本稿では,シロイヌナズナの花粉管誘導・受容観察のためのセミインビトロ(SIV)法の改良により,胚珠の受容性を高める方法について述べる.ハイスループットSIV兼セプタム法は、配偶体マーカーラインおよび遺伝的にコード化されたバイオセンサーと組み合わせて、受精の動的プロセスを監視できます。
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この記事について
サマリー
要約
顕花植物では、雌しべ内の花粉管(雄性配偶体)の成長と誘導、および雌性配偶体による花粉管の受容が二重受精とその後の種子発育に不可欠です。花粉管受容中の雄と雌の配偶体の相互作用は、花粉管破裂と2つの精子細胞の放出で最高潮に達し、二重受精をもたらします。花粉管の成長と二重受精は花の組織内に深く隠れているため、この過程を 生体内で観察することは困難です。
モデル植物シロイヌナズナの受精の生細胞イメージングのためのセミインビトロ(SIV)法が開発され、いくつかの研究で実施されています。これらの研究は、顕花植物で受精プロセスがどのように起こるか、そして雄と雌の配偶体の相互作用の間にどのような細胞的および分子的変化が起こるかという基本的な特徴を解明するのに役立ちました。ただし、これらの生細胞イメージング実験には個々の胚珠の切除が含まれるため、イメージングセッションあたりの観察数が少なく、このアプローチは面倒で非常に時間がかかります。他の技術的困難の中でも、花粉管がin vitroで胚珠を受精させることができないことがしばしば報告され、そのような分析はひどく混乱します。
ここでは、花粉管の受容と受精を自動化されたハイスループットな方法でイメージングするための詳細なビデオプロトコルが提供されており、イメージングセッションごとに花粉管の受容と破裂を最大40回観察できます。遺伝的にコードされたバイオセンサーとマーカーラインの使用と組み合わせることで、この方法は、時間の投資を抑えて大きなサンプルサイズを生成することを可能にします。花の病期分類、解剖、培地調製、イメージングなど、この技術のニュアンスと重要なポイントは、花粉管の誘導、受容、および二重受精のダイナミクスに関する将来の研究を容易にするために、ビデオ形式で明確に詳細に説明されています。
概要
有性生殖生物における遺伝的にユニークな子孫の生成は、男性と女性の配偶子の融合の成功に依存しています。顕花植物では、二重受精中の2つの雄性配偶子(精子細胞)と2つの雌配偶子(卵細胞および中心細胞)との相互作用は、花粉管(雄性配偶体)からの精子放出に依存する。このプロセスは花粉管受容と呼ばれ、胚嚢内に存在する相乗細胞(雌性配偶体)によって大きく制御されています1,2。花粉管受容は花の奥深くで行われるため、セミインビトロ(SIV)花粉管受容と呼ばれる生細胞イメージングを可能にする方法が確立されました3。この方法では、切除されたシロイヌナズナを半液体の花粉発芽培地に置き、スタイル伝達管接合部で切断された雌しべの柱頭とスタイルを通して成長する花粉管によって標的とされます3,4。この技術の開発以来、詳細な観察により、花粉管の誘導、受容、および受精を取り巻くいくつかの発見につながりました。とりわけ、これらの発見には、柱頭3を介した成長による花粉管標的能力の獲得、花粉管到達時の相乗作用における細胞内カルシウム振動の開始5,6,7,8,9<....
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プロトコル
注意: このプロトコルで使用される材料と機器のリストについては、 材料の表 を参照してください。
1. イメージング実験の設計に関する考慮事項
- 観察したい現象を捉えるために必要な撮影時間とサンプリング周波数を事前に決定します。たとえば、ナイキストのサンプリング定理に従うと、サンプリング周波数は入力サンプルの最高周波数の2倍より大きくなければなりません。したがって、Synergid[Ca2+]cyt 振動を正確に捉えるためには、約10秒おきにイメージングを行うが、花粉管排出時の精子細胞の速度を測定するには、1秒10未満の時間分解能を確保する。
- 目的の細胞の蛍光マーカーのうち、バックグラウンド自家蛍光を超えて十分に明るいものを選択します。バイオセンサーを使用する場合は、一般的に感度が高く、露光時間が少なくて済むため、細胞機能を乱さない最も明るい線を選択してください。
- 目的の現象を捉えるのにどのタイプの蛍光顕微鏡と倍率が最も適しているかを検討してください。広視野顕微鏡と低倍率対物レンズを使用して、より深い被写界深度から光を取り込み、時間の経過とともに焦点を維持し、胚珠全体などのより大きな物体を画像化するか、色シフトアーチファクトに敏感なレシオメトリックセンサーを使用....
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結果
シロイヌナズナの花粉管破裂に対する受容性シナジイドの核変性のタイミングを評価するとともに、左右のシナジロイドが受容シナジロイドになる運命にあるかどうかを観察するために、ここで説明したSIV兼中隔法を採用し、雌性配偶体核マーカーとシグイド細胞質マーカー(pFG:roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1)をセプタムドナーとし、雄性配偶体マーカー(pLAT52:R-GECO)を花粉ドナーとする。セプタムと受粉した柱頭は、プロトコルのセクション4〜5に従って、去勢の24時間後に解剖され、前日に準備された培地でガラス底皿に置かれました。各皿を顕微鏡上の湿度チャンバーに入れ、5つの概観領域を備えた10倍の対物レンズ(開口数:0.4)を使用して多段階実験を行いました(図3)。各領域の画像は、R-GECO(25ミリ秒)の場合はチャンネル(1)560/640、roGFP2-ORP1(60ミリ秒)の場合はチャンネル(2)488/520、roGFP2-ORP1(60ミリ秒)の場合はチャンネル(3)3.......
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ディスカッション
この原稿は、 シロイヌナズナの花粉管受容と二重受精のイメージングのための効率的なプロトコルを紹介します。改良された方法であるSIV cum septumは、イメージングセッションごとに観察可能な花粉管受信イベントの成功率と総数を大幅に増加させます。ここに示す代表的な結果は、41個の花粉管受容イベントが成功し、10個の胚珠が受容障害(~80%効率)を示すイメージングセッションを示しています。これは、元のSIV摘出胚珠法を使用して合計8回のイメージングセッションでキャプチャされた花粉管受容イベントの2倍以上です(ビデオ1)。5回の技術反復でSIV 兼セプタム 法を使用し、合計8回の隔壁で、花粉管の平均受容効率は79%でしたが、SIV切除隔壁法では8回の技術反復で平均28%でした(図4)。
花粉管の受容効率はSIV 兼中隔 法の方がはるかに高いですが、花粉管の異常増殖の例は、いくつかの要因に応じて、さまざまな速度で発生します.......
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開示事項
著者らは利益相反を報告していない。
謝辞
pFG:roGFP2-ORP1-NLSコンストラクトを寄贈してくださったSara Simonini氏とStefano Bencivenga氏、顕微鏡に関するアドバイスをくださったChristof Eichenberger氏、Johann Almendinger氏、Vincent Sutter氏、Celia Baroux氏に感謝します。ラヴィ・パラニヴェル、フィリップ・デニンガー、シャロン・ケスラー、マーク・ジョンソン、川島智和、および2022年の有性植物生殖に関する国際会議で、SIV兼セプタムに関するプロトコルに関心を示した他のすべての人からのアドバイスに感謝します。この研究は、チューリッヒ大学とスイス国立科学財団から英国への助成金によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1mmスライドガラス | エプレディア | ||
| 35 mmガラス底皿(14 mm井) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 塩化カルシウム | ロス | CN93.1 | |
| コロンビア (Col-0) | ノッティンガムシロイヌナズナストックセンター(NASC) | 柱頭ドナー | |
| 解剖スコープ | オリンパス | SZX2-ILLT | |
| インスリン針 (0.3 G) | BD | 304000 | |
| ランズベルク エレクタ (Ler-0) | ノッティンガムシロイヌナズナストックセンター(NASC) | セプタムドナー | |
| 硫酸マグネシウム | メルク | 5886 | |
| 塩化カリウム | ロス | 6781.1 | |
| カミソリ刃 | ベルデュラ | 7026797 | |
| スコッチ両面テープ | スコッチ | 768720 | 厚さが少なく、柱頭解剖に適しています |
| 塩化ナトリウム | Roth | 3957.1 | |
| ショ糖 | ITW試薬 | A2211,1000 | |
| テサ両面テープ | テサ | 05681-00018 | 非常に粘着性があり、セプタム解剖に適しています |
| 超低ゲル化温度アガロー | FMC SeaPrep | 50302 |
参考文献
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control ....
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再版と許可
