方法論記事

フェリチノファジー:ヒト線維芽細胞におけるオートファジーによる鉄の選択的分解の評価

2K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/65110

⸱

2024年2月23日

 , 
1Interfaculty Institute of Cell Biology, Eberhard Karls University Tübingen

この記事について

サマリー

このプロトコールでは、皮膚由来の一次ヒト線維芽細胞において、ハイスループットの免疫蛍光ベースのフェリチノファジー評価を実施するための詳細な手順を提供します。

要約

オートファジー遺伝子 WDR45/WIPI4 の変異は、患者の脳内に鉄沈着物が存在することから脳鉄蓄積を伴う神経変性(NBIA)として知られるヒト疾患の亜型であるβプロペラ関連神経変性(BPAN)の原因となります。細胞内の鉄レベルは、フェリチノファジーの重要なメカニズムを含む多くの細胞メカニズムによって厳密に制御されています。この論文では、フェリチノファジーを皮膚由来の一次ヒト線維芽細胞でどのように評価できるかについて説明します。このプロトコルでは、細胞レベルでフェリチノファジーを誘導または阻害するための鉄調節条件を使用します。例えば、リソソーム機能を阻害するためのバフィロマイシンA1の投与や、鉄を過負荷または枯渇させるためのクエン酸第二鉄アンモニウム(FAC)またはデフェラシオックス(DFX)治療などです。このような処理された線維芽細胞は、その後、内因性フェリチンおよびオートファゴソーム/リソソームマーカー(ここではLAMP2)のハイスループットイメージングおよびCellProfilerベースの定量的局在分析にかけられます。オートファゴソーム/リソソームフェリチンのレベルに基づいて、フェリチノファジーのレベルに関して結論を導き出すことができます。このプロトコルは、BPAN患者由来の初代線維芽細胞または他のタイプの哺乳動物細胞におけるフェリチノファジーの評価に使用できます。

概要

WIPI(WD-repeat interacting with phosphoinositides)タンパク質は、オートファジー1において異なる役割を果たす進化的に保存されたPI3Pエフェクターです。4つのヒトWIPIタンパク質(WIPI1からWIPI4)は、7枚羽根のβプロペラに折り畳まれ、進化的に保存された2つの領域があり、相同アミノ酸と不変アミノ酸がプロペラの反対側の部位に集まっています。1つの部位は、プロペラブレード5とブレード6のホスホイノシチド結合領域と整列しています。もう一方の部位は、WIPIがオートファジー機構またはオートファジー調節因子の異なるメンバーと会合するタンパク質間相互作用領域に整列しています2。

WIPI4は、エネルギー駆動型オートファジー制御の制御と、成長する新生オートファゴソーム3のサイズの制御レベルで機能します。WDR45と呼ばれるWIPI4遺伝子の変異は、ベータプロペラ関連神経変性(BPAN)の原因であり、これはヒト患者の脳鉄蓄積(NBIA)サブタイプを伴う神経変性であり、黒質および淡白球4の低信号鉄ハローを特徴とする。BPAN患者に異常な鉄沈着物が存在すると、脳症、全体的な発達遅延、発作、そして最終的にはパーキンソニズム、認知症、痙縮につながるニューロンの損傷を引き起こします5。

鉄の恒常性は、複数の細胞メカニズムによって厳密に制御されており、細胞質の鉄の濃度は、鉄キャリア、鉄トランスポーター、および鉄貯蔵タンパク質の発現レベルと機能によって制御されています6 。次に、細胞質の鉄の濃度は、フェリチノファジー7 や酸化フェリチン8 のプロテアソームクリアランスなどの分解経路が関与しているかどうかを決定します。

フェリチノファジー中、フェリチンはカーゴ受容体NCOA4によってオートファゴソームに選択的に動員され、細胞内の鉄レベルが低いことに応答してリソソーム分解を標的とします7。オートファゴソーム膜3のサイズを調節するWIPI4の役割を考えると、この特定の機能の喪失がオートファゴソーム中のフェリチンの選択的隔離、ひいてはフェリチノファジーに影響を与える可能性があると予測するのは合理的です。鉄代謝におけるこの重要なステップを研究することで、BPAN患者の治療選択肢への扉が開かれるかもしれません。しかし、ヒト細胞のフェリチノファジーを研究するために一般的に使用されるプロトコルは、現在開発されているばかりです。

この論文では、ヒト細胞のフェリチノファジーを評価するためのハイスループットの蛍光ベースの方法について説明します。このアッセイを患者由来のBPAN細胞に適用することで、フェリチノファジーが健康なヒト細胞とどのように異なるかについての貴重な洞察を得ることができ、この希少なヒト疾患の根底にある分子メカニズムを理解するためのベンチマークとして役立つ可能性があります。

プロトコル

1. 初代細胞の培養と播種

  1. 凍結した細胞の入ったバイアルを液体窒素タンクから取り出し、細胞培養室に到達するまで氷上に置いておきます。以前に滅菌したフードで、バイアルを手に持って細胞懸濁液を解凍します。細胞を再懸濁し、10%ウシ胎児血清(FCS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)を含む9mLの予熱DMEMを入れた10cm細胞培養プレートに移します。細胞がプレート上に均一に分布するように穏やかに振とうし、37°Cおよび5%CO2で一晩インキュベートします
  2. 翌朝、細胞が付着していることを確認するために細胞を見てください。培地を新鮮なDMEM + 10% FCS + 1%P/Sに変更し、細胞が80%のコンフルエント度に達するまで増殖させます。
  3. 培地を取り出し、DPBSで2回洗浄し、1 mLのトリプシンをプレートに加え、37°Cおよび5%CO2 で10分間インキュベートします。9 mLのDMEM + 10% FCSをプレートに加え、細胞を再懸濁します。
  4. 細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移します。ノイバウアーチャンバーを使用して手動で細胞数を決定し、細胞濃度が40,000細胞/mLに達するまで、DMEM + 10% FCSで細胞懸濁液を希釈します。
  5. ガラス底の96ウェルプレートで、細胞懸濁液の100 μL/ウェルを播種します。37°Cおよび5%CO2 で16時間インキュベートします。

2. 治療

  1. 材料表に従って、以下の処理を準備します:制御媒体、鉄キレート化用の制御培地とデフェラシオックス(DFX)、または鉄負荷用の制御培地とクエン酸第二鉄アンモニウム(FAC)です。フェリチノファジーフラックスの評価のために、リソソーム阻害剤(バフィロマイシンA1)の存在下と非存在下の両方ですべての治療を準備します。.
  2. プレートから培地を取り出し、対応する処理剤(100 μL/ウェル)と交換します。
  3. 37°Cおよび5%CO2 で6時間インキュベートします。

3. 固定・染色

  1. 処理媒体を吸引し、DPBS(Table of Materials)で2回洗浄します。
  2. ウェルあたり100 μLの3.7%パラホルムアルデヒド(PFA、 Table of Materials)を添加します。細胞を室温で20分間、暗闇の中で固定します。
  3. PFAを取り出し、PBS/T(Table of Materials)で細胞を2回洗浄します。
  4. 1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBS/T中で、4°Cで1時間ブロックします。
  5. 一次抗体(材料表)をPBS/T(フェリチン抗体1:50、LAMP2抗体1:50)に混ぜて調製します。
  6. 細胞をPBS/Tで2回洗浄し、1ウェルあたり50μLの抗体ミックスをアプライします。プレートをパラフィルムで包み、4°Cで一晩インキュベートします。
  7. 翌朝、二次抗体(Table of Materials)ミックス(1:200)をPBS/Tで調製します。
  8. 細胞をPBS/Tで2回洗浄し、1ウェルあたり50 μLの二次抗体ミックスをアプライします。暗所で4°Cで1時間インキュベートします。
  9. 5 μg/μL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、 材料表)溶液を室温PBSで調製します。
  10. 細胞をPBS/Tで2回洗浄し、DAPI染色液を100 μL/ウェル加えます。暗所で室温で20分間インキュベートします。
  11. 細胞をPBSで2回洗浄し、各ウェルに50μLのPBSを加えます。プレートをパラフィルムで包み、暗所で4°Cで保管します。

4. 共焦点レーザー走査型顕微鏡による自動イメージング

  1. プレート内のPBSを室温で50μLの新鮮なPBSと交換します。
  2. プレートをアルミホイルで覆い、顕微鏡室に持って行きます。
  3. 共焦点レーザー走査型顕微鏡の電源を入れ、顕微鏡テーブルに96ウェルプレート用のサンプルホルダーをセットし、適切な対物レンズ(ここでは40倍)を選択します。詳細については、 表 1 を参照してください。
  4. イメージング設定を調整します(表1)。
    1. Smart Setupで、レーザーとフィルターを選択し、それらをトラック(トラック1〜3)に割り当てて、最適な画質と速度を実現します(表1)。
    2. 実験の種類を選択するときは、[タイル]をクリックして、プレート上の決定されたX、Y位置を選択して保存するオプションを有効にします。
    3. イメージングセットアップモジュールで、集録チャンネル、それらに割り当てられたトラック、およびそれらの励起波長と発光波長を視覚化します(表1)。
    4. Acquisition Modeモジュールで、以下を選択します。 Scan Speed: 6;方向:双方向;平均:2倍;ピクセルあたりのビット数: 8。
    5. チャンネルモジュールで、各チャンネルのレーザー出力、ピンホール、マスターゲインを個別に調整します(表2)。これらのパラメータを微調整して、画像を飽和させすぎないように適切に露出します。
    6. フォーカス戦略モジュールをクリックします。
      1. [ソフトウェア オートフォーカスとデフィニスト フォーカスを組み合わせる] を選択します。
      2. [Reference Channel and Offsets] で、最も安定している/最も明るいチャンネルをリファレンスとして選択します (通常は DAPIまたは488 nm)。
      3. 安定化イベントの繰り返しと頻度(Stabilization Event Repetitions and Frequency)で、標準(Standard)を選択します。
    7. ソフトウェアオートフォーカスモジュールで、次の項目を選択します。 強度;検索 |賢い;サンプリング |いい;相対範囲。
    8. タイルモジュールをクリックします。
      1. [ポジション] | [シングル ポジション] を選択します。
      2. [Advanced Setup]で、プレート内を移動し、イメージングの位置を特定し、[Position Setup]タブの[+]ボタンをクリックします。
      3. 各位置に、画像メタデータに記録される追加情報のラベルを付けます。これを行うには、[プロパティ]タブを開き、[カテゴリ]ドロップダウンメニューの横にあるホイールアイコンをクリックし、[新規]をクリックして、新しいカテゴリ名を入力する新しいダイアログボックスを開きます。特定のポジションにカテゴリーを割り当てるには、ポジションを選択し、[プロパティ]タブをクリックして、[カテゴリー]ドロップダウンメニューに移動し、対応するラベルを選択します。
        注:各処理のカテゴリを作成して、細胞が受けた処理で各位置にラベルを付けることをお勧めします。
      4. [Sample Carrier]で、[Multiwell 96-Cellvis]ガラス底部#0を選択します。「キャリブレーション」をクリックして、マイクロスコープをプレート表面にキャリブレーションします。システムの仕様に応じて、1ポイントまたは7ポイントのキャリブレーションを選択します。
      5. [オプション] で、タイルの重なりを 10% に選択します。[Tile Regions の移動] で、[コーム] を選択します。ステージ制御からステージ速度を使用する、ステージ制御からステージ加速度を使用する、および取得中に画像ピラミッドにチェックマークを付けます。
  5. 画像取得を実行し、画像結果(cziファイル)と画像メタデータ(csvファイル)をポータブルハードドライブに保存します。
  6. 画像をTIFFファイルとしてエクスポートします。

5. ハイスループットな画像解析

    6. データ分析

    1. 解析を実行した後、ソフトウェアが結果を含む一連の表形式テキスト ファイルを作成するのを待ちます。提供されている CellProfiler パイプライン (補足ファイル 1) を使用している場合は、次の出力ファイルを探します。
      1. CellProfilerOutputCells ファイルには、ソフトウェアによって割り当てられた画像番号、単一セルに割り当てられたセル番号、元のファイル名、ファイルの保存場所を示すパス、セルあたりの点数 (ferritin, LAMP2)、セルあたりの平均点面積 (ferritin, LAMP2) が一覧表示されます。
      2. CellProfilerOutputExperiment ファイル: 実験に関連する技術的な詳細 (ソフトウェアのバージョン、画像チャネル、メタデータタグなど) に関する情報を提供します。
    2. これらのファイルをスプレッドシートとして開きます。
    3. 優先統計ソフトウェア(Table of Materials)を使用して、puncta countsとpuncta共局在数の統計分析に進みます。

    結果

    健康なドナー(図 1A)に由来するヒト皮膚由来の初代線維芽細胞(F-CO-60)を、バフロマイシン A1 処理とそれに続く内因性フェリチンおよび LAMP2 の免疫染色、自動画像解析、および CellProfiler ベースの解析(図 1B)を用いたフェリチノファジー評価用に調製しました。

    内因性フェリチンとLAMP2の共局在は、バフィロマイシンA1の添加によりフェリチンのリソソーム分解が阻害された後に増加し、これはリソソームV-ATPase酵素を阻害し、したがってフェリチノファジーを阻害する能力と一致しています7（図2)。さらに、ソフトウェアベースの細胞認識、フェリチン認識、LAMP2認識を例として示します(図2)。

    この点で、ここで概説したCellProfilerパイプラインは非常に汎用性が高く、機能的なシングルセルマーカーシステムのコンテキストで、特定のBPAN変異が細胞増殖、ミトコンドリア、またはその他のオルガネラに及ぼす影響を評価するなど、追加のおよび/または代替の読み出しに適応できることに注意する必要があります。

    figure-results-1
    図1:実験の概要。 (A)フェリチノファジーのプロセス、および(B)このプロトコルに記載されているように、初代皮膚由来ヒト線維芽細胞のフェリチノファジーを評価するための実験ワークフローのグラフ表現。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

    figure-results-2
    図2:代表的な画像。 (A)バフィロマイシンA1の不存在下または(B)存在下で、対照培地(供給条件)中の初代皮膚由来ヒト線維芽細胞を、抗フェリチン抗体および抗LAMP2抗体を用いた間接免疫蛍光分析を行い、細胞核をDAPIで染色した。共焦点レーザー走査型顕微鏡法の自動化により取得された例示的な蛍光画像を示します(スケールバー:10μm)。フェリチンとLAMP2の存在量と共局在の変化は、バフィロマイシンA1投与によるリソソーム阻害で観察できました。.CellProfilerベースの解析も表示され、細胞認識(紫)、核(青)、フェリチン(緑)、LAMP2(赤)、共局在フェリチン/LAMP2(黄)プンクタのソフトウェア由来の画像オーバーレイが表示されます。(C)拡大画像切片(スケールバー=10μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

    表1:この研究で使用した共焦点レーザー走査型顕微鏡の設定。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

    表2:この研究で使用したCellProfilerの数値設定。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

    補足ファイル1:この研究で使用したCellProfilerパイプライン。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

    補足ファイル 2: CellProfiler パイプライン (補足ファイル 1 を参照) と、連続した順序で撮影されたスクリーンショット (表 2 を参照) の表示。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

    ディスカッション

    この方法は、自動蛍光顕微鏡法とオープンアクセスのCellProfilerベースの画像解析9を組み合わせて、主要なフェリチノファジー因子の細胞内局在を評価するもので、選択的オートファジー(フェリチノファジー7)によるリソソームフェリチンクリアランスの有効性に関する貴重な情報を提供するように設計されています.このプロトコルにより、複数の細胞株と処理を同時に行う大きなサンプルセットの取り扱いが可能になり、フェリチンプンクタ数やフェリチンプンクタ数などの必要な読み出しの評価が可能になります。これは、フェリチノファジーフラックスを評価するための典型的なリソソームマーカーであるLAMP2と共局在しています。ただし、ここで強調しておきたいのは、正確な自動画像解析は画質に依存し、画像品質は抗体の特異性と最適なイメージングに依存するということです。したがって、ソフトウェアベースの画像解析は、高品質の画像でのみ実行する必要があります。

    細胞内の鉄レベルの調節は、疾患の状況下で鉄の恒常性を調節するために活性化されるメカニズムに関する貴重な情報を提供することができます。この論文では、鉄負荷剤および鉄キレート剤で処理した患者由来細胞のBPAN疾患を研究する方法について説明します。Deferasiox(DFX)は、フィールドで広く使用されている既知の鉄キレート剤です10。適用すると、細胞質内の遊離鉄をトラップし、鉄飢餓に対する細胞応答を引き起こします。本研究の目的はフェリチノファジーを評価することであったため、細胞から鉄を奪うことは、細胞の鉄プールを補充するための補償メカニズムとして、オートファジー を介して フェリチン分解を促進する直接的な方法でした。それとは対照的に、クエン酸第二鉄アンモニウム(FAC)は、セルに鉄をロードするために使用されます。細胞は、過剰な、したがって有毒な細胞質の鉄濃度に対する応答としてフェリチン合成を活性化します11。したがって、クエン酸第二鉄アンモニウムは、フェリチン合成とフェリチンヘテロポリマー内の鉄の捕捉を促進し、フェリチンファジーを活性化することができます。

    フェリチンファジーフラックスを研究するために、このプロトコルでは、プロセスの主要なプレーヤーであるフェリチンとリソソーム(ここではLAMP2でマーク)を選択的に染色し、それらの共局在を評価します。共局在するpunctaの割合が高いことは、フェリチンの効果的なリソソーム分解を示しています。このような実験から得られる情報を最大化するために、追加の色素またはマーカー抗体を使用することができます。

    注目すべきは、この方法に固有の技術的な課題があることです。異なるヒトドナーに由来する一次線維芽細胞は、 in vitroで異なる増殖および増殖を遂げる可能性があります。したがって、同等の結果を得るには、異なる細胞を同じ継代で播種する必要があります。したがって、このプロトコルに進む前にテスト実験を行い、使用する細胞または細胞株の倍加時間を調べることをお勧めします。

    この方法は、フェリチノファジーの研究に限定されません。使用する治療法や抗体を変更するだけで、他のさまざまな選択的オートファジー経路の評価に再利用できます。例えば、ミトコンドリアストレス誘導剤としてCCCPを使用し、染色にはオプチニューリン、LC3、およびLAMP2抗体を用いることでマイトファジーを調べることができる12。

    全体として、自動画像取得とCellProfiler解析の組み合わせは、単一ヒト線維芽細胞のハイスループット機能評価のための強力なツールを構成しています。これは、患者由来細胞と健康なドナー由来細胞の大規模なコホートの分析と比較が非常に興味深いヒト疾患の研究に特に関連します。

    開示事項

    著者は、利益相反を宣言しません。

    謝辞

    この研究は、Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) Project-ID 259130777 - SFB 1177 (project E03) の助成を受けて行われました。 図 1 は BioRender を使用して作成しました。

    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    細胞株
    初代皮膚由来ヒト線維芽細胞 皮膚生検、健康なヒトドナー、バイオバンク大学クリニックTübingen、倫理承認 389/2019BO2F-CO-60、継代 9
    細胞培養治療最終濃度 (化合物)
    対照培地DMEM 10%FCS(DMSOのみ)
    対照培地 + バフィロマイシンA1DMEM 10%FCS100 nM バフィロマイシンA1
    対照培地 + deferasiox (DFX)DMEM 10%FCS30 & マイクロ;M DFX
    コントロール培地 + DFX + バフィロマイシンA1DMEM 10%FCS30 &M DFX、100 nM バフィロマイシン A1
    対照培地 + クエン酸第二鉄アンモニウム (FAC)DMEM 10%FCS0.05 mg/mL FAC
    対照培地 + FAC + バフィロマイシンA1DMEM 10%FCS0.05 mg/mL FAC、100 nM バフィロマイシン A1
    Material
    Albumin [BSA] フラクション VAppliChemA1391
    Alexa 488 ヤギ a-ウサギライフテクノロジーズ A-11008
    アレクサ 546 ヤギ a-マウスライフテクノロジーズ A-11003
    バフィロマイシン A1シグマ アルドリッチ196000
    BioLite 細胞培養 10cm皿サーモサイエンティフィック130182
    DAPIアプリケムA4099
    デフェラシオックス (ICL-670)セレックケムS1712
    DMEM GlutamaxGibco31966
    DMSO AppliChemA3672
    DPBS カルシウムもマグネシウムも使用しないGibco14190094
    ウシ胎児血清 (FCS)Gibco10437-028
    クエン酸第二鉄アンモニウム (FAC)メルクF5879
    抗フェリチン (ヒト脾臓)ロックランド200-401-090-0100
    LAMP2 (H4B4)Santa CruzSc-18822
    パラホルムアルデヒド(PFA)Sigma-Aldrich441244
    PBS 10x Dulbecco'sAppliChemA0965
    PenStrep (1,00U/mL ペニシリン、100 mg/mL ストレプトマイシン)Life Technologies15140-122
    Trypsin-EDTA (0.05%) with phenol redGibco25300
    Tween20AppliChemA4974
    96 well glass-bottom #0 platesCellvisP96-0-N
    Solution
    3.7%パラホルムアルデヒド(PFA)PBSに溶解したPFA、pH 7.5 
    バフィロマイシンA1 100 mMストックバフィロマイシンA1をDMSOで希釈
    エン酸第二鉄アンモニウム(FAC) 100 mg/mLストックFACをオートクレーブ二重蒸留水で希釈
    PBS/TPBS、10% Tween20 
    PBS / T + BSAPBS、10%Tween20、1%BSA 
    Software
    CellProfiler 4.2.4https://cellprofiler.org/
    GraphPad PrismDotmatics
    Microsoft Excel Version 16.50Microsoft Office Plus 365
    ク

    参考文献

    1. Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome. Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).
    2. Proikas-Cezanne, T., et al. WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy. Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).
    3. Bakula, D., et al. WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy. Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).
    4. Hayflick, S. J., et al. β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation. Brain. 36, 1708-1717 (2013).
    5. Wilson, J. A. -O., et al. Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration. Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).
    6. Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. Cellular iron metabolism and regulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).
    7. Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy. Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).
    8. Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants. Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).
    9. Schüssele, D. S., et al. Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis. Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).
    10. Goodwin, J. M., et al. Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9. Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).
    11. Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).
    12. Zachari, M., et al. Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform. Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).

    再版と許可

    タグ

    CellProfiler LAMP2
    フェリチノファジー:ヒト線維芽細胞におけるオートファジーによる鉄の選択的分解の評価
    お問い合わせ
    図書館に推薦する

    プライバシー

    利用規約

    ポリシー

    著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。