本研究では、 クロ セチンが心筋細胞の酸化ストレス損傷を修復するメカニズムを、PINK1/Parkinシグナル伝達経路が重要な役割を果たすマイトファジーに影響を与えることで明らかにしました。
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この記事について
サマリー
要約
この研究は、in vitro実験を通じて、H 2 O2を介したH9c2心筋細胞に対するクロセチンの酸化ストレス保護効果を調査し、そのメカニズムがマイトファジーの影響に関連しているかどうかをさらに調査することを目的としています。この研究はまた、心筋細胞の酸化ストレスに対するベニバナ酸の治療効果を実証し、そのメカニズムがマイトファジーの効果に関連しているかどうかを調べることも目的としています。ここでは、H2O2ベースの酸化ストレスモデルを構築し、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、クレアチンキナーゼ(CK)、マロンジアルデヒド(MDA)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、カタラーゼ(CAT)、およびグルタチオンペルオキシダーゼ(GSH Px)のレベルを検出することにより、心筋細胞の酸化ストレス傷害の程度を評価しました。活性酸素種(ROS)検出蛍光色素DCFH-DA、JC-1色素、およびTUNEL色素を使用して、ミトコンドリアの損傷とアポトーシスを評価しました。オートファジーフラックスは、Ad-mCherry-GFP-LC3Bアデノウイルスをトランスフェクトすることによって測定した。次に、マイトファジー関連タンパク質をウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光法で検出しました。しかしながら、クロセチン(0.1〜10μM)は、細胞生存率を有意に改善し、H 2 O2によって引き起こされるアポトーシスおよび酸化ストレス損傷を減少させる可能性がある。過剰なオートファジー活性化を有する細胞では、クロセチンはオートファジーの流れとマイトファジー関連タンパク質PINK1およびパーキンの発現を減少させ、パーキンのミトコンドリアへの移行を逆転させる可能性がある。クロセチンは、H 2O2を介した酸化ストレス損傷およびH9c2細胞のアポトーシスを減少させることができ、そのメカニズムはマイトファジーと密接に関連していた。
概要
急性心筋梗塞(AMI)は、冠状動脈への重度で持続的な虚血と低酸素によって引き起こされる生命を脅かす心筋壊死です1,2。経皮的冠動脈インターベンション(PCI)は、AMIの第一選択治療戦略の1つであり、通常、心筋細胞を虚血性損傷から保護します3,4。遠位心筋は、AMI後に迅速かつ効果的に治療されない場合、血液と酸素の供給が不足し、虚血性壊死とさらなる心血管合併症を引き起こします5,6。心筋細胞の回復を促進し、PCI手術の機会を逃した後の不可逆的な心筋損傷を最小限に抑えることは、研究のホットスポットとなっています。AMI後、心筋細胞は虚血と低酸素状態にあり、その結果、ミトコンドリアの酸化的リン酸化が阻害され、NAD+がNADPHに還元され、単電子還元が増加します7。その結果、酸素の不完全な還元反応は過剰な活性酸素種(ROS)を生成し、最終的には心筋細胞8への酸化ストレス損傷につながる。ROSの過剰な蓄積は脂質過酸化を引き起こし、ミトコンドリア膜の構造と機能をさらに破壊します。その結果、ミトコン....
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プロトコル
実験は、中国の北京中医薬大学の生理学研究室で行われました。すべての研究方法は、北京大学の関連ガイドラインおよび規制に従って実施されました。
1. 細胞培養
- 10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンをダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)基本培地(4.5 g/L D-グルコース、4.g.g/L L-グルタミン、および110 mg/Lピルビン酸ナトリウムを含む; 材料表を参照)に添加して、DMEM完全培地を調製します。
- 液体窒素凍結H9c2心筋細胞( 材料表を参照)を37°Cの温水で解凍し、氷が溶けるまですばやく均一に攪拌します。
- 細胞を遠沈管に移し、DMEM完全培地の4倍の容量を加えます。358 x g で室温で5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を廃棄します。
- 得られた細胞懸濁液を培養液で希釈し、穏やかに吹き、培養フラスコに細胞を接種する。インキュベーター内で37°C、5%CO2で培養する。
2.細胞生存率の決定
- クロセチン( 材料表参照)をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、0.....
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結果
細胞生存率に対するクロセチンの影響
0.1 μM、0.5 μM、1 μM、5 μM、10 μM、50 μM、および100 μMのクロセチンは細胞に対して有意な増殖効果を示し、200 μMを超える濃度のクロセチンはH9c2細胞の増殖を有意に阻害しました(図1A)。400μM H 2 O2で4時間処理した後、細胞生存率はかなり低下し、クロセチンはこの変化をある程度逆転させることができた(図1B)。H2O2誘導性H9c2細胞の生存率に10μMと100μMのクロセチンの間に有意差は認められなかったため、10μMのクロセチンを高濃度として選択し、1μMおよび0.1μMをそれぞれ中用量群および低用量群として使用した。
H9c2細胞におけるLDH、CK、MDA、SOD、GSH-PX、およびCATに対するクロセチンの影響.......
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ディスカッション
高度な技術による天然薬の複雑な化合物からの効果的な成分の探索は、TCM研究29のホットスポットであり、検証後の将来の医薬品開発のための実験室の証拠を提供することができます。ベニバナは「血行を促進し、うっ血を最小限に抑える」治療における代表的な薬剤であり、心筋梗塞の治療に広く使用されています30,31。サフランはベニバナと同様の効果があると考えられており、血液循環を促進し、うっ血を取り除く効果はベニバナよりも大幅に優れています31,32。クロセチンはサフラン33の主要な有効成分の1つであるため、この実験の研究に使用されました。
H2O2は、心筋細胞の酸化ストレス傷害を引き起こし、心筋細胞の心筋梗塞状態をシミュレートすることができ、これは.......
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開示事項
著者には、宣言する利益相反はありません。
謝辞
本研究は、北京自然科学基金会(第7202119号)と中国国家自然科学基金会(第82274380号)の支援を受けて行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.25% トリプシン | Gibco | 2323363 | |
| 1% ペニシリン-ストレプトマイシン | Sigma | V900929 | |
| 5x タンパク質ローディングバッファー | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B アデノウイルス | ベイヨタイム | C3011 | |
| アレクサ フルーア 488-標識ヤギ 抗ウサギ IgG (H+L) | 中山ゴールデンブリッジバイオテクノロジー株式会社 | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | 中山ゴールデンブリッジバイオテクノロジー株式会社 | ZF-0513 | |
| アニマルフリーブロッキングソリューション | CST | 15019s | |
| アンチパーキン抗体 | サンタクルーズ | sc-32282 | |
| アンチPINK1抗体 | ABclonal | A11435 | |
| アンチ-TOM20抗体 | ABclonal | A19403 | |
| アンチβ;-アクチン 抗体 | ABclonal | AC026 | |
| BCAタンパク質アッセイキット | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| 血球計数プレート | Servicebio | WG607 | |
| CATアッセイキット | 南京建城バイオエンジニアリング研究所 | A007-1-1 | |
| 化学発光検出システム | 上海秦郷科学機器工場 | ChemiScope 6100 | |
| CKアッセイキット | 南京建城バイオエンジニアリング研究所 | A032-1-1 | |
| コエンザイムQ10 (CoQ 10) | マックリン | C6129 | |
| クロセチン | 成都瑞辰齭工房 | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI含有抗蛍光消光剤 | 中山ゴールデンブリッジバイオテクノロジー株式会社 | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| ダルベッコの修飾イーグル培地 (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad プリズム 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Pxアッセイキット南 | 京建城バイオエンジニアリング研究所 | A005-1-2 | |
| H9c2心筋細胞 | 北京Dingguochangshengバイオテクノロジー株式会社 | CS0062 | |
| 西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ヤギIgG(H + L) | 中山ゴールデンブリッジバイオテクノロジー株式会社 | ZB-2305 | |
| 西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗マウスIgG(H + L) | 中山ゴールデンブリッジバイオテクノロジー株式会社 | ZB-2301 | |
| JC-1 ミトコンドリア膜電位アッセイキット | LABLEAD | J22202 | |
| LDH アッセイキット | 南京建城バイオエンジニアリング研究所 | A020-2-2 | |
| MDA アッセイキット | 南京建城バイオエンジニアリング研究所 | A003-2-2 | |
| メタノール | アラジン | A2114057 | |
| MTS アッセイ | プロメガ | G3581 | |
| パーヒドロール | G-clone | CS7730 | |
| ホスファターゼ阻害剤 | CWBIO | CW2383 | |
| ポリブレン | Beyotime | C0351 | |
| ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜 | ミリポア | ISEQ00010 | |
| ラジオ免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解バッファー | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGEゲル | 上海エピザイムバイオメディカルテクノロジー | PG112 | |
| SDS-PAGEランニングバッファーパウダー | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE転写バッファーパウダー | Servicebio | G2017-1L | |
| SODアッセイキット | 南京建城バイオエンジニアリング研究所 | A001-2-2 | |
| トリス緩衝生理食塩水パウダー | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNELアポトーシスアッセイキット | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
参考文献
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
- Abbate, A., et a....
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再版と許可
