狂犬病抗原を封入した拍動性高分子微粒子の作製

サマリー

この方法は、狂犬病抗原を、所定の遅延後に拍動放出を可能にする構造的および材料的特性を有する生分解性ポリマー微粒子に封入することを記載する。粒子コアから回収された抗原の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)評価では、粒子作製を通じて無傷の三量体狂犬病ウイルス糖タンパク質の存在が確認されます。

要約

狂犬病曝露後予防に関する現在のガイドラインでは、数週間にわたって複数回の注射を投与する必要があります。これは、狂犬病への致命的な曝露の大部分が発生する低中所得国(LMICs)に住む人々にとって不釣り合いな負担になる可能性があります。抗原をポリマー粒子に封入することにより、ワクチンレジメンを1回の注射に凝縮するために、さまざまな薬物送達戦略が検討されています。しかしながら、カプセル化プロセス中の過酷なストレッサーは、カプセル化された抗原の変性を引き起こし得る。この記事では、狂犬病ウイルス(RABV)抗原を、調整可能な拍動放出を示すポリマー微粒子にカプセル化する方法について説明します。この方法は、薬物をカプセル化するために均一に液化および密封された粒子(PULSED)と呼ばれ、ソフトリソグラフィーを使用して微粒子を生成し、多光子の3Dプリントされたマスターモールドから逆ポリジメチルシロキサン(PDMS)モールドを作成します。次に、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)フィルムをPDMS金型に圧縮成形し、圧電ディスペンシングロボットを使用して濃縮RABVを充填するオープンフェースシリンダーを生成します。次に、これらの微細構造は、粒子の上部を加熱することによって密封され、材料が流動して連続した非多孔質ポリマーバリアを形成することを可能にします。製造後、無傷の三量体狂犬病ウイルス糖タンパク質の検出に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して、微粒子からの免疫原性抗原の高い回収率を確認します。

概要

ワクチン接種は非常に効果的な医療ツールであり、2000年から2019年の間に3,700万人以上の死亡を予防^{しました1。}この有効性にもかかわらず、ワクチンで予防可能な病気は、特にワクチン接種未完了およびワクチン接種不足の割合が高いために年間150万人のワクチンで予防可能な死亡に寄与している低中所得国(LMICs)では、世界の健康に重大なリスクをもたらし続けています²。狂犬病もこれらの格差の例外ではありません。狂犬病は、人類に知られている最も致命的な病気としての地位にもかかわらず、ほぼ普遍的に致命的であり、完全に治療可能であり、多くの高所得国で根絶されたと分類されています。代わりに、狂犬病の負担は、病気が人間と家畜に壊滅的な結果をもたらすアジアとアフリカの一部に住む人々によって不釣り合いに負担されています^3,4。

予防接種は狂犬病の世界的な影響を管理するために重要です⁵.ワクチン接種の費用は、疾患の発生率が全体的に低いことを考慮すると、曝露前予防(PrEP)の広範な実施を禁止している。さらに、LMICsでは、曝露後予防(PEP)の有用性は、医療を求める患者に対する社会経済的圧力によって制限されています。医療アクセスポイントへの移動距離、治療中の賃金の損失、治療費、日常活動を妨げる予約、物忘れなどのロジスティック要因により、PEP遵守率は60%^と低くなります^6,7。この高い患者減少率は、狂犬病と闘うために狂犬病予防接種のギャップに対処するためのアプローチを改善する機会を提供します。

抗原の放出を制御する単回注射(SI)ワクチン接種システムは、1回の注射で完全免疫を得る方法として検討されています。医療提供者への複数回の訪問の必要性を排除することで、個人が適切なケアを求めることを妨げる負担が軽減されます。SIワクチン接種を達成するために、抗原は通常、注射可能な微粒子の形をとることが多い生分解性ポリマーマトリックス内にカプセル化されます。注入されると、ポリマーは分解し、隔離された抗原を放出します。現在までに、SIワクチン接種を達成するために2つの一次放出戦略が追求されてきた。1つのアプローチでは、抗原は長期間にわたって連続的に放出される。単回注射の免疫原性を高めることを意図しているが、このアプローチがヒトの狂犬病ウイルス(RABV)に対する防御免疫応答を誘発するのに十分であるかどうかは不明である⁸。他方では、抗原は、従来の実証済みのプライムブーストワクチンレジメンを模倣するために所定の遅延後に放出される。噴霧乾燥およびエマルジョン/溶媒蒸発ベースの微粒子作製法は前者の戦略を示し、モデルワクチン⁹と破傷風トキソイド¹⁰などの安定性の高い抗原の両方をうまくカプセル化するために使用されています。しかしながら、これらのカプセル化方法は、抗原¹¹を変性させる可能性のある熱、溶媒相互作用、および物理的力を含むストレッサーを伴う。

薬物をカプセル化するために均一に液化および密封された粒子(PULSED)は、生分解性微粒子に生物製剤をカプセル化するために採用できる最近開発された製造方法です。マイクロモールディングは、液体ペイロードで満たされ、ポリマーがリフローし、生分解性ポリマーの連続した層内に貨物の中央デポを完全にカプセル化できるように加熱される粒子を生成するために使用されます。この微細構造は、ポリマーシェル¹²の分解速度に依存する持続時間の後に、ペイロードの拍動放出をもたらす。この原稿は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって評価された安定したRABV抗原をカプセル化するためのPULSED製造法を使用して、多くのFDA承認製剤¹³で使用されている生分解性ポリマーであるポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)で構成される微粒子内に不活化RABVをカプセル化する方法を示しています。分子量および/または末端基の異なるPLGA粒子を組み合わせることにより、このアプローチは、1回の注射後の現在の狂犬病ワクチン接種の時間経過を模倣する可能性があります。

プロトコル

1. パーティクルマスターモールド生成

注意: 3D印刷プロセスは、十分な空間解像度を備えた任意の3Dプリンターで実行できます。ただし、現在のプロトコルは、多光子3Dプリンターのプロセスを記述しています。

1. コンピュータ支援設計(CAD)プログラムを使用して微粒子構造を設計します。
   注:設計仕様は次のとおりです:308個の粒子(直径= 400μm、高さ= 500μm、肉厚= 100μm)が22 x 14アレイに配置され、それらの間に600μmの間隔があります。計画には、配列のすぐ外側の基準として4つの尖った星と5つの尖った星も含まれています(補足図1)。
2. 最終デザインをSTLファイル(補足コーディングファイル1)としてエクスポートし、次に示すように印刷パラメータを定義できるソフトウェアにファイルをアップロードします。次に、3Dプリンターと互換性のあるファイルとして保存します( 材料表を参照)。
   注:スライス距離= 5 μm、ハッチング距離= 1 μm、シェル輪郭= 50 μm、ベーススライス数 = 5 μm、足場=中空、スキャンモード=ガルボ、Z軸=顕微鏡Zドライブ、スキャン速度= 100,000、電力= 100。
3. プラズマ洗浄プロセス(ガス:O₂、電力:200ワット、温度:25°C、流量:20、時間:5分)を使用してシリコン印刷基板(材料表を参照)を前処理し、ガラスシャーレ内のエタノール30 mLとメタクリル酸30 μlの3-(トリメトキシシリル)プロピルの溶液に基板を直ちに浸します。アルミホイルで覆い、一晩インキュベートさせます。
   注:このステップは、PDMS分離中に重要な基板への印刷接着力を高めます(ステップ2.6)。
4. 印刷ファイルを多光子3Dプリンターにアップロードし、処理された基板に印刷樹脂を塗布し、10倍レンズをロードし( 材料表を参照)、微細構造を印刷します。
5. 終了したら、プリントをプロピレングリコールメチルエーテルアセテート( 材料表を参照)に45分間浸して未露光のフォトレジストを除去し、次にプリントをイソプロピルアルコールに5分間沈めます。マスターモールドを254nmのUV光に120分間さらしてポストキュアします。
   注:可能な場合は、405〜365nmの範囲のUV光を~20分間使用して、印刷された構造を後硬化させることができます。

2. ポリジメチルシロキサン(PDMS)モールド生成

1. 3Dプリントされたマスターモールドの表面を、40μLのトリクロロ(1H,1H,2H,2H,-パーフルオロオクチル)シランを表面に添加したスライドガラスを含む真空チャンバーに入れて処理します( 材料の表を参照)。真空を引きます(相対圧力:-20インチ。Hg)を1時間。
   注意: この手順により、離型時に簡単に分離できます(手順2.6)。
2. マスターモールド表面が処理されている間に、ポリジメチルシロキサン(PDMS)プレポリマーベースとPDMSプレポリマー硬化剤を9:1の質量比で完全に混合します(マスターモールドごとに少なくとも10 gの材料が必要です)。完全に混合したら、未硬化のPDMSを50 mLの遠沈管に移し、300 x g で室温で3分間遠心分離します。
3. 表面処理が完了したら、マスターモールドをアルミホイル皿に入れ、未硬化のPDMSを金型の上に流し込み、フィーチャーが完全に水没していることを確認します。アルミホイル皿を真空チャンバーに入れ、真空を引きます(相対圧力:-20インチ。Hg)を1時間処理して気泡を除去した。
4. アルミホイル皿を真空チャンバーから取り出します。マスターモールドの端に800μmのスペーサーを配置し、気泡が発生しないように注意しながら、きれいなスライドガラスをマスターモールドに重ねます。バインダークリップを使用して金型とスライドを一緒にクランプし、スペーサー上のクランプ力を特定します(補足図2)。
5. 構造を120°Cに設定されたオーブンに少なくとも4時間置き、プレポリマーをPDMSモールドに硬化させます。
6. オーブンから構造を取り外し、バインダークリップを慎重に解放し、かみそりの刃を使用してマスターモールドを硬化PDMSモールドから慎重に分離します。
   注:3Dプリントされたマスターモールドは、追加のPDMSモールドを生成するために再利用できます。

3. PLGAフィルム製造

1. 450 mgのPLGAを量り( 材料表を参照)、内径50.8 mmの厚さ250 μmのリングシム内の76 mm x 76 mmの焦げ付き防止ポリマーシートに置きます。2枚目の焦げ付き防止ポリマーシートをPLGAの上に置き、101.6 mm cクランプを使用して2つのアルミニウムブロック間のスタックを指で締めるまで圧縮します。
   注:502H PLGAはこの研究でのみ使用されました。ただし、他のタイプのPLGAはこのプロセスと互換性があります。
2. cクランプアセンブリを、120°Cに設定された真空オーブンに、相対圧力-30インチHgの真空下で30分間置きます。次に、アセンブリを取り外し、clをしっかりと締めますamp さらに30分間真空オーブンに戻す前に。
   注意: 真空を使用する主な目的は、高温で加速されるPLGAの劣化を回避することです。
3. アセンブリをオーブンから取り出し、デシケーターで4時間冷却します。
4. 冷却したら、clを緩めますamps、焦げ付き防止ポリマーシートからPLGAフィルムをはがし、ラベル付きのペトリ皿にフィルムを置きます。後で使用するために、ペトリ皿をデシケーターの中に保管します。

4. PLGA粒子生成

1. 手順 2.1 で前述したように PDMS モールドの表面を処理します。
2. ピンセットやメスを用いて、250μmのPLGAフィルムの一部(アレイサイズ程度)を切り取り、処理したPDMSモールド上に載せます。
3. PLGAフィルムとPDMS金型の上にきれいなガラス顕微鏡スライドを重ね、アレイとPLGAフィルムの上にスプリングクランプを直接配置してコンポーネントを一緒にクランプします。
4. クランプされた金型アセンブリを120°Cに設定された真空オーブンに入れ、相対圧力-30インチで真空を引きます。1時間Hg。
   注:粒子の形成に必要な時間はPLGAによって異なり、1〜12時間の範囲で変化します。
5. clを取り出しますampオーブンからモールドアセンブリを取り出し、室温で約15分間、または触ると冷えるまで受動的に冷却します。
6. かみそりの刃を使用して、PDMSモールドとPLGA粒子アレイの間に静かに圧力を加えて、2つを分離します。PLGA粒子は、将来の使用のためにデシケーターに保管してください。

5. 抗原の濃縮と精製

1. 市販のRABV抗原( 材料表参照)のアリコート1個を室温で解凍する。
2. 分子量カットオフが100 kDaの遠心スピンフィルター(MWCO、 材料表を参照)を2本の収集チューブに入れて、ろ過セットアップを組み立てます。
3. 2つの遠心スピンフィルターを500 μLの超純水を加えてプレウェットします。
4. フィルターを2,400 x g で室温のベンチトップ遠心分離機で1分間回転させます。
5. 200 μLのピペットを使用して、ろ過セットアップの上部と下部の両方のコンパートメントから水を取り除きます。
   注意: プリウェットスピンフィルターを乾かさないでください。
6. 各スピンフィルターの上部コンパートメントに400 μLの蒸留水を加え、次に100 μLの解凍したRABV抗原を加えてピペットと混合します。
   注:この研究では、抗原を約5倍濃縮し、賦形剤の濃度<100 kDaを~50倍減少させました。
7. 2つの遠心スピンフィルターをベンチトップ遠心分離機にロードし、フィルターが遠心分離機の中心を向いていることを確認します。フィルターのどちら側が遠心分離機の中心に向かっているかをマークします。
   注意: 向きが正しくない場合、溶液は適切にろ過/濃縮されません。
8. フィルターを14,000 x g で室温で10分間遠心分離します。
9. 遠心分離機からフィルターを取り出します。収集チューブにはろ液が含まれ、フィルターには濃縮サンプルが含まれます(補足図3A)。
10. ピペットを使用して収集チューブ内の濾液を取り出し、廃棄します。
11. 各フィルターに450 μLのろ過蒸留水を加え、6回上下にピペッティングして濃縮サンプルと水を混合します。
12. 2つのスピンフィルターを14,000 x g で室温で10分間遠心分離します。フィルターが手順5.7と同じ向きで遠心分離機の中心を向いていることを確認します。
13. 遠心分離機からフィルターユニットを取り出し、前と同じように、ピペットを使用して各チューブからろ液を取り出して廃棄します。
14. 収集チューブからスピンフィルターを取り外し、収集チューブの上部を使用してフィルターケーシングにキャップをします(補足図3B)。
15. スピンフィルターケーシングの底部を渦に直接置き、フィルターケーシングを直立させ、45°の角度で3,000 rpmで35秒間渦巻きます(補足図3C)。
    注:このステップは、遠心分離プロセス中にペレットを形成したRABV抗原を再懸濁することを目的としています。
16. スピンフィルターケーシングから収集チューブのキャップを慎重に取り外します。フィルターケーシングを付属の収集チューブに戻し、すばやく回転(2〜3秒)して、キャップに閉じ込められた可能性のあるボリュームを収集します。
    注意: このクイックスピンは、ベンチトップマイクロ遠心分離機で実行する必要があります。フィルターは、以前の構成とは反対に遠心分離機に接して、フィルターを通して溶液が失われないようにする必要があります。
17. 各スピンフィルターユニットをスピンフィルターキットに付属の新しい収集チューブ( 材料表を参照)に反転させ、室温で1,000 x g で2分間遠心分離して、濃縮されたサンプルを収集します。
18. 2つの収集チューブからの濃縮サンプルを1つの収集チューブに統合します。結果の体積を測定して記録します。
    注:得られたサンプルは、ストックの初期抗原濃度の5倍、ストックの約50倍低い小さな賦形剤(<100 kDa)濃度を持ち、わずかに乳白色に見えます。総容量は約44〜48μLであるべきです。
19. 5倍濃縮し、2回洗浄した抗原を分注時まで4°Cで16時間以内保存します。この溶液を粒子に充填する前に、チューブを1,000 x g で1分間遠心分離して気泡を取り除きます。溶液は、蒸留水を使用して希釈して、ディスペンシングの公称目標濃度を達成することができます。

6.粒子充填

1. 真空フィルター 0.22 μmの真空フィルターに500 mLの脱イオン水を入れ、次に真空(相対圧力:-20インチ。Hg)を20分間超音波処理しながら。
2. この間、ピエゾディスペンスキャピラリー(PDC、 材料表を参照)を圧電ディスペンサーに取り付けます。
3. 製造元の指示に従って機械を下塗りし( 材料表を参照)、PLGA粒子の入ったスライドをディスペンスエリアに配置します。
4. 補足図4に従って、「ターゲット基準点の検索」を設定し、実行してから「ターゲット基板」を設定します。
5. 濃縮抗原25 μLをソースプレートにロードし、マシンにロードします。PDCを使用して、濃縮抗原10 μLを分注チップに吸引し、チップの外側を洗浄してから、分注アライメントを校正します(補足図5)。
6. 「ターゲット設定パラメータ」を入力し、[実行]をクリックします(補足図6)。
7. 完了したら、充填された粒子を取り除き、ステレオスコープで充填されていることを確認します。
8. プロトコルの次のステップに直接移動します。

7. 粒子のシーリングとハーベスティング

1. ステンレス鋼ブロック( 材料表を参照)をホットプレートに置きます。2枚の顕微鏡スライドをステンレス鋼ブロックの上に置き、平行になるようにします。ステンレス鋼ブロックが水平であることを確認してから、ホットプレートをオンにして、ステンレス鋼の表面温度が200°Cになるように温度を設定します。 密封する前に、ホットプレートの温度を確認してください。
2. 充填されたPLGA粒子を2つのスライドガラスの上に置いてホットプレートの上に吊り下げ、すぐにタイマーを18秒間開始します。
   注意: 粒子を密封するために必要な時間と熱の量は、粒子の製造に使用されるPLGAの化学的特性によって異なります。カスタム3Dプリントスライドホルダーを使用して、ホットプレートから安全な距離でスライドを取り扱うことができます。STLファイルは、 補足コーディングファイル2として提供されます。
3. 密閉したら、ホットプレートからパーティクルアレイを取り出し、パーティクルアレイを2つの別々のスライドガラスに配置してラボベンチに吊り下げます。粒子を1分間冷まします。
4. 冷却されると、ステレオスコープを覗きながらメスを使用して粒子を採取できます。スライドに対して45°の角度でブレードでメスを保持し、粒子のベースに圧力を加えてスライドガラスから分離します。
5. 採取したら、メスを使用して粒子を0.5 mLの低タンパク質結合チューブに移します( 材料表を参照)。次に、30 mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)と1 mg/mLグルコースを含む250 μLの1xリン酸緩衝液(PBS)をチューブに充填します。
   注:PBSで調製した30 mg/mL BSAおよび1 mg/mLグルコース溶液は、RABV抗原の安定性を維持します。
6. ピンセットを使用してステレオスコープの下で粒子を粉砕します。粒子のコアにあるRABV抗原が周囲の溶液に溶解できることを確認してください。ELISAを使用して抗原効力を評価できるようになるまで、サンプルを4°Cの冷蔵庫に保管します。サンプルは、調製から7日以内にELSIAで分析する必要があります。

8. ELISAによる抗原の評価

注意: マイクロプレートを乾燥させないでください。常にプレートを積み重ね、乾燥しないように常に上部プレートをプラスチックシール、空のプレート、または蓋で覆ってください。

1. 補足ファイル 1 の指示に従ってバッファーを準備します。
2. pH 9.4-9.6のコーティングバッファー4975 μLにコーティング抗体25 μLを添加し、2.5 μg/mLの濃度のコーティング溶液(炭酸水素塩緩衝液、pH 9.6)5 mLを調製します。
   注:96ウェルをそれぞれ50 μLでコーティングするには、5 mLが必要です(ピペッティング損失のために余分な容量があります)。必要なELISAプレートを追加するたびに、総容量を5 mLずつ増やします。
3. マルチチャンネルピペットを使用して、50 μLのコーティング溶液をマイクロプレートの各ウェルに分注します。溶液は、調製後すぐにコーティングに使用する必要があります。
4. 手袋をはめた手のひらのプレートの端に沿って軽くたたいて、各ウェルの底が液体で均等に覆われていることを確認します。
5. プレートを粘着フィルムで密封し、37°Cで1時間置いた後、4°Cに一晩移します。
6. プレートを冷蔵倉庫から取り出し、各ウェルで200 μLの洗浄バッファーで3回洗浄します。
7. 洗浄バッファーを取り外し、300 μLのブロッキングバッファーを各ウェルに分注します。
   注意: 同じサンプルを異なるプレートで繰り返して複数のプレートを実行する場合は、プレートごとに進めることが重要です(つまり、プレート1に材料を充填してからプレート2に進み、次にプレート3に進みます)。材料Xをすべてのプレートに適用してから材料Yなどを適用すると、ウェルが乾燥するリスクが高まるため、適用しないでください。最後の洗浄ステップの後、洗浄バッファーはプレートのウェルに残し、サンプルをプレートに追加する直前にのみ廃棄する必要があります。プラスチック製の96ウェルプレート蓋を使用して、すぐに分注されていないELISAプレートのすべてのウェルを覆う必要があり、蓋を順次動かして、材料で満たされる追加のウェルを明らかにします。
8. プレートを粘着プラスチックフィルム( 材料表を参照)で密封し、インキュベーターに37±2°Cで60±5分間置きます。
9. このインキュベーション中に評価する標準曲線とテストサンプルを準備します。
   注:評価対象の抗原は、ピペッティング損失を考慮して、0.125 IU/mLの推奨希釈で希釈バッファーで事前に希釈し、少なくとも40 μLの過剰容量で希釈する必要があります。すべてのサンプルは、各ELISAプレート上で重複して(2回のテクニカルレプリケート)評価されます。検量線の場合、各ELISAプレートのカラム2と3に合計8ポイントの2倍希釈系列を含める必要があります。希釈シリーズは、評価される抗原の予測量に基づいて適切なポイント数を有する他のすべてのサンプルに対して実行され得る。スループットを高めるための厳密さは劣りますが、上記のめっきの代替として、単一のサンプル希釈を使用できます。ただし、単一希釈の予想濃度は標準曲線範囲内に収まる必要があります。
10. 低結合タンパク質96ウェルプレート、または低結合タンパク質チューブ( 材料表参照)で、プレートのカラムに沿って各サンプルの2倍希釈シリーズを実行します。
11. 各サンプルのA列に希釈シリーズの開始を、必要な最終容量の2倍でロードします(プレートあたり、ウェルあたり100 μLのサンプルが必要であるため、A2-A11のすべてのウェルには少なくとも240 μLのサンプルが含まれ、ピペッティング損失を考慮して40 μLの追加容量が必要です)。
12. 120 μLの希釈バッファーを、カラム1および12(B2からH11)を除く低結合タンパク質プレート上の他のすべてのウェルにロードします。
13. 10個のチップを装着したマルチチャンネルピペットを使用して、120 μLのサンプルをA2-A11からB2-B11に移し、数回上下にピペッティングして、飛沫や気泡を避けながら混合することで、段階希釈を行います。このプロセスを繰り返し、ウェルH2-H11までカラムに沿ってプレートを下に移動します。最後の列のウェルから吸引した残りの120 μL容量を廃棄します。
    注:これで、サンプルを分析する準備が整いました。この時点までにブロッキングフェーズが完了していない場合は、サンプルが氷上に保管されていることを確認してください。
14. インキュベーションステップの最後に、200 μLの洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。
15. マルチチャンネルピペットを使用して、100 μLの希釈バッファーを「ブランク」としてカラム1および12に移します。
16. マルチチャンネルピペットを用いて、サンプル希釈液を含む低結合タンパク質96ウェルプレートの各ウェルから100 μLを洗浄したELISAプレートに移します。実行するすべてのELISAプレートについて繰り返します。
17. プレートを粘着性プラスチックフィルムで密封し、インキュベーターに37±2°Cで60±5分間置きます。
18. 10,995.6 μLの希釈バッファーに4.4 μLの抗体溶液を加えて0.2 μg/mLの濃度の検出抗体溶液( 材料表参照)を調製し、上下にピペッティングしてよく混合します。
    注:96ウェルにそれぞれ100 μLで合計11 mLが必要です(ピペッティング損失のために余分な容量があります)。評価するELISAプレートを追加するたびに、総容量を11 mLずつ増やします。溶液は調製直後に使用しなければならない。
19. インキュベーションステップの最後に、200 μLの洗浄バッファーでプレートを5回洗浄します。
20. 残りの洗浄バッファーを吸引し、マルチチャンネルピペットを使用して100 μLの検出抗体溶液をマイクロプレート上の各ウェルに分注します。
21. プレートを粘着性プラスチックフィルムで密封し、インキュベーターに37±2°Cで60±5分間置きます。
22. 検出抗体インキュベーションステップの終わりに向けて、4.4 μLのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲート溶液( 材料の表を参照)を10,995.6 μLの洗浄バッファーに添加してコンジュゲートを調製します。
    注:96 ウェル、それぞれ 100 μL には合計 11 mL が必要です (マルチチャンネルピペッティング用に容量を増やします)。評価するELISAプレートを追加するたびに、総容量を11 mLずつ増やします。
23. プレートを200 μLの洗浄バッファーで5回洗浄します。
24. 残りの洗浄バッファーを吸引し、コンジュゲート溶液100 μLを各ウェルに分注します。
25. プレートを粘着性プラスチックフィルムで密封し、37°Cのインキュベーターに37±2°Cで60±5分間置きます。
26. 製造元の指示に従って、最終洗浄ステップ中に基板を準備します( 材料表を参照)。各プレートについて、1錠のo-フェニレンジアミン二塩酸塩(OPD; 材料表を参照)を暗所で9 mLの脱イオン水に溶解し、1 mLの10倍安定過酸化物バッファーを補充します。評価するプレートの数に応じて、錠剤の数と溶液の総量(10 mL)を調整します。
27. プレートを200 μLの洗浄バッファーで5回洗浄します。
28. マルチチャンネルピペットを使用して100 μLの基質を各ウェルに分注します。
29. プレートを粘着プラスチックフィルムで密封し、アルミホイルを使用して光から保護された10〜20分間ベンチに置いておきます。
    注意: 彩度を避けるために、発色を視覚的に監視します。
30. 50 μLの停止溶液を各ウェルとリードプレートに直ちに加え、492 nmでの吸光度と620 nmの参照吸光度を確認します。
31. 補正された吸光度の読み取り値(492 nmでの読み取り値から620 nmでの読み取り値を引いた値)を使用してデータを分析し、すべてのサンプルからブランクの平均を引きます。シグモイド4PL補間法を使用して、吸光度値をIU / mLに変換します。最後に、250 μL(総サンプル量)を掛けてIUに変換します。
    注:この分析は、データ分析ソフトウェアを使用して実行できます。

結果

粒子のシーリングと充填は、このプロトコルで最も重要なステップの2つです。粒子はフルオレセインナトリウム塩で満たされ、理想的な充填といくつかの一般的なエラーを示しました。視覚化を容易にするために、RABV抗原の代わりにフルオレセインナトリウム塩を使用しました。充填中は、粒子コアの底に溶液を分注し、溶媒/水が蒸発するのに十分な時間を確保することが重要です。完了すると、溶質のデポが粒子コアの底に残ります(図1A)。充填したら、粒子を正しく密封することが重要です。 図1B は、シーリングプロセスのいくつかの結果(成功と失敗)を示しています。12秒のシーリング時間の後、粒子の中心から粒子の外側への明確な経路が残り、完全にシールされていない粒子を示しています。逆に、36秒間シールしたままにしておくと、PLGAはほぼ完全に溶融し、浅いプロファイルの微細構造になります。理想的な形態は、粒子構造を維持しながらポリマーによって完全にカプセル化された貨物を含むため、粒子が18秒と24秒間密封されると視覚化できます。 図1C は、充填およびシーリング後のいくつかの潜在的な結果を示しています。分注中に、溶媒が粒子の底に到達しない場合、粒子コアの中央で溶質が乾燥したままになります(誤って充填されています)。これらの粒子はまだ密閉される可能性がありますが、貨物の積み込みが不十分な場合、積み込み効率が制限される可能性があります。粒子があまりにも多くの貨物で満たされている(過充填されている)場合、貨物がPLGAが開口部を流れるのを妨げるため、シーリングプロセスが阻害されます。正しく充填および密封されると、この形状の粒子は19Gの針の中に簡単に収まるほど小さくなります。さらに、2%カルボキシメチルセルロースなどの粘性溶液を注入すると、10個の粒子が19 Gの針(100%±0%)を一貫して流れました(補足図7)。

図1:充填およびシーリングプロセスに関する一般的な問題 。 (A)画像は、粒子に6 nLの100 mg/mLフルオレセインナトリウム塩を水に溶解させた1回の充填サイクル後の溶媒の蒸発を示しています。(B)シーリングプロセスから0、12、18、24、および36秒で除去された502H PLGA粒子の代表的な画像。 (C)粒子が正しく充填された場合、正しく充填された場合、または過剰に充填された場合のシーリングプロセスの異なる結果。画像は、複数の画像をフォーカススタッキングし、フォーカススタッキングソフトウェアを使用してそれらをマージすることによって生成されます。スケールバー = 200 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

抗原を粒子にロードする前にスピンフィルターで抗原を処理することは、2つの理由で重要です。第一に、遠心分離はワクチン溶液中のストック賦形剤を除去するのに役立ち、RABV抗原を保持しながら粒子負荷容量を制限することができる。現在のプロトコルでは、抗原を約50倍精製します。第二に、抗原もこのプロセス中に濃縮されます。 図2A は、濃縮抗原試料中の無傷のRABVビリオンの顕微鏡写真を示す。この抗原は、出発ストック溶液よりも約4.4倍濃縮されています(図2B)。遠心スピンフィルターに最初にロードされた抗原の量は、達成される最終的なフォールド濃度を調節するように変更することができます。例えば、40 μLのストック抗原を負荷すると、約1.75倍の濃度になります。 補足図8 は、濃縮プロセスにおけるボルテックス(ステップ5.15)の重要性を示しています。サンプルのボルテックスを怠ったり、不適切にボルテックスしたりすると、濃縮プロセスが制限されます。

図2:抗原濃度。 抗原の濃度は遠心濾過により透過型電子顕微鏡(A)により示し、ELISA(B)により確認した。エラーバーは標準偏差を示します。統計分析は、一元配置分散分析によるテューキーの多重比較検定を使用して行われます。**p < 0.01, **p < 0.0001. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3A は、密封されていない粒子および密封された粒子に充填された濃縮抗原を示す。かなりの量の抗原が粒子にロードされますが(0.0469±0.0086IU)、この材料は粒子容量の<90%を占め、追加の抗原をロードするための十分なスペースを残します。興味深いことに、密封されていない粒子は0.0396±0.0077IUしか含まず、負荷された総量の85%±16%しか含まない。統計的に有意な損失であるが、RABV抗原の一部は、充填プロセスにおける再水和および乾燥の繰り返しの間に変性した可能性がある。封鎖後、抗原の69%±5%が生理活性型でカプセル化されたままである。これは、熱応力によるシーリングプロセス中に有意な損失が生じることを示唆していますが、不活化ウイルス抗原のほとんどは無傷のままです(図3B)。抗原と共に安定化賦形剤の同時封入は、製造プロセス全体を通して抗原安定性をさらに高めるための1つの可能な戦略であり、以前に他の不活化ウイルス抗原で成功している^14、15。

図3:粒子作製後の生理活性RABV抗原 。 (A)画像は、RABV抗原を含有する非密封および密封粒子を示す。(B)粒子作製工程による抗原安定性(n=4)。ローディング制御は、抗原を溶液に直接分注することによって生成されます。エラーバーは標準偏差を示します。スケールバー = 200 μm。統計分析は、一元配置分散分析によるテューキーの多重比較検定を使用して行われます。*p < 0.05.画像は、複数の画像をフォーカススタッキングし、フォーカススタッキングソフトウェアを使用してそれらをマージすることによって生成されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図 1: パーティクル、フィデューシャル、および配列の次元。 この図は、CAD ソフトウェアに表示される 4 つの尖った星の指標 (A)、円筒形の微粒子 (B)、五芒星の指標 (C)、および指標を持つ粒子の配列 (D) の幾何学的特性を示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:この図は、PDMS金型を硬化させるためにオーブンに入れられた構造の断面を示しています。 矢印は、バインダークランプが適用される場所を示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:濃縮抗原を効率的に回収するための適切な技術。 最初のスピンの終わりに、赤(A)で囲まれた濃縮サンプルはフィルターに保持され、ろ液は収集チューブの底(より大きな外管)に収集されます。ペレット状の抗原を再懸濁するために、ボルテックスの準備として回収管(B)を用いて遠心フィルターユニットをキャップする。ボルテックス時には、チューブの先端をボルテックスパッドに接触させ、ボルテックスパッド(C)との角度を45°に保ちながらキャップの端を回転させます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4:実行前のプログラミング圧電ディスペンサー。(A)「メインタブ」からロボットセットアップ>その他の>部門機能に移動して、「ターゲット基準点の検索」>「ターゲット基準点の検索」を設定します。青色で強調表示されているボタンを使用して、受託者マークを設定します。まず、[テンプレートの学習]を選択し、関心のある受託者マークの周囲にボックスを描画し、[テンプレートの検索]をクリックしてテンプレートの正確性を確認し、テンプレートを保存します。4 つ星と 5 つ星に対してこれを行い、「2 つの異なるテンプレート イメージを使用する」の手順に従ってファイル名を保存します。次に、ブラックボックス内のすべてのパラメータが一致していることを確認します。[テンプレートの読み込み] (緑色のボックス) を使用して 4 つの尖った星の指標を読み込みます。「ターゲット参照点の検索」プログラムを保存するには、タスクリスト(オレンジ色のボックス)を選択します。(B)ロボット設定>タスクタブに移動して実行を設定し、実行選択のタスク(緑色のボックス)を使用してタスクリスト(黒いボックス)からタスクを追加して、青いボックスに表示されている一連のタスクをロードします。最後に、タスク(オレンジ色のボックス)を保存します。(C)ロボットセットアップ>ターゲット基板に移動して「ターゲット基板」を設定し、ターゲット(青いボックス)を追加します。(D)ここに表示されているパラメータを入力し、保存(青いボックス)を選択します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図5:抗原のローディングとダイジングアラインメントのキャリブレーション。(A) [ノズルのセットアップ] > [タスクの実行] タブに移動し、TakeProbe 10 uL (ブラックボックス) を選択し、DO(ブラックボックス)をクリックして、10 μL の抗原を分注チップに吸引します。(B)これにより、別のウィンドウが開きます。濃縮抗原がロードされたウェルを選択し、OK (青いボックス) を選択します。(C)抗原を吸引した後、青いボックスを選択してチップを洗浄し、この洗浄をさらに2回繰り返します。カメラ(黒いボックス)を選択し、ドロップボリューム(緑色のボックス)を選択してドロップボリュームを決定します。体積標準偏差(%)<2(オレンジ色のボックス)で安定した液滴が形成されていることを確認します。(D)これらの手順に従うと、スナップドロップカムが開きます。ドロップダウンメニューで[画像](青いボックス)を選択し、[ノズルヘッドカメラウィザード]を選択します。これにより、新しいウィンドウが開きます。次の一連の手順をすばやく実行します。(E)補足図4で作成したターゲットがロードされていることを確認してから、[ターゲットに移動](青いボックス)を選択します。ドロップを15に調整し、スポット(ブラックボックス)を選択します。見つかったら、すぐに[移動](緑色のボックス)を選択します。[自動検索]が選択されていることを確認し、粒子サイズ= 12を削除してから、[開始](オレンジ色のボックス)をクリックします。自動検出に失敗した場合は、スライド上の別の領域(紫色のボックス)に移動してから、このプロセスを繰り返します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図6:スポッティングアレイのプログラミングと実行の開始。 (A) ターゲットセットアップ > ターゲットに移動し、青いボックスに表示されているパラメーターを入力します。(B)次に、[フィールド設定]タブに移動し、番号に 20 と入力します。ドロップフィールド(青いボックス)で、ウェル(黒いボックス)を選択してから、ディスペンスするターゲット/パーティクルを選択します(緑色のボックス)。別のウェルを選択し、ターゲット/パーティクルを再選択することで、1回のランで追加の充填サイクルが実行されます。(C)メイン画面で、 補足図5 で作成した実行とターゲットが選択されていることを確認します。(D)[実行]タブに移動し、[ 実行の開始 ](青いボックス)を選択します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図7:微粒子注入性。(A-C)フルオレセインナトリウム塩で満たされ、19Gの針に密封された微粒子の焦点積層ステレオスコープ画像。(d)合計10個の粒子を、2%カルボキシメチルセルロース溶液(n=8)を用いて19G針を通して注入した。スケールバー= 1 mm。エラーバーは標準偏差を示します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図8:抗原濃度に関する潜在的な問題。赤い線は、予想される濃度の倍率上昇を示します。エラーバーは標準偏差を示します。統計分析は、一元配置分散分析を用いたテューキーの多重比較検定を用いて行った。 p < 0.001, ****p < 0.0001.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:RABV ELISA用のバッファーおよび溶液の調製。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル1:パーティクルアレイを含むSTLファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル2:パーティクルのシールに使用されるカスタムスライドホルダーの形状を含むSTLファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

特定のニーズに合わせてパーティクルジオメトリを変更することができます。ただし、円筒構造の場合、著者らは、プロトコルに記載されている高さ:直径:壁の厚さの5:4:1の比率を維持することを推奨しています。このアスペクト比により、粒子を密封するのに十分なPLGA材料が存在し、取り扱いに十分な機械的堅牢性を維持します。粒子の寸法と形状はCADプロセス中に簡単に変更できるため、無数の形状を生成できます。CADの柔軟性と3Dプリントを組み合わせることで、微粒子設計の迅速な反復が可能になります。このプロトコルは多光子3Dプリンタを使用しますが、微細構造寸法を適切な材料で印刷できる仕様の任意の3Dプリンタを使用して、最初のマスターモールドを生成できます。さらに、フォトリソグラフィは、このプロトコルで生成されたものよりもはるかに大きなアレイ内の同様の構造を作成するために以前に使用されてきました。しかし、手間、カスタムメイドのフォトマスクの注文の遅れ、機器のアクセシビリティにより、反復的な設計プロセスが遅くなります¹⁶。最後に、社内のマスターモールド製造が不可能な場合、マスターモールドの生成は有料サービス会社にアウトソーシングできます。マスターモールドの生成に使用される3Dプリンターや方法に関係なく、プリントの基板への接着は、下流のステップで重要です。具体的には、PDMSモールドの生成中に接着性が不十分な場合、プリントされたパーティクルがPDMSモールドに留まったままになるため、プリントパーティクルを手動で除去し、マスターモールドを破壊する必要があります。

粒子の充填は、考慮すべきもう一つの重要な側面です。微粒子は充填能力が限られているため、ろ過はRABV抗原を濃縮するだけでなく、微粒子コア体積の大部分を占めるストック賦形剤を除去するためにも使用されます。しかし、RABV抗原のサイズが大きい(約60 nm x 180 nm)¹⁷ため、遠心分離ステップ中に抗原を部分的にペレット化することが可能です。このため、RABV抗原の高い回収率を達成するためには、遠心分離後にピペッティングやボルテックスによって抗原を再懸濁することが重要である。高濃度溶液は、分注サイクルを短縮し、充填中の抗原分解を制限するため、分注に最適です。ただし、粘度は圧電ディスペンシングロボットが安定した液滴を形成する際の大きな制限であるため、非常に高濃度の溶液をディスペンスすることは不可能または推奨されない場合があります。安定した液滴形成を実現する最も簡単な方法は、充填液を希釈することですが、所望の充填を達成するために必要な追加の充填サイクルにおける抗原の安定性と、粒子の充填に必要なより長い時間を考慮する必要があります。

制限
この方法では、初期金型を製造するための高度に専門化された機器と、微粒子製造用の特殊な充填装置が必要です。初期のマスターモールドを生成できる印刷解像度を備えた3Dプリンターの必要性は、サービスごとの有料アプローチによって覆すことができますが、圧電ディスペンシングロボットへのアクセスは制限されています。圧電ディスペンシングロボットの調達には、ブランド、スループット、および機能に応じて、多くの場合80,000ドルから200,000ドルの範囲で、多額の初期先行投資が必要です。他のいくつかの充填方法が潜在的な代替手段であるが、これらの方法はRABV抗原¹²を用いて検証されていない。

将来のアプリケーション
封入されたRABV抗原のかなりの割合は、シーリングプロセスを通じて安定なままでした。理論的には、曝露後予防治療の投与タイムラインを模倣する異なるタイプのPLGAで構成される粒子にこの抗原を組み込むことにより、すべての用量を1回の注射で投与することができます。追加の用量を投与するために繰り返し通院する必要がなくなると、患者のコンプライアンスが向上し、治療結果が向上します。さらに、高度に複雑な不活化狂犬病ウイルスのELISA反応性を保持する能力を実証したので、サブユニットワクチンを含む他の抗原がこのカプセル化方法に適合する可能性があります。PULSED微粒子で他の予防抗原を使用すると、ワクチン接種が不十分な集団のワクチン接種率を高めることで、LMICで何百万人もの命を救うことができます。しかし、これを達成するには、ワクチンはカプセル化だけでなく放出によっても安定している必要があり、ペイロードは体温とPLGA分解生成物による高温と潜在的に酸性の微小環境にさらされるため、困難な場合があります¹⁸。今後の研究では、放出による抗原の安定化戦略を追求し、多くの感染症の予防に広く適用できる単回注射ワクチン接種プラットフォームの可能性を開くでしょう。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 以上m PES フィルター	コール・パーマー+B4B2:B63	04396-26
0.25 mm シム	マクマスター カー	98090A935
0.75 インチ バインダー クリップ	ステープルズ	480114
10 mL シリンジ	ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー	309604
10 mL 拡大鏡付き滅菌ポリスチレン使い捨て血清ピペット ストライプ	フィッシャーブランド	13-678-11E
101.6 mm Cクランプ	アマゾン	PT-SD-CP01A	黒いハンドルは最終的に落ちます。これが発生したら、ペンチを使用して調整してください。
19 G 針	エクセリント	26438
25 mL 拡大鏡の縞が付いている生殖不能のポリスチレンの使い捨ての血清学のピペット	Fisherbrand	13-678-11
3-(トリメトキシシリル) メタクリレートのプロピル	ミリポアシグマ	M6514-25ML
5mL 滅菌ポリスチレンディスポーザブル血清ピペット、拡大鏡ストライプ	付きエッペンドルフ	22431081
50mL遠心チューブコー	ニング
50mL 拡大鏡の縞が付いている生殖不能のポリスチレンの使い捨ての血清学のピペット	Fisherbrand	13-678-11F
アセトン	のフィッシャー	AC268310010
アルミニウム ブロック	McMaster Carr	9057K175
アルミ ホイル	VWR	89079-069
Amicon Ultra 0.5 mL 遠心フィルター、100 kDa	ミリポア シグマ	C82301
抗狂犬病ウイルス抗体、無血清抗体、クローン1112-1、100	フィッシャーブランド	13-678-11D
抗狂犬病ウイルスマウスモノクローナル抗体、クローンD1-25、ビオチン化	フィッシャーブランド	14-388-100
ボキシメチルセルロース	東京化学工業	C0045
チップ300、フィルター、ラック付き	フィッシャーブランド	13-678-11
Costar 0.65 mL 低結合スナップキャップ 微量遠心チューブ	コーニング	3206
Costar 1.7 mL低結合スナップキャップ微量遠心チューブ	コーニング	3207
	Nanoscribe 3Dプリンターの印刷パラメーターを定義するために使用されるNanoscribeソフトウェアの説明は、プリンターに付属のステップ1.2. ソフトウェアです。
デシケーター	フィッシャー サイエンティフィック	10529901	または同等の
両面テープ	ステープル	649280
DPBS (10x)、カルシウムなし、マグネシウムなし	Gibco	14200075
エタノール	VWR	89370-084
F1-ClipTip マルチチャンネル ピペット、30 から 300 & マイクロ;L	Fisherbrand	13-678-11E
Fisherbrand SureOne エアロゾル バリア ピペット チップ、0.1 – 10 & マイクロ;L	フィッシャーブランド	13-678-11F
フィッシャーブランド SureOne エアロゾル バリア ピペット チップ、100 – 1000 & マイクロ;L	Fisherbrand	03-448-17
Fisherbrand SureOne エアロゾル バリア ピペット チップ、2 – 20 µL	Fisherbrand	FB14955202
Fisherbrand SureOne エアロゾル バリア ピペット チップ、20 – 200 & マイクロ;L	フィッシャーブランド	13-374-10
フィッシャーブランド エリートピペットキット	フィッシャーブランド	05-408-137
フィッシャーブランド ピペットコントローラー	フィッシャーブランド	FB14955202
ガラス ペトリ皿、90 mm	VWR	470313-346
スライド ガラス	グローブ サイエンティフィック	1380-10
Helicon Focus 8	HeliconSoft		スタック イメージの焦点を合わせるために使用されるソフトウェア
IP-Q 樹脂	Nanoscribe		プリンターレジンは10倍レンズと互換性があり、Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar、EL-USB-TC-LCD、熱電対	、Amazon	5053485896236	、または同等の
顕微鏡スライドボックス	、ミリポア、シグマ	、Z374385-1EA	または同等の
Nanoscribe Photonic Professional GT2、10倍対物レンズ付き、Nanoscribe	クロ
ミクス、大型の微細構造のプリントに使用されます。	Nanoscrive 3Dプリンターとのインターフェースに使用されるNanoWrite Nanoscribeソフトウェア. プリンターに付属のソフトウェア。
Nunc MaxiSorp 平底 96 ウェルプレート	Invitrogen	44-2404-21
OPD 基質錠剤 (o-フェニレンジアミン二塩酸塩)	Fisherbrand	02-707-432
Parafilm M Wrapping Film, 4 in.	フィッシャーブランド	13-374-10
PDC 60 タイプ 3 コーティング	Scienion	P-2020
PDMS 粒子金型	ライス 大学	n/	a N/A- 粒子は 400 μ直径 m で、壁の厚さは 100 μm、高さは500&mu。mで、内径は200μmになります。配列は 14 x 22 個の粒子で、間隔は 600 μmは互いに離れています。4 点と 5 点の星は、600 μm 配列上の右上と左上のパーティクルの左右に m あります。
ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィ	08-757-100D
ピアス 安定過酸化物基板バッファー (10x)	フィッシャーブランド	02-707-430
プラスチックカップ	フィッシャーサイエンティフィック	S04170
PLGA フィルム、502H	シグマ	502H: 719897-1G
プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート	ミリポアシグマ	484431
狂犬病抗原	カイロンベーリングとバーラトバイオテックインターナショナル		マテリアルは、会社と材料譲渡契約を締結することにより買収されました。
かみそりの刃	VWR	55411-050
メス	VWR	21899-530 および 76457-512
SciFLEXARRAYER S3 PCD 60	Scienion		または
同等の 96 ウェルプレート用シーリングテープ	Thermo Scientific	15036
シリコンウェーハ	ユニバーシティウェーハ	1025
スプリングクランプ	IRWIN
ステンレス鋼ブロック	マクマスター	カー9083K12
ストレプトアビジン&マイナス;ペルオキシダーゼポリマー、超高感度	フィッシャーブランド	02-707-404
シルガード 184	ダウ	2646340
テフロンシート	マクマスターカー	9266K12	PLGAフィルムの製造に使用されます。適切なサイズにカットする必要があります。
テフロンシート、厚さ0.8mmの	マクマスター	カー9266K81
トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シラン	シグマ	448931-10G
ピンセット	Pixnor	ESD-16
UltraPure Distilled Water	Fisher Scientific	10977015
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker	UVP	95-0174-01	または同等の
真空デシケーター	Bel-Art	F420100000	これらのうちの 2 つが必要になります。1つは、汚染を防ぐためにトリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シランでサンプルを前処理するためにのみ使用されます。
120°に達することができる真空オーブン。C	VWR	97027-664	または同等の
真空、CRVpro4	ウェルチ	3041-01	または同等の
木製舌圧子	電子顕微鏡科学	72320