このプロトコルでは、マイコバクテリウム・スメグマティス(Msm)の軸種培養からの天然マイコバクテリア細胞外小胞(mEV)の濃縮と、mCherry(赤色蛍光レポーター)含有組換えMsmEVsの設計と濃縮方法について詳しく説明します。最後に、結核菌のEsxAタンパク質を含むMsmEVを濃縮することで、新しいアプローチを検証します。
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サマリー
要約
マイコバクテリアを含むほとんどの細菌は、細胞外小胞(EV)を生成します。細菌EV(bEV)には、代謝物、脂質、タンパク質、核酸などの細胞成分のサブセットが含まれているため、いくつかのグループが、サブユニットワクチン候補としての防御力について、bEVのネイティブバージョンまたは組換えバージョンのいずれかを評価しています。ネイティブEVとは異なり、組換えEVは、目的の免疫原を1つ以上含むように分子操作されています。過去10年間、さまざまなグループが組換え型bEVを生成するための多様なアプローチを模索してきました。しかし、ここでは、マイコバクテリアにおける組換えマイコバクテリアEV(mEV)の設計、構築、および濃縮について報告します。そのために、菌性土壌マイコバクテリウムである マイコバクテリウム・スメグマティス (Msm)をモデルシステムとして用いています。まず、MsmのネイティブEVの生成とエンリッチメントについて説明します。次に、赤色蛍光レポータータンパク質であるmCherry、または 結核菌の代表的な免疫原であるEsxA(Esat-6)のいずれかを含む組換えmEVの設計と構築について説明します。これは、mCherryとEsxAのN末端を、小さなMsmタンパク質Cfp-29のC末端と別々に融合させることで実現しています。 Cfp-29は、MsmEVに豊富に存在する数少ないタンパク質の1つです。Msm から組換え mEV を生成して濃縮するプロトコルは、Msm のネイティブ EV の生成と濃縮と同じままです。
概要
感染症に対する幅広いワクチンが開発・投与されているにもかかわらず、今日でも全死亡の~30%が伝染病によるものです1。結核(TB)ワクチンであるカルメット・ゲラン菌(BCG)が登場する前は、結核が死因の第1位でした(人口10万人あたり10,000~15,000人)2。BCGの投与と第一選択薬と第二選択薬の入手の容易さにより、2022年までに結核関連の死亡は劇的に減少し、2022年までに年間~100万人(すなわち、人口10万人あたり~15-20人)になりました1。しかし、世界の結核流行集団では、結核関連の死亡者数は人口10万人あたり100~550人にとどまっています1。専門家は、これらの数値の歪みにつながるいくつかの理由を認識していますが、BCGを介した保護が生後10年間も持続しないことが、3,4,5,6,7の顕著な理由のようです。その結果、国連の「持続可能な開発目標」とWHOの「結核撲滅戦略」が新たに採択されたことから、B....
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プロトコル
1. マイコバクテリウム・スメグマティス、 大腸菌およびその誘導体の生育条件
- メディア
- ミドルブルック7H9液体スープ
- ガラスビーカー内の必要量の二重蒸留水(ddw)を電子レンジで~45-50 °Cに予熱して20%Tween-80ストック溶液を調製し、適切なメスシリンダーを使用して必要量のTween-80を加え、小型のマグネチックスターラーで連続的に攪拌して20%Tween-80を均一な溶液にします。20% Tween-80 を 0.22 um 廃棄フィルターでろ過し、淡黄色の原液を 4 °C で保存します。
注:正確な最終濃度を得るには、メスシリンダー内のTween-80のすべての痕跡をビーカーに移す必要があります。準備したTween-80ストックをオートクレーブにかけないでください。フィルター(0.22μMを使用)を滅菌し、4 °Cで保存します。 - 7H9ブロスの調製については、製造元の指示に従ってください。4.7gの7H9粉末を900mLの重水素減少水に懸濁する。2 mLのグリセロールを加え、内容物を混合し、121 °C、15psiで20分間オートクレーブします。
注:オートクレーブする前に、Middlebrook AD....
- ガラスビーカー内の必要量の二重蒸留水(ddw)を電子レンジで~45-50 °Cに予熱して20%Tween-80ストック溶液を調製し、適切なメスシリンダーを使用して必要量のTween-80を加え、小型のマグネチックスターラーで連続的に攪拌して20%Tween-80を均一な溶液にします。20% Tween-80 を 0.22 um 廃棄フィルターでろ過し、淡黄色の原液を 4 °C で保存します。
- ミドルブルック7H9液体スープ
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結果
我々は、 M. smegmatis (Msm) をモデルマイコバクテリウムとして使用し、天然および組換え mEV (R-mEV) の両方の濃縮を実証しました。この模式的にまとめたmEVエンリッチメントプロトコル(図1)は、MsmのR-mEVとMtbのネイティブEVのエンリッチメントにも有効です(プロトコルノート1.2のように若干の変更が加えられています)。濃縮されたmEVを可視化するには、透過型電子顕微鏡36 でネガティブ染色する必要があります(図2A)。典型的には、Msm特異的EVは、13 mLの6〜60%密度勾配の4〜6分の 1 mLのフラクションで分離します(図2B)。約80〜100μgのEV相当のタンパク質が、Msmの2Lの中央対数軸培養物から日常的に得られます。それらの直径は通常、20 nmから250 nmの範囲です(
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ディスカッション
BCGよりも優れており、BCGに取って代わることができる新しい結核ワクチンの開発は依然として手ごわい課題であるため、代替案として、いくつかのグループは、BCGの効力を高め、その保護期間を延長できるさまざまなサブユニット結核ワクチンの発見を追求しています48,49。潜在的なサブユニットとして、また天然アジュバントとしての細菌EV(bEV)への注目が高まっていることを考えると50,51、下流の試験/分析に十分な量のmEVを一貫して濃縮することが重要なステップになっています。これらの研究課題を考慮して、このプロトコルは、アキセニック培養物とその組換えバージョンからのmEVを濃縮することを目的としています。
Msm EVの詳細な質量分析プロテオーム解析中に、Prados-Rosalesらは、最も存在量の多い10のタンパク質を同定した
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開示事項
すべての著者は、この研究作業が、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係/利益がない状態で実施されたことを宣言します。
謝辞
著者らは、 M. smegmatis mc2155 株を親切に共有してくださった Sarah M. Fortune 教授に心から感謝します。また、Servier Medical Art (smart.servier.com) が 図 1 にいくつかの基本要素を提供してくれたことも評価されています。彼らは、mEV濃縮のためのインキュベーターシェーカー、遠心分離機、超遠心分離機の長期使用中に忍耐強く調整してくれた他のラボメンバーのサポートに心から感謝しています。また、研究室助手のSurjeet Yadav氏には、必要なガラス器具や消耗品が常に手元にあることを常に確認していたことに感謝しています。最後に、THSTIの管理、購買、財務の各チームには、プロジェクトのシームレスな実行を継続的にサポートし、支援していただいたことに感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| A2タイプ バイオセーフティキャビネット | サーモフィッシャーサイエンティフィック社(米国 | 1300シリーズ | |
| ベンチトップ遠心分離機 | エッペンドルフ社(米国 | ) 5810 R | |
| BstB1, HindIII, HpaI | NEB, 米国 | NEB | |
| 細胞密度計 | GEヘルスケア社(米国 | Ultraspec 10 | |
| クエン酸 | Sigma-Aldrich社(米国 | ) Sigma Aldrich | |
| 二塩基性リン酸カリウム | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Double Distilled Water | Merck, USA | ~18.2 MW/cm @ 25 oC | |
| エレクトロポレーションキュベット | Bio-Rad, USA | 2 mm | |
| Electroporator | Bio-Rad, USA | Electroporator | |
| EsxA-specific Ab | Abcam, UK | Rabbitポリクローナル | |
| クエン酸第二鉄アンモニウム | Sigma-Aldrich(米国 | Sigma Aldrich | |
| フロアモデル遠心分離機 | サーモフィッシャーサイエンティフィック(米国 | Sorvall RC6 plus | |
| Glassware | ボロシル(インド | 1 L 三角フラスコ | |
| グリセロール | Sigma-Aldrich(米国 | Sigma Aldrich | |
| HEPESおよび塩化ナトリウム | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| インキュベーターシェーカー | Thermo Fisher Scientific, USA | MaxQ 6000 & 8000 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Luria Bertani Broth and Agar, Miller | Hi Media, INDIA | Hi Media Mgly | |
| Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | SigmaAldrich | |
| マグネティックスターラー | ターソンズ、インド | ソンズ | |
| mCherry特有Ab | アブカム、英国 | ウサギモノクローナル | |
| マイクロ波 | LG、インド | MC3286BLT | |
| ミドルブルック7H9ブロス | BD、米国 | ディフコミドルブルック7H9ブロス | |
| ドルブルックADC濃縮 | BD、米国 | BBLミドルブルックADC濃縮 | |
| Nanodrop | サーモフィッシャーサイエンティフィック社(米国 | Spectronic 200 UV-Vis | |
| NEB5a | NEB(米国 | ) DH5a | |
| Optiprep(ヨウ素酸) | メルク社(米国 | 60%原液(水中) | |
| PCR精製キット | Hi Media, インド | Hi Media | |
| pHメーター | メトラー・トレド(米国 | ) メトラー・トレド | |
| プラスミドDNAミニキット | Hi Media, インド | Hi Media | |
| Plateインキュベーター | サーモフィッシャーサイエンティフィック, アメリカ | 新シリーズ | |
| プラスミド pMV261 | Addgene, アメリカ * *The プラスミド は いいえ このプラスミドバンク | シャトルベクター | |
| DNAポリメラーゼの校正 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国 | Phusion DNAプラスポリメラーゼ | |
| Q5 DNAポリメラーゼの校正 | NEB、米国 | NEB | |
| 冷蔵循環水浴 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国 | R20 | |
| ミドルブロック 7H11 寒天ベース | BD、米国 | BBLSeven H11 Agar base | |
| SOC broth | Hi Media, INDIA | Hi Media Hi Media | |
| Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | ||
| T4 DNA Ligase | NEB, USA | NEB | |
| Tween-80 | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| 超遠心分離機 | Beckman Coulter, USA | Optima L100K | |
| 超遠心チューブ - 14 mL | ベックマン・コールター、米国 | ポリアロマータイプ – SW40Tiローターの超透明タイプ | |
| 超遠心チューブ - 38 mL | ベックマン・コールター、米国 | ポリプロピレンタイプ– SW28ローター用曇りタイプ | |
| 超音波洗浄ウォーターバスソニケーター | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国 | ソニケーター - ベンチトップモデル | |
| 0.22 & マイクロ;m ディスポーザブルフィルター | サーモフィッシャーサイエンティフィック社(米国 | ) Nunc-Nalgene | |
| 30-kDa セントリコン濃縮器 | (米国 | Amicon Ultra遠心フィルター - ミリポア | |
| 3X FLAG抗体 | シグマ・アルドリッチ社(米国 | Sigma Aldrich | |
| 400 mL 遠心分離ボトル | サーモフィッシャーサイエンティフィック社(米国 | Nunc-Nalgene | |
| 50 mL 遠心チューブ | コーニング、米国 | 滅菌済み、包装済み | |
| Bacteria | |||
| Strain | |||
| Escherichia coli | NEB、USA | NEB 5-α(DH5αの誘導体)。 | |
| cfp29::mCherryを発現するMSM | この研究 | MC2 155 | |
| Msm 表現 cfp29::esxA | この研究 | MC2 155 | |
| Msm 表現 cfp29::esxA::3X FLAG | この研究 | MC2 155 | |
| Mycobacterium smegmatis (Msm) | ハーバード大学サラ・M・フォーチュン教授、米国 | MC2 155 |
参考文献
- Global Tuberculosis Report 2022. , https://www.who.int/publications/m/item/global-tb-report (2022).
- Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
- Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and ....
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 2/01/2024. Citeable Link.
An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University
