブレン( 材料表参照)を加えて感染効率を向上させます。
2. 24時間後に新鮮な培地を交換し、共焦点顕微鏡で蛍光タンパク質の発現を観察します。
3. ウイルス感染の成功を確認した後、セクション1と同じ条件で細胞を培養し、共焦点顕微鏡²⁷で画像を撮影する。
   注:細胞の20%以上が緑色蛍光タンパク質(GFP)蛍光を示し、感染が成功したことを示しています。

8. ウェスタンブロット解析

1. 全タンパク質抽出のために細胞を収集し、氷上で30分間溶解します(RIPA、プロテアーゼ阻害剤、およびホスファターゼ阻害剤= 100:1:1; 材料表を参照)。
2. タンパク質定量後にタンパク質サンプルに5倍タンパク質ローディングバッファーを加え、サンプルを10分間煮沸します。
3. 等量のタンパク質を含む試料をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)ゲル²⁸で電気泳動する。次に、サンプルをポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに転写します。
4. PVDFメンブレンを5%脱脂粉乳で1時間ブロックし、一次抗体(PINK1、Parkin; 材料表を参照)と4°Cで一晩インキュベートし、二次抗体を室温で1時間インキュベートします。
5. 増強化学発光(ECL)溶液と化学発光検出システムを使用して、ターゲットバンドを検出します。Image Jソフトウェアを使用して、デンシトメ^トリー28でバンドを定量化します。

9. 免疫蛍光法によるパーキンミトコンドリア転座の検出

1. パーキンとミトコンドリアの共局在を二重免疫蛍光染色により観察します。各群の細胞上清を捨て、PBSで3回洗浄した。
2. 細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、PBSに0.1%トリトン-100を加えます。
3. 動物を含まないブロック溶液( 材料表を参照)で1時間ブロックして、タンパク質と抗体間の非特異的結合を防ぎ、蛍光バックグラウンドを低減します。
4. 一次抗体(ParkinおよびTom20; 材料表を参照)とともに4°Cで一晩インキュベートします。
5. 蛍光二次抗体( 材料表を参照)を添加し、暗所で1時間インキュベートします。
6. DAPI含有抗蛍光消光錠剤を添加し、共焦点顕微鏡で画像を撮影します。

10. 統計解析

1. グラフ作成および分析ソフトウェアを使用して統計分析を実行します( 材料表を参照)。
2. 一元配置分散分析を使用してグループ間で連続変数を比較します。 p < 0.05は統計的に有意であると考えられた。

Results

細胞生存率に対するクロセチンの影響
0.1 μM、0.5 μM、1 μM、5 μM、10 μM、50 μM、および100 μMのクロセチンは細胞に対して有意な増殖効果を示し、200 μMを超える濃度のクロセチンはH9c2細胞の増殖を有意に阻害しました(図1A)。400μM H 2 O₂で4時間処理した後、細胞生存率はかなり低下し、クロセチンはこの変化をある程度逆転させることができた(図1B)。H2O2誘導性H9c2細胞の生存率に10μMと100μMのクロセチンの間に有意差は認められなかったため、10μMのクロセチンを高濃度として選択し、1μMおよび0.1μMをそれぞれ中用量群および低用量群として使用した。

H9c2細胞におけるLDH、CK、MDA、SOD、GSH-PX、およびCATに対するクロセチンの影響...

Discussion

高度な技術による天然薬の複雑な化合物からの効果的な成分の探索は、TCM研究²⁹のホットスポットであり、検証後の将来の医薬品開発のための実験室の証拠を提供することができます。ベニバナは「血行を促進し、うっ血を最小限に抑える」治療における代表的な薬剤であり、心筋梗塞の治療に広く使用されています^30,31。サフランはベニバナと同様の効果があると考えられており、血液循環を促進し、うっ血を取り除く効果はベニバナよりも大幅に優れています^31,32。クロセチンはサフラン³³の主要な有効成分の1つであるため、この実験の研究に使用されました。

H2O2は、心筋細胞の酸化ストレス傷害を引き起こし、心筋細胞の心筋梗塞状態をシミュレートすることができ、これは...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% トリプシン	Gibco	2323363
1% ペニシリン-ストレプトマイシン	Sigma	V900929
5x タンパク質ローディングバッファー	Beijing Pulilai Gene Technology	B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B アデノウイルス	ベイヨタイム	C3011
アレクサ フルーア 488-標識ヤギ 抗ウサギ IgG (H+L)	中山ゴールデンブリッジバイオテクノロジー株式会社	ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	中山ゴールデンブリッジバイオテクノロジー株式会社	ZF-0513
アニマルフリーブロッキングソリューション	CST	15019s
アンチパーキン抗体	サンタクルーズ	sc-32282
アンチPINK1抗体	ABclonal	A11435
アンチ-TOM20抗体	ABclonal	A19403
アンチβ;-アクチン 抗体	ABclonal	AC026
BCAタンパク質アッセイキット	KeyGEN Biotech	KGP902
血球計数プレート	Servicebio	WG607
CATアッセイキット	南京建城バイオエンジニアリング研究所	A007-1-1
化学発光検出システム	上海秦郷科学機器工場	ChemiScope 6100
CKアッセイキット	南京建城バイオエンジニアリング研究所	A032-1-1
コエンザイムQ10 (CoQ 10)	マックリン	C6129
クロセチン	成都瑞辰齭工房	RFS-Z01802006012
DAPI含有抗蛍光消光剤	中山ゴールデンブリッジバイオテクノロジー株式会社	ZLI-9557
DCFH-DA	Beyotime	S0033S
DMSO	Solarbio	D8371
ダルベッコの修飾イーグル培地 (DMEM)	Gibco	8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution	NCM Biotech	P10100
Fetal bovine serum (FBS)	Corning-Cellgro	35-081-CV
GraphPad プリズム 7.0	https://www.graphpad.com/
GSH-Pxアッセイキット南	京建城バイオエンジニアリング研究所	A005-1-2
H9c2心筋細胞	北京Dingguochangshengバイオテクノロジー株式会社	CS0062
西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ヤギIgG(H + L)	中山ゴールデンブリッジバイオテクノロジー株式会社	ZB-2305
西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗マウスIgG(H + L)	中山ゴールデンブリッジバイオテクノロジー株式会社	ZB-2301
JC-1 ミトコンドリア膜電位アッセイキット	LABLEAD	J22202
LDH アッセイキット	南京建城バイオエンジニアリング研究所	A020-2-2
MDA アッセイキット	南京建城バイオエンジニアリング研究所	A003-2-2
メタノール	アラジン	A2114057
MTS アッセイ	プロメガ	G3581
パーヒドロール	G-clone	CS7730
ホスファターゼ阻害剤	CWBIO	CW2383
ポリブレン	Beyotime	C0351
ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜	ミリポア	ISEQ00010
ラジオ免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解バッファー	Solarbio	R0010
SDS-PAGEゲル	上海エピザイムバイオメディカルテクノロジー	PG112
SDS-PAGEランニングバッファーパウダー	Servicebio	G2018-1L
SDS-PAGE転写バッファーパウダー	Servicebio	G2017-1L
SODアッセイキット	南京建城バイオエンジニアリング研究所	A001-2-2
トリス緩衝生理食塩水パウダー	Servicebio	G0001-2L
Triton X-100	Sigma	SLCC9172
TUNELアポトーシスアッセイキット	Beyotime	C1086
Tween-20	Solarbio	T8220