Method Article

ナノディスクを含む生理活性物質の製剤化とキャラクタリゼーション

DOI:

10.3791/65145

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March 17th, 2023

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

In This Article

Summary

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ここでは、ナノディスクを含む生理活性剤の製造と特性評価について説明します。アムホテリシンBナノディスクは、プロトコルを段階的に記述するための例として取り上げられています。

Abstract

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ナノディスクという用語は、二重層形成脂質、足場タンパク質、および統合された生理活性物質からなる離散型のナノ粒子を指す。ナノディスクは、円盤状の脂質二重層として編成され、その周囲は足場タンパク質、通常は交換可能なアポリポタンパク質ファミリーのメンバーによって外接される。多数の疎水性生物活性剤は、粒子の脂質二重層の疎水性環境への集積によってナノディスクに効率的に可溶化され、直径10〜20nmの範囲の粒子のほぼ均質な集団をもたらした。ナノディスクの製剤化は、個々の成分の正確な比率、各成分の適切な順次添加、続いて製剤混合物の浴超音波処理を必要とする。両親媒性足場タンパク質は、分散した二重層に自発的に接触して再編成し、脂質/生物活性物質混合物を形成して、離散的で均質なナノディスク粒子の集団を形成します。このプロセス中に、反応混合物は不透明で濁った外観から清澄化されたサンプルに移行し、完全に最適化されると、遠心分離時に沈殿物を生成しません。特性評価研究には、生物活性物質の可溶化効率、電子顕微鏡、ゲルろ過クロマトグラフィー、紫外可視(UV/Vis)吸光度分光法、および/または蛍光分光法の決定が含まれます。その後、通常、培養細胞やマウスを用いた生物活性の調査が行われます。抗生物質(すなわち、マクロライドポリエン系抗生物質アムホテリシンB)を保持するナノディスクの場合、濃度または時間の関数として酵母または真菌の増殖を阻害するそれらの能力を測定することができる。製剤化の相対的な容易さ、構成部品に対する汎用性、ナノスケールの粒子サイズ、固有の安定性、および水性溶解性により、ナノディスク技術の無数のin vitro および in vivo アプリケーションが可能になります。本稿では、疎水性生理活性剤としてアムホテリシンBを含むナノディスクを定式化し、特性評価するための一般的な方法論について説明します。

Introduction

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新生円盤状高密度リポタンパク質(HDL)は、ヒト循環器系に存在するはるかに豊富な球状HDLの天然に存在する前駆細胞です。プレβHDLとも呼ばれるこれらの新生粒子は、独特で独特の構造特性を持っています1。実際、新生HDLは回転楕円体粒子として存在するのではなく、円盤状です。天然および再構成された円盤状HDLに関する広範な構造特性評価研究は、それらがアポA-Iなどの両親媒性交換可能なアポリポタンパク質(apo)によって周囲が外接するリン脂質二重層で構成されていることを明らかにしました。ヒトリポタンパク質代謝では、循環新生HDLは末梢細胞から脂質を生成し、ATP結合カセットトランスポーターA1やレシチン:コレステロールアシルトランスファーゼ2などの主要なタンパク質メディエーターに依存するプロセスで球状HDLに成熟します。このプロセスは、心臓病に対して保護的であると考えられているコレステロール逆輸送経路の重要な要素を表しています。この知識と円盤状HDLを再構成する能力を武器に、研究者はこれらの粒子をアテローム性動脈硬化症を治療するための治療的介入として採用しました3。本質的に、再構成されたHDL(rHDL)を患者に注入すると、プラーク沈着物からのコレステロール流出が促進され、胆汁酸への変換と体内からの排泄のために肝臓に戻されます。いくつかのバイオテクノロジー/製薬会社がこの治療戦略を追求しています....

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Protocol

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1. 足場タンパク質成分の変換・発現・精製

  1. apoE4-NT含有プラスミドによるBL21細菌形質転換
    1. BL21(DE3)コンピテントセルのチューブを氷上で10分間解凍します。
    2. すべての氷が溶けたら、50 μLの細胞を氷上の形質転換チューブに穏やかに注意深くピペットで混ぜます。
    3. 50 ngのプラスミドDNA(配列については、 補足表1を参照)を含む5 μLを細胞混合物に加えます。チューブを慎重に4〜5回フリックして混ぜます。ボルテックスしないでください。
    4. 混合物を氷上に30分間置きます。
    5. 混合物を正確に42°Cで10秒間ヒートショックします。
    6. 氷の上に5分間置きます。
    7. 950 μLのS.O.C.培地を室温でチューブにピペットで入れます。
    8. チューブを37°Cの振とうインキュベーターに60分間入れ、発振を250rpmに設定します。
    9. フリックと反転によって細胞を完全に混合し、100 μLの細胞溶液を0.1 mg/mLの濃度でアンピシリンで処理した20 mLのルリアブロス+寒天選択プレートに広げます。
    10. 37°Cで一晩、または目に見えるコロニーが成長するまでインキュベートします。
  2. 電子ピペッターを使用して....

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Results

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生理活性物質ナノディスク製剤化プロセス
説明したampB-nanodiskの製剤化手順では、サンプルの外観が濁った状態から透明な状態に移行すると、反応は完了したと見なされます(図1)。この変化は、ナノディスクが形成され、生理活性物質が可溶化されたことを示している。多くの場合、生物活性物質は可視波長領域の光(例えば、ampB、クルクミン、ルテイン、コエンザイムQ10)を吸収し、これらの場合、サンプルは生物活性物質の色を採用する。サンプルの清澄化が完了したら(通常、浴超音波処理の5〜20分)、サンプルを1.7mlのマイクロ遠心チューブに移し、11,000 x g で5分間遠心分離して、不溶性材料をペレット化します。目に見えるペレットがないことは、生理活性物質がナノディスクに取り込まれているという強力な証拠と見なすことができます。一方、ペレットの外観は、生理活性物質の取り込みが部分的またはまったく生じていないことを示す。必要または有用であれば、二重層形成脂質および足場タンパク質のみを含有する対照製剤を並行.......

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Discussion

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ナノディスクを含む生理活性剤の製剤化は、そうでなければ不溶性の疎水性化合物を可溶化するための便利な方法を提供する。生成物の生理活性物質ナノディスクは水性媒体に完全に溶解するため、広範囲の疎水性分子に対する有用な送達方法を提供します(表1)。これらには、小分子、天然および合成薬、植物栄養素、ホルモンなどが含まれます。製剤戦略は通常、有機溶媒への生理活性物質の溶解特性を考慮しなければならない標準的なプロトコルに従います。生理活性物質を溶解するための適切な有機溶媒を選択することに加えて、~20 mg/mlのストック溶液を達成することと、溶媒と水溶液との混和性の2つの追加パラメータが必要です。これは、過剰な有機溶媒を導入しずに製剤混合物にかなりの量の生理活性物質を添加することを可能にするので必要である。相分離は製品ナノディスクへの生理活性物質の取り込みを妨げるため、混和性は重要です。

二重層形成リン脂質分散液の直後に生理活性物質を選択した緩衝液に導入すると、足場タンパク質を添加する前にこれらの成分が互いに相互作用することが可能になります。足場タンパク質添加.......

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Disclosures

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著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgements

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この研究は、国立衛生研究所(R37 HL-64159)からの助成金によってサポートされました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
アムホテリシンBケイマンケミカルカンパニー11636ND製剤&標準調製
アンピシリンフィッシャー ScientificBP17925Transformation &拡張
ApoE4-NT プラスミドGenScriptN/A形質転換
バッフルフラスコニューブランズウィック サイエンティフィックN/A拡張 &発現
BL21 コンピテント 大腸菌ニューイングランド バイオラボC2527I形質転換
遠心分離機ボトルナルゲン3140-0250発現
クロロホルムフィッシャーサイエンティフィックG607-4ND 製剤
DMSOシグマ アルドリッチ472301標準調製
ジミリストイルホスファチジルコリンアバンティ脂質850345PND製剤
三角フラスコBellco BiotechnologyN / A拡張&エクスプレッ
ファルコンチューブSarstedt Ag &CoD51588酵母生存率アッセイ
ガラスホウケイ酸チューブVWR47729-570ND 製剤
GraphPad (ソフトウェア)ドットマティクスN/A酵母生存率アッセイ
加熱超音波処理槽VWRN/AND フォーミュラトン
加熱および窒素モジュールサーモサイエンティフィックTS-18822ND 製剤
HiTrapヘパリンHP (5 mL)GE Healthcare17-0407-03精製
用イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド フィッシャーサイエンティフィックBP1755
J-25遠心分離機ベックマンコールターJ325-IM-2
JA-14ローターベックマンコールター339247発現凍結
乾燥機Labconco7755030 ND製剤
ノールフィッシャーサイエンティフィックA452-4ND製剤
ガスPraxairUN1066ND製剤
NZCYMメディアRPI研究製品N7200-1000.0拡張&Expression
Pet-22B ベクターGenScriptN/ATransformation
Petri dishFisher ScientificFB0875718Transformation &拡張
石英キュベットフィッシャーブランド14385 928Aスペクトル分析
振とうインキュベータニューブランズウィック科学M1344-0004変換、拡張、&Expression
Slide-A-Lyzer BuoysThermo Scientific66430Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific68100Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific88243Purification
NadiumChloride Fisher ScientificS271Purification
リン酸二塩基性ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS374-500精製
リン酸ナトリウムモノ塩基性フィッシャーサイエンティフィックBP329-500
スペクトル/ POR加重クロージャースペクトル医療産業132736精製
分光光度計津UV-1800220-92961-01分析
卓上遠心分離機ベックマンコールター366816ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)ShimadzuN/ASpectral Analysis
Vacuum filterMillipore9004-70-0Expression &精製
真空ポンプGAST Manufacturing IncDOA-P704-AAExpression &精製
ボルテックフィッシャー サイエンティフィ12-812ND 製剤
酵母N/ABY4741酵母生存率アッセイ
酵母抽出物-ペプトン-デキストロースBD242820酵母生存率アッセイ
ション 発現発現メタ窒素ー精製島スペクトルス ック

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025(2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A.

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