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方法論記事

ナノディスクを含む生理活性物質の製剤化とキャラクタリゼーション

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DOI:

10.3791/65145

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2023年3月17日

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

この記事について

サマリー

ここでは、ナノディスクを含む生理活性剤の製造と特性評価について説明します。アムホテリシンBナノディスクは、プロトコルを段階的に記述するための例として取り上げられています。

要約

ナノディスクという用語は、二重層形成脂質、足場タンパク質、および統合された生理活性物質からなる離散型のナノ粒子を指す。ナノディスクは、円盤状の脂質二重層として編成され、その周囲は足場タンパク質、通常は交換可能なアポリポタンパク質ファミリーのメンバーによって外接される。多数の疎水性生物活性剤は、粒子の脂質二重層の疎水性環境への集積によってナノディスクに効率的に可溶化され、直径10〜20nmの範囲の粒子のほぼ均質な集団をもたらした。ナノディスクの製剤化は、個々の成分の正確な比率、各成分の適切な順次添加、続いて製剤混合物の浴超音波処理を必要とする。両親媒性足場タンパク質は、分散した二重層に自発的に接触して再編成し、脂質/生物活性物質混合物を形成して、離散的で均質なナノディスク粒子の集団を形成します。このプロセス中に、反応混合物は不透明で濁った外観から清澄化されたサンプルに移行し、完全に最適化されると、遠心分離時に沈殿物を生成しません。特性評価研究には、生物活性物質の可溶化効率、電子顕微鏡、ゲルろ過クロマトグラフィー、紫外可視(UV/Vis)吸光度分光法、および/または蛍光分光法の決定が含まれます。その後、通常、培養細胞やマウスを用いた生物活性の調査が行われます。抗生物質(すなわち、マクロライドポリエン系抗生物質アムホテリシンB)を保持するナノディスクの場合、濃度または時間の関数として酵母または真菌の増殖を阻害するそれらの能力を測定することができる。製剤化の相対的な容易さ、構成部品に対する汎用性、ナノスケールの粒子サイズ、固有の安定性、および水性溶解性により、ナノディスク技術の無数のin vitro および in vivo アプリケーションが可能になります。本稿では、疎水性生理活性剤としてアムホテリシンBを含むナノディスクを定式化し、特性評価するための一般的な方法論について説明します。

概要

新生円盤状高密度リポタンパク質(HDL)は、ヒト循環器系に存在するはるかに豊富な球状HDLの天然に存在する前駆細胞です。プレβHDLとも呼ばれるこれらの新生粒子は、独特で独特の構造特性を持っています1。実際、新生HDLは回転楕円体粒子として存在するのではなく、円盤状です。天然および再構成された円盤状HDLに関する広範な構造特性評価研究は、それらがアポA-Iなどの両親媒性交換可能なアポリポタンパク質(apo)によって周囲が外接するリン脂質二重層で構成されていることを明らかにしました。ヒトリポタンパク質代謝では、循環新生HDLは末梢細胞から脂質を生成し、ATP結合カセットトランスポーターA1やレシチン:コレステロールアシルトランスファーゼ2などの主要なタンパク質メディエーターに依存するプロセスで球状HDLに成熟します。このプロセスは、心臓病に対して保護的であると考えられているコレステロール逆輸送経路の重要な要素を表しています。この知識と円盤状HDLを再構成する能力を武器に、研究者はこれらの粒子をアテローム性動脈硬化症を治療するための治療的介入として採用しました3。本質的に、再構成されたHDL(rHDL)を患者に注入すると、プラーク沈着物からのコレステロール流出が促進され、胆汁酸への変換と体内からの排泄のために肝臓に戻されます。いくつかのバイオテクノロジー/製薬会社がこの治療戦略を追求しています4。

同時に、実験室でこれらの粒子を生成する能力は、新しいアプリケーションと新しい技術につながる研究活動の急増を引き起こしました。顕著な用途の1つは、天然様環境で膜貫通タンパク質を収容するためのミニチュアメンブレンとしてのrHDL粒子の使用です5。現在までに、何百ものタンパク質が円盤状rHDLにうまく取り込まれており、これらのタンパク質が受容体、酵素、トランスポーターなどとして天然の立体構造と生物学的活性の両方を保持していることが研究によって実証されています。「ナノディスク」と呼ばれるこれらの粒子は、多くの場合、高解像度で構造特性評価に適していることも示されています6。膜貫通タンパク質の研究に対するこのアプローチは、界面活性剤ミセルやリポソームを用いた研究よりも優れていると認識されており、その結果、急速に進歩しています。rHDLを形成することができる2つの異なる方法が報告されていることを認識することが重要です。「コール酸透析」法13 は、rHDL二重層5における膜貫通タンパク質の取り込みに関連する用途に普及している。本質的に、この製剤化方法は、界面活性剤コール酸ナトリウム(またはデオキシコール酸ナトリウム;ミセル分子量[MW]4,200Da)を含む緩衝液中で、リン脂質、足場タンパク質、および目的の膜貫通タンパク質を形成する二重層を混合することを含む。界面活性剤はさまざまな反応成分を効果的に可溶化し、界面活性剤が不足しているバッファーに対してサンプルを透析することができます。透析ステップでは、サンプルから界面活性剤が除去されると、rHDLが自発的に形成されます。このアプローチを使用して目的の膜貫通タンパク質をトラップする場合、生成物粒子はナノディスク5と呼ばれます。しかしながら、この方法を使用して低分子疎水性生物活性剤(MW <1,000 Da)を組み込む試みは、ほとんど成功していない。膜貫通タンパク質とは異なり、低分子生理活性物質は界面活性剤とともに透析バッグから逃げることができるため、rHDLへの取り込み効率が大幅に低下します。この問題は、配合混合物14から洗剤を省略することによって解決された。代わりに、成分は水性緩衝液に順次添加され、二重層形成脂質から始まり、ナノディスクと呼ばれるrHDLを含む安定な生理活性物質を形成する。その他は、 インビボ イメージング剤7の取り込みおよび輸送のためにrHDLを使用している。最近では、アポリポタンパク質足場とアニオン性グリセロリン脂質であるカルジオリピンからなる特殊なrHDLがリガンド結合研究に採用されています。これらの粒子は、カルジオリピンとカルシウム、シトクロムc、および抗癌剤ドキソルビシン8を含む様々な水溶性リガンドとの相互作用の研究のためのプラットフォームを提供する。

本研究の焦点は、安定に組み込まれた疎水性生理活性物質(すなわちナノディスク)を有するrHDLの製剤化にある。これらの薬剤が円盤状rHDL粒子の脂質環境に統合する能力は、それらに水溶性を効果的に付与します。このように、ナノディスクは in vivo 治療用途の可能性を秘めています。ナノディスクを製剤化する場合、個別の疎水性生物活性物質を生成物粒子にうまく取り込むためには、特定のインキュベーション/反応条件が必要であり、このレポートの目的は、特定のアプリケーションのための新規ナノディスク粒子を作成するための基礎テンプレートとして使用できる詳細な実用的な情報を提供することです。したがって、この原稿の文脈では、ナノディスクとナノディスクという用語は交換可能ではありません。ナノディスクは、その脂質二重層5に埋め込まれた膜貫通タンパク質を含むように処方されたrHDLを指すのに対し、ナノディスクという用語は、アムホテリシンB14などの低分子量(<1,000Da)疎水性生物活性剤を組み込むように処方されたrHDLを指す。

適切な足場タンパク質の獲得には、さまざまな方法が利用可能です。足場タンパク質をメーカー(apoA-I(SRP4693)やapoE4(A3234)など)から購入することは可能ですが、コストが制限要因となる場合があります。好ましいアプローチは、組換え足場タンパク質を大腸菌で発現させることである。ヒトapoA-I9、apoE410、ならびに昆虫血リンパタンパク質アポリポフォリン-III11についてのプロトコルが公開されている。本明細書に記載の実験の目的のために、組換えヒトapoE4N末端(NT)ドメイン(アミノ酸1〜183)を使用した。ヒトapoE4-NTをコードする塩基配列を合成し、ベクターコードされたpelBリーダー配列に直接隣接するpET-22b(+)発現ベクターに挿入した。この構築物は、pelBリーダー配列-apoE4-NT融合タンパク質の発現をもたらす。タンパク質合成に続いて、細菌のpelBリーダー配列は、新しく合成されたタンパク質をペリプラズム空間に誘導し、そこでリーダーペプチダーゼがpelB配列を切断します。得られたapoE4-NTタンパク質は、配列タグや尾部を持たず、その後細菌を逃がして培養培地11,12に蓄積し、下流の処理を簡素化します。

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プロトコル

1. 足場タンパク質成分の変換・発現・精製

  1. apoE4-NT含有プラスミドによるBL21細菌形質転換
    1. BL21(DE3)コンピテントセルのチューブを氷上で10分間解凍します。
    2. すべての氷が溶けたら、50 μLの細胞を氷上の形質転換チューブに穏やかに注意深くピペットで混ぜます。
    3. 50 ngのプラスミドDNA(配列については、 補足表1を参照)を含む5 μLを細胞混合物に加えます。チューブを慎重に4〜5回フリックして混ぜます。ボルテックスしないでください。
    4. 混合物を氷上に30分間置きます。
    5. 混合物を正確に42°Cで10秒間ヒートショックします。
    6. 氷の上に5分間置きます。
    7. 950 μLのS.O.C.培地を室温でチューブにピペットで入れます。
    8. チューブを37°Cの振とうインキュベーターに60分間入れ、発振を250rpmに設定します。
    9. フリックと反転によって細胞を完全に混合し、100 μLの細胞溶液を0.1 mg/mLの濃度でアンピシリンで処理した20 mLのルリアブロス+寒天選択プレートに広げます。
    10. 37°Cで一晩、または目に見えるコロニーが成長するまでインキュベートします。
  2. 電子ピペッターを使用して、25 mLの滅菌NZCYM培地を室温で滅菌250 mLコニカルフラスコに移し、アンピシリンを最終使用濃度0.1 mg/mLまで加えます。
  3. 滅菌接種ループを使用して、適切に形質転換された細菌株を含む選択プレートから1つの個々のコロニーを移し、25 mLのNZCYM培地+アンピシリンを含むフラスコに直接加えます。
  4. 25 mLのNZCYM種培養フラスコを、軌道振動を250 rpmに設定した37°Cの振とうインキュベーターに入れます。
    注:この種培養物を一晩増殖させて、波長= 600 nmに設定された分光光度計を使用して測定した適切な細菌濃度(~1.5-2.0光学濃度単位)に達することをお勧めします。
  5. 250 mLの滅菌NZCYM培地を4つの1 Lバッフルフラスコに移し、アンピシリン抗生物質を0.1 mg / mLの作業濃度まで加えます。
  6. 無菌条件下で、5 mLの飽和種培養物を4つの250 mL培養物を含むフラスコのそれぞれに移し、軌道振動を250 rpmに設定した37°Cの振とうインキュベーターに入れます。
    注:この時点で、培養は拡大培養と呼ばれ、指数関数的成長はUV1800分光光度計を使用して監視されます。600nmにおける培養光学密度(OD600)が0.6〜0.8の間の値に達するまで増殖を進行させる。
  7. 拡張培養が所望のOD600 値0.6〜0.8に達したら、59.6 mgのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を各250 ml培養フラスコに最終濃度1 mMで添加し、タンパク質発現を誘導します。この時点で、拡大培養は発現培養と呼ばれる。5時間の間発現を開始する。
  8. 5時間の発現期間の終わりに、振とうインキュベーターから4つのフラスコを取り出し、125 mLを6本の250 ml遠心ボトル(合計750 mL)にピペットで入れます。
  9. 各遠心分離機ボトルのバランスを取り、総質量が互いに±0.5mg以内になるようにします。
    注意: この手順は、遠心分離機の安全な操作を確保するために不可欠です。
  10. 最初に電源スイッチをオンの位置に切り替えて、遠心分離機を準備します。「設定/実績」というラベルの付いたボタンをクリックし、対応するダイヤルを使用してパラメータを「JA-14」、「9,400 x g」、20.00分、および4°Cに調整します。
  11. 6つのバランスのとれた遠心分離機ボトルを適切なサイズの遠心分離機ローターに入れ、遠心分離機に入れて、特定の安全パラメータが守られていることを確認します。
    注:すべての細菌細胞培養物が遠心分離され、上清が収集されるまで、この手順を続けます。
  12. 分離された細菌上清を真空ろ過または0.45ミクロンフィルターを備えた同等の装置でろ過し、残留破片を除去します。
  13. 組換えapoE4-NT足場タンパク質のヘパリン精製
    注:カラム精製手順は室温で行われます。
    1. 10 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 7.2) を 10 mM カラム容量 (50 mL) 塗布し、5 mL/min の速度で溶出することにより、Hi-trap Heparin カラムを平衡化します。
    2. apoE4-NT濃縮培地を、1 L容量の培地全体が塗布されるまで2.5 mL/minの速度でカラムに塗布し、フロースルーを廃棄します。
    3. 10 mM リン酸ナトリウムバッファー、pH 7.2 の 10 カラム容量 (50 mL) でカラムを洗浄し、フロースルーを廃棄します。
    4. 3カラム容量(15 mL)の溶出バッファー(10 mMリン酸ナトリウムバッファー+ 1.5 M NaCl、pH 7.2)をカラムに塗布して目的のapoE4-NTタンパク質を溶出し、溶出液を回収します。
  14. アポE4-NT溶出液の透析
    1. 蒸留脱イオン(ddi)水に10分間十分に浸漬し、透析チューブ(使用した透析チューブの寸法は長さ22cm、内径12mm、10,000MWCO)を片付けます。
    2. 1 Lのプラスチックビーカーまたは同等のものに1 Lのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(10 mMリン酸ナトリウム+ 150 mM NaCl、pH 7.2)を準備します。
    3. 透析チューブクランプを使用して、浸した透析チューブの一端をクランプし、クランプが固定され、液体が漏れないようにします。
    4. 細いネック漏斗を透析チューブの開放端に挿入し、15 mLのapoE4-NT溶出液を透析チューブに注ぎます。
      注意: このステップで漏れをチェックすることが不可欠です。
    5. 漏斗を取り外し、クランプします 透析チューブの端を別の透析チューブクランプで。
    6. 透析チューブの密閉された端の1つにフォーム透析フロートを置き、組み立てた透析チューブを1 LのPBSバッファーを含むビーカーに配置します。
    7. ビーカーの下部に磁気攪拌子を置き、攪拌制御を「低」に調整して、渦が形成されないようにします。
    8. 透析が終了したら、リテンテートを50 mLのコニカルチューブにデカントし、-20°Cで保存します。
      注:この透析は4°Cで一晩行うことをお勧めします。

2. ナノディスク含有生理活性物質の製剤化

  1. リン脂質アリコートの調製
    1. 5 mgの適切なリン脂質(例:.、ジミリストイルホスファチジルコリン[DMPC])を計量し、ガラス試験管に移します。
    2. 300 μLのCHCl 3と100 μLのCH 3 OHを加えて、合計3:1 v / vの比率で5 mgのリン脂質を溶解します。
    3. ガラス試験管をN2 ガスの穏やかな流れの下に10〜15分間置き、乾燥したリン脂質の薄膜が管の底部の壁に沿って形成されるようにして有機溶媒を蒸発させる。
  2. リン脂質アリコートの凍結乾燥
    1. ガラス試験管の開口部をパラフィルムで覆うことによって、凍結乾燥用のリン脂質アリコートを調製する。
    2. 24 Gの針を使用してパラフィルムに約10〜15回穴を開けます。
    3. 穴あきアリコートを適切な凍結乾燥容器に入れ、ゴム製の蓋が正しく密閉されていることを確認します。
    4. 凍結乾燥容器を凍結乾燥機の上部にある真空マニホールドに取り付け、他のすべてのバルブがしっかりと閉じていることを確認します。
    5. 電源スイッチを切り替えて真空初期化ボタンを押して、凍結乾燥機の電源を入れます。
    6. システムが全真空に達したら、冷凍初期化ボタンをクリックして凍結乾燥プロセスを開始します。
      注:サンプルを一晩凍結乾燥することをお勧めします。
  3. アムホテリシンB(amp-B)ナノディスクの製剤化
    1. 0.45 mLのPBSを凍結乾燥リン脂質アリコートにピペットし、ボルテックスで~30秒間、脂質を分散させます。
      注:結果のサンプルは不透明で濁って見えます。
    2. 20 mg/mLストックampB溶液(20 mgのampBを1 mLのジメチルスルホキシド[DMSO]に溶解し、密閉された琥珀色の容器に-20°Cで保存)をピペットで分散したリン脂質サンプルとボルテックスに入れます。
      注:疎水性生物活性剤のストック溶液を調製する際に使用する溶媒を選択する場合、2つの包括的な考慮事項は、1)生物活性物質の溶解度、および2)溶媒と製剤に使用される水性緩衝液との混和性です。DMSOはしばしば使用されるが15、16、17、18、19、ジメチルホルムアミド20、21またはテトラヒドロフラン22も首尾よく採用されている23。
    3. 0.5 mLのapoE4-NT足場タンパク質(濃度~4 mg/mL)を、分散したリン脂質とampBを含むガラス試験管にピペットで入れます。サンプルの最終容量は約1mLです。
    4. 溶液が透明になるまで(一般的に10〜15分)24°Cでサンプルを超音波処理します。
  4. ナノディスク遠心分離
    1. 清澄化したampBナノディスク溶液を滅菌済みの1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。
    2. 真向かいに配置されたバランスチューブを追加して、チューブを卓上マイクロ遠心ローターに配置します。
    3. ローターキャップを締め、遠心分離機の蓋を閉じます。
    4. マイクロ遠心分離機の前面にある対応するダイヤルを使用して、~11,000 x g で10分間回転するように遠心分離機をプログラムします。
      注:この時点で、ペレットが見える場合があります。このペレットは、組み込まれていないリン脂質および/またはampBで構成されています。
    5. 上清を取り除き、別の清潔な1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。
  5. アンプBナノディスク試料の透析
    1. 透析チューブ(使用した透析チューブの寸法は長さ3cm、内径16mm、10,000MWCO)をDDI水に10分間十分に浸漬して準備します。
    2. 1 L PBS緩衝液(10 mM リン酸ナトリウム+ 150 mM NaCl、pH 7.2)を1 Lプラスチックビーカーまたは同等のものに調製します。
    3. 透析チューブクランプを使用して、浸した透析チューブの一端をクランプし、クランプが固定され、液体が漏れないようにします。
    4. 細いネック漏斗を透析チューブの開放端に挿入し、ampBナノディスクサンプルを透析チューブに移します。
    5. 漏斗を取り外し、クランプします 透析チューブの端を別の透析チューブクランプで。
    6. 透析チューブの密閉された端の1つにフォーム透析フロートを置き、組み立てた透析チューブを1 LのPBSバッファーを含むビーカーに配置します。
    7. ビーカーの下部に磁気攪拌子を置き、攪拌制御を「低」に調整して、渦が形成されないようにします。透析を4°Cで一晩継続させます。

3. アンプBナノディスク試料のスペクトル解析

  1. 分光光度計の初期化とそれに続く自動ブランク
    1. 電源スイッチを切り替えて分光測色計の電源を入れ、「PC制御」というラベルの付いたボタンを押して対応するサポートコンピューターに接続します。
    2. サポートコンピューターで、「UVProbe 2.61」というラベルの付いたソフトウェアを開き、左下隅にある[接続]というラベルの付いたボタンをクリックして分光光度計に接続します。
    3. UVProbeソフトウェア内の上部のツールバーにある [スペクトル ]というラベルの付いたボタンをクリックします。
    4. 上部のツールバーの[ 方法 ]というラベルの付いたボタンをクリックします。
    5. [測定]タブをクリックし、[波長範囲(nm)]の下にある[開始]テキストボックスに「500」と入力し、[終了]テキストボックスに「300」と入力します。
    6. [スキャン速度]というラベルの付いたタブの横にあるドロップダウンメニューをクリックし、[中]に設定します。
    7. 1 mlのDMSOを2つの石英キュベット(QS 1.000)に移して、サンプルブランクを準備します。
    8. 両方のキュベットを分光光度計のそれぞれのサンプルポートにロードし、[ オートブランク]をクリックして、左下隅の[ 開始 ]をクリックして300〜500 nmのスペクトルを記録します。
  2. ampBスタンダードの調製とスペクトル解析
    1. 前面サンプルポートからキュベットを取り外し、20 μLの1 mg/mL ampBストック溶液(合計20 μg)を加えて、20 μg/mL ampB標準物質を調製します。
    2. キュベットを分光光度計のサンプルポートに戻し、[ 開始 ]をクリックしてサンプルの吸光度を記録します。
    3. キュベットをサンプルポートから取り出し、液体の内容物を適切なラベルの付いた廃棄物容器にデカントします。
    4. キュベットを脱イオン水で3回洗浄した後、70%エタノールで3回洗浄して完全にすすぎます。
  3. 破壊されたアンプBナノディスクサンプルの調製とスペクトル分析
    1. 1 mg/mL の ampB-ナノディスクストック 20 μL を 1 mL の DMSO にピペッティングして、破壊された ampB-ナノディスクサンプル (ampB として 20 μg/mL を含む) を調製します。スペクトルを記録する前に、少なくとも1分間インキュベートします。
    2. キュベットを分光光度計の前面サンプルポートにロードし、[ 開始 ]をクリックしてサンプルの吸光度を記録します。
  4. PBSバッファーブランクの調製とスペクトル分析
    1. 1 mLのPBSバッファーを2つの石英キュベット(QS 1.000)に移して、PBSバッファーブランクを調製します。
    2. キュベットを分光光度計のそれぞれのサンプルポートにロードし、 オートブランクをクリックして、300〜500nmのスペクトルを記録します。
  5. 非破壊アンプBナノディスクサンプルの調製とスペクトル分析
    1. 前面のサンプルポートからキュベットを取り出し、20 μLの1 mg/mL ampBナノディスクサンプルをPBSバッファーに導入することにより、非破壊アンプBナノディスクサンプル(ampBとして20 μg/mLを含む)を調製します。
    2. キュベットを分光光度計のサンプルポートに戻し、[ 開始]をクリックして、サンプルスペクトルを記録します。
      注意: すべての化学廃棄物は、受け入れられたガイドラインに従って、適切にラベル付けされた廃棄物容器に廃棄する必要があります。

4.酵母生存率アッセイ分析

注:酵母生存率アッセイは、ampBの生物学的活性を評価し、製剤化またはナノディスクへの取り込みのプロセスが酵母増殖阻害活性に影響を与えるかどうかを判断するために実施されました。

  1. 前述の方法(2.3-2.4.1)に従って、DMPC5 mgあたり1 mgのampBとDMPC5 mgあたり0.1 mgのampBを含むように、2つのampBナノディスクサンプル(最終容量= 1 mL)を調製します。
    注:DMPC5 mgあたり1 mg/mLおよび0.1 mg/mLのアンプBを作成するには、DMSOストック中の20 mg/mLアンプBをそれぞれ50 μLおよび5 μLピペットで各サンプルバイアルに入れます。
  2. 飽和酵母培養物の調製
    1. 25 mLの滅菌酵母エキス-ペプトン-デキストロース(YPD)培地を滅菌50 mLコニカルチューブに移します。
    2. 滅菌接種ループを使用して、単一の サッカロミセス・セレビシエ (BY4741)コロニーを25 mLのYPD培地に移します。
    3. 30°Cに設定した振とうインキュベーターで酵母を培養し、振動を200rpmに設定して18時間培養します。
  3. 個々の成長阻害アッセイサンプルの調製
    1. 5 mLの滅菌YPD培地を30本の滅菌済み13 mL培養チューブに移します。
    2. 1 mg/mL ampBナノディスクサンプルを20、10、5 μL(それぞれ20、10、5 μgのampB)を加えて、3セットの培養チューブを処理します。
    3. 0.1 mg/mL ampBナノディスクサンプルを20、10、5 μl(それぞれ2、1、0.5 μgのampB)を加えて、3セットの培養チューブを処理します。
    4. 20 μLのPBS、DMSO、コントロールrHDL(アンプBなし)、または20 μgのアンプBをDMSO中を加えて、4セットの培養チューブを処理します。
      注:培養チューブの各セットは、独立した複製を表します。したがって、この方法に従うと、全体のn値はn = 3になります。
  4. 酵母生存率アッセイの初期化
    1. 各サンプルに100 μL(2% vol/vol)の飽和酵母培養液を接種して実験を開始します
    2. 30°Cに設定した振とうインキュベーターを使用して酵母を培養し、振動を200rpmに設定して最大18時間培養します。
  5. 酵母生存率測定
    1. 電源スイッチを切り替えて分光光度計の電源を入れ、[ Go To WL ]というラベルの付いたボタンをクリックして、値を600nmに設定します。
    2. 1 mLの滅菌YPD培地を2つのプラスチックキュベットに移し、分光光度計のそれぞれのサンプルポートにロードして、[ オートブランク]をクリックします。
    3. 各サンプル1 mLをプラスチックキュベットに移し、毎回キュベットを交換して、キュベットを分光光度計の前面サンプルポートにロードします。
    4. 各サンプルの光学密度を600 nmで測定して記録し、使用済みの各キュベットを適切にラベル付けされたバイオハザード廃棄物容器に廃棄します。

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結果

生理活性物質ナノディスク製剤化プロセス
説明したampB-nanodiskの製剤化手順では、サンプルの外観が濁った状態から透明な状態に移行すると、反応は完了したと見なされます(図1)。この変化は、ナノディスクが形成され、生理活性物質が可溶化されたことを示している。多くの場合、生物活性物質は可視波長領域の光(例えば、ampB、クルクミン、ルテイン、コエンザイムQ10)を吸収し、これらの場合、サンプルは生物活性物質の色を採用する。サンプルの清澄化が完了したら(通常、浴超音波処理の5〜20分)、サンプルを1.7mlのマイクロ遠心チューブに移し、11,000 x g で5分間遠心分離して、不溶性材料をペレット化します。目に見えるペレットがないことは、生理活性物質がナノディスクに取り込まれているという強力な証拠と見なすことができます。一方、ペレットの外観は、生理活性物質の取り込みが部分的またはまったく生じていないことを示す。必要または有用であれば、二重層形成脂質および足場タンパク質のみを含有する対照製剤を並行...

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ディスカッション

ナノディスクを含む生理活性剤の製剤化は、そうでなければ不溶性の疎水性化合物を可溶化するための便利な方法を提供する。生成物の生理活性物質ナノディスクは水性媒体に完全に溶解するため、広範囲の疎水性分子に対する有用な送達方法を提供します(表1)。これらには、小分子、天然および合成薬、植物栄養素、ホルモンなどが含まれます。製剤戦略は通常、有機溶媒への生理活性物質の溶解特性を考慮しなければならない標準的なプロトコルに従います。生理活性物質を溶解するための適切な有機溶媒を選択することに加えて、~20 mg/mlのストック溶液を達成することと、溶媒と水溶液との混和性の2つの追加パラメータが必要です。これは、過剰な有機溶媒を導入しずに製剤混合物にかなりの量の生理活性物質を添加することを可能にするので必要である。相分離は製品ナノディスクへの生理活性物質の取り込みを妨げるため、混和性は重要です。

二重層形成リン脂質分散液の直後に生理活性物質を選択した緩衝液に導入すると、足場タンパク質を添加する前にこれらの成分が互いに相互作用することが可能になります。足場タンパク質添加...

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開示事項

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謝辞

この研究は、国立衛生研究所(R37 HL-64159)からの助成金によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アムホテリシンBケイマンケミカルカンパニー11636ND製剤&標準調製
アンピシリンフィッシャー ScientificBP17925Transformation &拡張
ApoE4-NT プラスミドGenScriptN/A形質転換
バッフルフラスコニューブランズウィック サイエンティフィックN/A拡張 &発現
BL21 コンピテント 大腸菌ニューイングランド バイオラボC2527I形質転換
遠心分離機ボトルナルゲン3140-0250発現
クロロホルムフィッシャーサイエンティフィックG607-4ND 製剤
DMSOシグマ アルドリッチ472301標準調製
ジミリストイルホスファチジルコリンアバンティ脂質850345PND製剤
三角フラスコBellco BiotechnologyN / A拡張&エクスプレッ
ファルコンチューブSarstedt Ag &CoD51588酵母生存率アッセイ
ガラスホウケイ酸チューブVWR47729-570ND 製剤
GraphPad (ソフトウェア)ドットマティクスN/A酵母生存率アッセイ
加熱超音波処理槽VWRN/AND フォーミュラトン
加熱および窒素モジュールサーモサイエンティフィックTS-18822ND 製剤
HiTrapヘパリンHP (5 mL)GE Healthcare17-0407-03精製
用イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド フィッシャーサイエンティフィックBP1755
J-25遠心分離機ベックマンコールターJ325-IM-2
JA-14ローターベックマンコールター339247発現凍結
乾燥機Labconco7755030 ND製剤
ノールフィッシャーサイエンティフィックA452-4ND製剤
ガスPraxairUN1066ND製剤
NZCYMメディアRPI研究製品N7200-1000.0拡張&Expression
Pet-22B ベクターGenScriptN/ATransformation
Petri dishFisher ScientificFB0875718Transformation &拡張
石英キュベットフィッシャーブランド14385 928Aスペクトル分析
振とうインキュベータニューブランズウィック科学M1344-0004変換、拡張、&Expression
Slide-A-Lyzer BuoysThermo Scientific66430Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific68100Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific88243Purification
NadiumChloride Fisher ScientificS271Purification
リン酸二塩基性ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS374-500精製
リン酸ナトリウムモノ塩基性フィッシャーサイエンティフィックBP329-500
スペクトル/ POR加重クロージャースペクトル医療産業132736精製
分光光度計津UV-1800220-92961-01分析
卓上遠心分離機ベックマンコールター366816ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)ShimadzuN/ASpectral Analysis
Vacuum filterMillipore9004-70-0Expression &精製
真空ポンプGAST Manufacturing IncDOA-P704-AAExpression &精製
ボルテックフィッシャー サイエンティフィ12-812ND 製剤
酵母N/ABY4741酵母生存率アッセイ
酵母抽出物-ペプトン-デキストロースBD242820酵母生存率アッセイ
ション 発現発現メタ窒素ー精製島スペクトルス ック

参考文献

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