方法論記事

ヒト細胞株における核lncRNAの長期ノックダウンのためのツールとしてのアンチセンスオリゴヌクレオチド

DOI：

10.3791/65124

⸱

2023年9月1日

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer, Instituto Nacional de Cancerología-Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnológico de Monterrey

この記事について

サマリー

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染色体不安定性などの時間依存的なプロセスにおけるlncRNAの機能を解析するには、長期にわたるノックダウン効果を達成する必要があります。そのために、ここでは、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して細胞株で21日間効果的なノックダウンを達成するプロトコルを紹介します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)は、転写レベルでの遺伝子発現において重要な調節役割を果たします。実験的証拠により、lncRNAのかなりの部分が核内に優先的に蓄積することが立証されています。核内lncRNAの機能解析には、核内でこれらの転写産物を効率的にノックダウンすることが重要です。細胞質サイレンシング機構に依存する技術であるRNA干渉の使用とは対照的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)技術は、核RNA切断のためにRNase HをRNA-DNA二本鎖にリクルートすることにより、RNAノックダウンを達成できます。ゲノム工学にCRISPR-Casツールを使用するのとは異なり、クロマチン状態に変化が生じる可能性があるのに対し、ASOはゲノムを改変することなく核転写産物を効率的にノックダウンすることができます。それにもかかわらず、ASOを介したノックダウンの主な障害の1つは、その一時的な影響です。lncRNAサイレンシングの長期的な影響を研究するためには、効率的なノックダウンを長期間維持する必要があります。この研究では、21日以上ノックダウン効果を達成するためのプロトコルが開発されました。その目的は、染色体不安定性に関連する隣接するコード遺伝子RFC4に対するlncRNAノックダウンのシス制御効果を評価することでした。これは、時間と細胞の老化によってのみ観察される状態です。PrEC(正常初代前立腺上皮細胞)とHCT116(結腸直腸癌から単離された上皮細胞株)の2つの異なるヒト細胞株を使用し、アッセイした細胞株でノックダウンに成功しました。

概要

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ヒトゲノムの大部分は転写されるため、ヒトトランスクリプトーム1のアノテーションされたコード遺伝子の数を超える数を持つlncRNAを含む多種多様な転写産物が生まれます。LncRNAは、タンパク質をコードしない200ヌクレオチドより長い転写産物であり、2,3、最近では細胞内での重要な調節機能について調べられています4。それらの機能は、lncRNAのかなりの部分が蓄積し、転写調節6や核構造の保守7、他の生物学的プロセス8,9,10の中でも活発に関与する核のような細胞内局在5に依存することが示されている。

核内lncRNAの機能的評価には、核内でノックダウン(KD)を誘導できる方法を使用する必要があり、ASOは核転写産物をサイレンシングするための強力なツールです。一般に、ASOは、Watson-Crick塩基対11,12,13によって相補的RNAに結合し、その化学構造および修飾13,14に依存するメカニズムを通じてRNAの機能を改変することができる、長さが~20塩基対の一本鎖DNA配列である。ASO化学修飾は、2つの主要なグループに分けることができる:バックボーン修飾と2'糖環修飾15、どちらもヌクレアーゼに対する高い耐性を付与することによって安定性を高めることを意図しているが、意図された生物学的効果13,16も増強することを意図している。骨格修飾のうち、ホスホラミデートモルホリノ(PMO)、チオホスホラミデート、およびモルホリノ結合は、立体ブロッキング剤19として働くことにより、スプライシング17,18の干渉などの目的で広く使用されているが、転写産物の分解を誘導するものではない。別のバックボーン修飾は、ASOで最も一般的に使用される修飾の1つであるホスホロチオエート(PS)結合です。前述の修飾とは対照的に、PS結合はRNase H動員12,20を妨害しないため、RNAノックダウンを可能にする。しかし、多種多様な2'シュガーリング修飾21もあります。それにもかかわらず、RNAノックダウンの目的のために、効率的なサイレンシング効果を誘導する修飾の中には、ロック核酸(LNA)22、23および2'-O-メチル修飾24がある。LNAは、他の修飾25と比較してノックダウンに対して非常に効果的であることが証明されていますが、肝毒性26やin vivoおよびin vitro27のアポトーシス誘導などの望ましくない影響を誘発する可能性があります。

RNAノックダウンの目的のために、前述の適切な修飾を持つASOは、RNase H1およびH220,28をリクルートすることができ、これらの酵素はDNA-RNAハイブリッドにリクルートされ、標的RNAを切断してASO13を放出します。この切断のRNA産物は、次いでRNAサーベイランス機構によって処理され、クロマチン状態の修飾が望ましくない生物学的影響30を生じ得るCRISPR-Casシステムのような他の技術とは対照的に、関心のあるゲノム領域を修飾することなくRNA分解29をもたらす。ASO技術の利点にもかかわらず、細胞分裂または経時的なASO分解による一時的なサイレンシング効果は、染色体不安定性(CIN)31などの時間依存性プロセスを研究する際に克服すべき障害です。

特に、CINは、正常細胞32と比較して染色体数および構造の変化の増加率として定義され、有糸分裂中の染色体分配のエラーから生じ、時間の経過とともに腫瘍内の不均一性33を引き起こす遺伝的変化につながる。したがって、CINは異数性核型を見つけることだけでは評価できません。細胞培養におけるCINの適切な研究と評価のためには、細胞を経時的にモニタリングすることが重要です。cCINに対するlncRNA KDの効果を研究するためには、KD効果を長期間持続させる方法論が必要です。この目的のために、このプロトコルではASOを使用し、ヒト細胞株HCT115およびPrECでlncRNA-RFC4をそれぞれ18日間および21日間沈黙させることに成功しました。この転写産物は、長さ1.2 kbの未評価のlncRNAであり、そのゲノム位置は3番染色体上にあります(q27.3)。これは、異なる種類のヒト癌34,35,36においてCINに関連する遺伝子であるタンパク質コード遺伝子RFC4に隣接している。

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プロトコル

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注:このプロトコルは、実験室の安全手順の経験を持つ実験室の担当者のみが実施することを目的としています。危険物および機器の取り扱いを開始する前に、このプロトコルで使用されるすべての試薬および材料から安全データシートを適切に読むことが不可欠です。プロトコル全体に沿って、施設のラボ安全マニュアルに示されているすべての安全要件を読み、理解し、満たすことが不可欠です。すべての生物学的廃棄物および化学廃棄物の処分は、機関の廃棄物管理および処分マニュアルに従って行わなければなりません。注意深く、安全な実験室慣行に従って取り扱わないと、このプロトコルで使用される材料や機器は重傷を負う可能性があります。常に機関の安全実験室のマニュアルと安全手順に従ってください。

1. ASOの設計

  1. 以下で説明するように、ASOを手動で設計します。
    1. 標的転写産物の完全な配列を取得し、RNAfold WebServer、University of Vienna37 (Table of Materials)で分析し、Webサイトのデフォルトパラメーターを使用して最小自由エネルギー(MFE)二次構造を取得します。
    2. 結果の準備ができたら、MFEプレーン構造図に移動し、[ Fornaで表示 ]をクリックしてWebサイト上のMFE二次構造を開くと、ソフトウェアは分析された転写産物の予測された二次構造を表示します。
    3. 予測されたMFEの二次構造から、オリゴヌクレオチドを設計する際にGストリング(3つのグアニンが連続する配列)を避けて、RNAの長さが20 bpの領域を選択します。ASOに最適なターゲット領域を選択するには、内部塩基対の確率が低いと予測される領域を使用します(図1)。
    4. 選択した 20 bp の領域から、逆補体配列を作成します。逆補体系を手動で作成するか、逆補体系オンラインツール(材料表)を使用します。逆補体配列は、実験のために合成する必要があるASOになります。
    5. Nucleotide Blast NCBI (blastn) と UCSC Genome Browser on Human (GRCh38/hg38) を使用して ASO 配列を解析します。ASOがヒトゲノムの他の転写産物や他のゲノム領域と相同性を示さないようにしてください。
      注:ASOの合成と精製は、営利企業によって行われました(材料表)。
  2. 合成するオリゴヌクレオチドが以下の特性を持っていることを確認してください。
    1. PSがオリゴヌクレオチド38 の全配列に沿って結合していることを確認します(図2A)。ASOがキメラであり、5'末端と3'末端に隣接する5つのヌクレオチドと、2'-O-メチルで修飾された糖環があることを確認します(図2B)。
    2. 中央の10ヌクレオチドが、RNase H結合をサポートするための未修飾の糖環を持っていることを確認します(図2C)。
    3. 標準的な脱塩および逆相(RP)HPLC39を使用して精製を行うように会社に依頼してください。
    4. ASO配送を凍結乾燥形式でご注文ください。
  3. 凍結乾燥されたASOをカルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に最終濃度200μMまで溶解します。
  4. 濃縮ストックを20 μMの濃度に希釈してASOのワーキング溶液を調製し、DPBSを使用して希釈液を調製します。-20°Cで保存してください。
    注:この研究では、lncRNA-RFC4を標的とする2つのASOが設計されました。トランスフェクションと効率のためのASO濃度の最適化のために、Zongらによるプロトコール40 に従いました。Zongのプロトコルに従って設計され、実験的に最適化されたASO-lncRFC4とASO-lncRFC4-2の2つがこれにあたる。最適化後、lncRNA-RFC4を標的とする有効なASOの1つであるASO-lncRFC4を長期ノックダウンプロトコルに選択しました(補足図1)。ポジティブコントロールとして、以前に確認された効率的なASO標的lncRNA MALAT18 を使用しました:ASO-MALAT1。ネガティブコントロールでは、 大腸菌 lacZ遺伝子を標的としたASO-lacZ(NCBIアクセッション番号:FN297865)を設計しました。

2.細胞の調製

注:細胞株、溶液、材料、または細胞培養操作中に使用される製品を扱うたびに、細胞培養フード内で作業してください。細胞培養用の液体を操作する場合は、必ず滅菌済みの血清ピペットまたは滅菌済みのチップ付きマイクロピペットを使用してください。プロトコル全体を通じて、機関の検査室安全マニュアルに示されているすべての安全要件を常に満たし、それに従ってください。

  1. 以下に説明するように、各細胞株の完全な細胞培養培地を調製します。
    1. HCT116については、10%のウシ胎児血清(FBS)を含むMcCoy's 5A培地を調製します。
    2. PrECの場合、前立腺上皮細胞増殖キットを使用して前立腺上皮細胞基底培地を調製します。
  2. KD実験には、100 mmの培養プレート(表面積55 cm2 )を3枚、使用するオリゴヌクレオチドごとに1枚ずつ使用します:lncRNAを標的とするASO、ポジティブコントロールとして使用するASO(ASO-MALAT1)、ネガティブコントロールとして使用するASO(ASO-lacZ)。
  3. 細胞継代間のKDのチェックポイントとして使用する2つの35 mm培養プレート(表面積9 cm2 )を使用し、そのうちの1つはASO-lncRFC4用の完全トランスフェクション培地でトランスフェクションし、もう1つはASO-lacZ用の完全トランスフェクション培地でトランスフェクションします。
    注:トランスフェクションは、脂質ベースのトランスフェクション試薬(材料の表を参照)の製造業者の手順およびプロトコルに従って計画されました41,42。
  4. 細胞培養皿中で細胞を1 x 104 細胞/cm2 の密度に播種します。インキュベーター内で5% CO2 を空気中で使用して、細胞が50%のコンフルエントに達するまで(表面の50%が細胞単分子膜で覆われている場合)インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。50%のコンフルエンスにより、このプロトコルのために細胞をトランスフェクションする準備ができています。
    注:ASO-lncRFC4およびASO-lacZのトランスフェクションには、100 mmディッシュ1枚と35 mmディッシュ1枚を播種しました。ASO-MALAT1のトランスフェクションでは、100 mmのディッシュのみを播種しました(図3A)。

3. トランスフェクション

  1. 手順を開始する前に、血清培地を37°Cに減らしてウォームアップします。
  2. ASO-lacZおよびASO-lncRFC4によるトランスフェクションには、以下の手順に従ってください。
    注:ASO-lacZおよびASO-lncRFC4によるトランスフェクションは、表面積55 cm2の細胞に対して計画されています。異なるエリアを使用する場合は、それに応じて音量を調整できます。この手順は、同じ条件で使用される各 ASO に対して実行する必要があります。
    1. 15 mLの円錐形遠心チューブで、43.75 μLのASO(20 μM)を1.4 mLの温かい還元血清培地に溶解して、細胞培養フード内にチューブ1を調製します。
    2. 1.5 mLのRNaseフリーマイクロフュージチューブで、18.66 μLの脂質ベースのトランスフェクション試薬と1.4 mLの温かい還元血清培地を混合して、細胞培養フード内にチューブ2を調製します。
    3. チューブ1および2を細胞培養フード内で室温で10分間インキュベートします。
    4. チューブ2に含まれる溶液(トランスフェクション試薬+還元血清)をチューブ1(ASO +還元血清)に直接、ゆっくりと、一滴ずつ加えて、チューブの表面に試薬が広がるのを防ぎます。
    5. チューブ1に含まれる混合物を、培養フード内で室温で20分間インキュベートします。
    6. 温かく還元された血清培地をチューブ1に加え、最終容量8.75mLにします。.
      注:最終的なトランスフェクション培地には、100 nM の濃度で ASO が含まれていました。
    7. トランスフェクションする細胞が入った細胞培養皿から培地を取り出し、トランスフェクション培地7.5 mLを100 mm培養プレートに、1 mLを35 mm培養プレートに直接、細胞単層に直接一滴ずつ加えます。皿を穏やかに振って、メディアが表面全体に均一に分布していることを確認します。
    8. インキュベーターで37°Cのインキュベーターで、空気中の5%CO2 を入れて6時間インキュベートします。
    9. トランスフェクション培地で6時間インキュベートした後、100 mm培養プレートの細胞に7.5 mLの完全培地を、35 mm培養プレートの細胞に1 mLの完全培地を添加します。37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。
  3. ASO-MALAT1によるトランスフェクションについては、以下の実験を実施してください。
    注:ASO-MALAT1によるトランスフェクションは、表面積55 cm2の細胞に対して計画されています。
    1. 15 mLのコニカル遠心チューブに、37.5 μLのASO(20 μM)を1.2 mLの温かい還元血清培地に溶解し、細胞培養フード内にチューブ1を調製します。
    2. 16 μL の脂質ベースのトランスフェクション試薬と 1.2 mL の温冷還元血清培地を混合して、チューブ 2 を調製します。
    3. チューブ1および2を細胞培養フード内で室温で10分間インキュベートします。
    4. チューブ2に含まれる溶液(脂質ベースのトランスフェクション試薬+還元血清)をチューブ1(ASO +還元血清)に直接、ゆっくりと、一滴ずつ加えて、チューブの表面に試薬が広がるのを防ぎます。
    5. チューブ1に含まれる混合物を、培養フード内で室温で20分間インキュベートします。
    6. 温かく還元された血清培地をチューブ1に加えて、最終容量7.5 mLにします。.最終的なトランスフェクション培地には、100 nM の濃度で ASO が含まれていました。
    7. トランスフェクションする細胞が入った細胞培養皿から培地を取り出し、7.5 mLのトランスフェクション培地を直接細胞単層に滴下して、皿を穏やかに振とうして培地が全表面に均一に分布するようにします。
    8. インキュベーター内で37°Cで、空気中の5% CO2 を使用して6時間インキュベートします。
    9. トランスフェクション培地と6時間インキュベートした後、7.5 mLの完全培地を細胞に加え、インキュベーター内で37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。
  4. 細胞が次のトランスフェクションラウンドの準備ができるまで、12〜24時間ごとに細胞を顕微鏡で評価します。
    注:次に、トランスフェクションは、細胞が70%のコンフルエントを達成したときに実行する必要があります。必要に応じて、培地を完全な培地と交換します。
  5. 細胞培養皿内で細胞が70%コンフルエントになったら、手順(ステップ3.1〜3.4)を繰り返し、次のトランスフェクションを行います。
    注:2回目のトランスフェクション後、細胞は12〜24時間ごとに顕微鏡で評価する必要があります。細胞の回収と継代は、細胞が80%〜85%のコンフルエントを達成したときに実行する必要があります。必要に応じて、培地を完全な培地と交換します。

4. 細胞の採取と継代

注:細胞の回収と継代は、トランスフェクションの2ラウンドごと、およびトランスフェクションの2回目、4回目、 および6回 目のラウンドの後に行われます。HCT116細胞の平均回収時間は、1回目、3回目、 5回 目のトランスフェクションから6日後、PrEC細胞の平均時間は、1回目、3回目、5回目の トランスフェクションから7日後でした。トランスフェクションのタイムポイントは、このプロトコルで使用される両方の細胞株で異なります。HCT116では、2回目、3回目、4回目、5回目、6回目の トランスフェクションは、それぞれ最初のトランスフェクションから3日後、6日後、9日後、12日後、6日後、6日後に実施されます。PrECの場合、2回目、3回目、4回目、5回目、6回目の トランスフェクションは、それぞれ最初のトランスフェクションの3日後、7日後、10日後、14日後、6日後に実施します。 図3 のタイムラインを参照して、トランスフェクション、継代、および回収の時点を確認してください。

  1. KD実験のための細胞回収と継代は、以下に説明するように100 mm培養プレートで行います。
    1. 細胞の採取に進み、細胞が80%〜85%のコンフルエントを達成したら継代します。
    2. 培地全体を温め、溶液を37°Cに洗浄します。 解離試薬を室温まで温めます。解離試薬の中和溶液を室温まで温めます。
      注:洗浄液、解離試薬、および中和溶液は、このプロトコルで使用される2つの細胞株で異なります。HCT116細胞をPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄し、トリプシン-EDTA溶液で解離します。解離試薬の中和は、HCT116細胞用の完全培地を用いて行います。PrECの場合、洗浄液としてHEPES緩衝生理食塩水が使用されます。トリプシン-EDTAは解離試薬として使用されます。解離試薬の中和には、トリプシン中和液を使用してください。
    3. 培養フード内で、細胞培養皿から培地を取り出し、3 mLの洗浄液で穏やかに洗浄した後、洗浄液を廃棄します。この手順を2回繰り返します。
    4. 細胞株に応じた解離試薬2 mLを細胞単層に添加し、37°Cで3〜5分間インキュベートします。解離が完了するまで、2分ごとに細胞を評価します。
    5. 細胞株に応じて2 mLの中和溶液を添加し、細胞培養皿から細胞懸濁液の全量を15 mLの円錐形遠心チューブに移します。
    6. RNA抽出には、細胞懸濁液500μLを取り出し、1.5mLの遠心チューブに移します。チューブを氷上に置いて、RNA抽出とRT-qPCRのステップ5.1に進みます。
    7. 残りの細胞懸濁液を120 x g で室温で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
    8. 細胞ペレットを2 mLの完全培養培地に再懸濁し、標準的な手順に従って細胞計数に進みます。
    9. 核型分析のために、直径35mm(表面積9cm2)の細胞培養皿(表面積9cm2)で細胞を1×104細胞/cm2の密度に播種し、インキュベーターで37°C、空気中5%CO2で24時間インキュベートし、標準的な手順に従って核型分析に進みます。
    10. 次の細胞継代でKD実験を続けるために、直径100mmの新規細胞培養皿に1×104 細胞/cm2 の密度で細胞を播種する。この料理は実験の2番の通路になります。インキュベーター内で5% CO2 をインキュベーター内でインキュベートし、細胞のコンフルエントが50%になるまでインキュベートします。
      注:必要に応じて、残りの細胞を標準的な手順に従ってタンパク質抽出および/または凍結に使用することができます。
    11. ステップ3.1から4.1.10を繰り返して、トランスフェクションとパッセージ2からの回収とパッセージ3からの回収を行います。
  2. 35 mm培養皿でのKD実験のチェックポイントの細胞回収の次の手順に従ってください。
    注:KD実験の最初のチェックポイントの収穫は、2回目 と4回目の トランスフェクション手順の2日後に行われます。
    1. メディアと洗浄液全体を37°Cに温めます。 解離試薬を室温まで温めます。解離試薬の中和溶液を室温まで温めます。
    2. 培養フード内で、細胞培養皿から培地を取り出し、0.5mLの洗浄液でやさしく洗浄した後、洗浄液を廃棄します。この手順を2回繰り返します。
    3. 洗浄液を廃棄した後、細胞株に応じて解離試薬0.5 mLを添加し、37°Cで3〜5分間インキュベートします。解離が完了するまで、2分ごとに細胞を評価します。
    4. 細胞株に応じて0.5mLの中和液を加え、細胞培養皿から細胞懸濁液の全量を1.5mLの微量遠心チューブに移し、氷上に置きます。
    5. ステップ5.1に進み、RNA抽出とqPCRを行います。

5. RNA抽出とRT-PCR

  1. 細胞懸濁液を200 x g で4°Cで2分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞ペレットを600μLの冷PBS(4°C)で洗浄します。
  2. 細胞懸濁液を200 x g で4°Cで2分間遠心分離し、上清を捨てます。
    標準的な手順に従って、RNA抽出に細胞ペレットを使用してください。
  3. ラボで従う標準的な手順に従って、精製されたRNAのDNase処理に進みます。一時停止ポイントでは、精製したRNAを-80°Cで長期間保存します。
  4. 得られたすべてのRNAサンプルで、標準的なcDNA合成にRNAを使用します。一時停止ポイントで、cDNAを-20°Cで長期間保存します。
  5. 以下に説明する手順に従って、標準的なqPCRを実行します。
    1. qPCRでは、オリゴヌクレオチドは、目的のlncRNA、MALAT1、および内部コントロールとして恒常的に発現した遺伝子の転写産物を増幅します(表1)。このプロトコルでは、式 RPS28 が内部制御として使用されました。
    2. qPCR反応を行い、ASO-LacZサンプルのcDNAを使用して、内部コントロール、目的のlncRNA、およびMALAT1を増幅します。このサンプルは、他のサンプルの式を正規化するために使用されます。
    3. ASO-lncRNAサンプルのcDNAを使用して、内部制御RPS28および目的のlncRNAを増幅するためのqPCR反応を行います。
    4. ASO-MALAT1サンプルのcDNAを使用して、内部コントロールRPS28およびMALAT1を増幅するためのqPCR反応を行います。 表2に記載されている反応のセットアップとサーモサイクラーの条件に従ってください。
    5. 目的とする転写産物の発現を内部コントロールに対してΔΔCtで標準化することによりqPCRデータを解析し、次に、目的とする転写産物(lncRNAまたはMALAT1)の発現をASO-LacZサンプル中の同じ転写産物の発現に対して正規化して、転写産物の相対発現レベルを取得します。

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結果

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本プロトコルでは、ASOの使用をヒト細胞株PrECおよびHCT116における核lncRNAのKDに長期間適合させた。

確かに、 図4で観察されたように、KD実験はPrEC細胞株で21日間成功しました。この記述を確認するために、細胞継代の日々の発現を分析することに加えて(図4 A-C)、継代1と2の間、および継代2と3の間に確立されたチェックポイントを分析しました。合計5回(図4-D)。lncRNA-RFC4のKDの成功は、細胞が回収されるたびに観察され、lncRNA-RFC4の発現は、ASO-lncRFC4で処理した細胞では、対照のASO-lacZ細胞よりも有意に低かった。チェックポイント採取の時間は、細胞トランスフェクションを行わない長い期間の間に実施するように慎重に選択されました。このプロトコールで使用されたASOの化学的性質は、ヌク...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

前述のように、lncRNAは細胞内で重要な調節機能を持っています。したがって、これらの転写産物の調節不全が疾患に関与している可能性があります。癌は、lncRNAの調節不全を特徴とするそのような疾患の1つです43,44。この疾患では、lncRNAはがん遺伝子45または腫瘍抑制因子46として重要な制御役割を果たすことが知られている。それらのいくつかは癌の特徴の発達に関与しており、例えば、増殖47,48,49、臨床進行、転移48,50,51,52,53

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

モンティエル・マンリケス・ロヘリオは、メキシコ国立自治大学(UNAM)のPrograma de Doctorado en Ciencias Biomédicasの博士課程の学生であり、CONACyT CVU番号:581151でCONACyTフェローシップを受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15ml遠心分離管 - 15ml円錐管サーモフィッシャーサイエンティフィック339650
コーニング 100 mm TC処理培養皿コーニング 430167表面積:55 cm2
コーニング 35 mm TC処理カルチャーディッシュコーニング 430165表面積:9 cm2
DPBS、カルシウムなし、マグネシウムなしモフィッシャーサイエンティフィック14190144
シ胎児血清(FBS)ATCC30-2020
HCT 116細胞株ATCCCCL-247
HEPES、1M緩衝液サーモフィッシャーサイエンティフィック15630122
Integrated DNA Technologies NANAhttps://www.idtdna.com/
リポフェクタミン RNAiMAX 試薬サーモフィッシャーサイエンティフィック13778150
マッコイズ5A培地 ATCC30-2007
正常ヒト初代前立腺上皮細胞 (HPrEC)ATCCPCS-440-010
ヌクレオチドブラスト NCBI NANAhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM 還元血清培地サーモフィッシャーサイエンティフィック31985070
PBS (10X)、pH 7.4サーモフィッシャーサイエンティフィック
前立腺上皮細胞基礎培地ATCCPCS-440-030
前立腺上皮細胞増殖キットATCCPCS-440-040
逆補体オンラインツールNANAhttps://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServerNANAhttp://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNase-free Microfuge Tubes、1.5 mLThermo Fisher ScientificAM12400
TrypLE Express Enzyme (1X)、フェノールレッド不Thermo Fisher Scientific12604013トリプシン-EDTA溶液
トリプシン中和溶液ATCCPCS-999-004
初代細胞用トリプシン-EDTAATCCPCS-999-003
UCSC ゲノムブラウザ、ヒト (GRCh38/hg38)NAhttps://genome.ucsc.edu/
、サーウ使用

参考文献

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