本稿では,シロイヌナズナの花粉管誘導・受容観察のためのセミインビトロ(SIV)法の改良により,胚珠の受容性を高める方法について述べる.ハイスループットSIV兼セプタム法は、配偶体マーカーラインおよび遺伝的にコード化されたバイオセンサーと組み合わせて、受精の動的プロセスを監視できます。
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この記事について
サマリー
要約
顕花植物では、雌しべ内の花粉管(雄性配偶体)の成長と誘導、および雌性配偶体による花粉管の受容が二重受精とその後の種子発育に不可欠です。花粉管受容中の雄と雌の配偶体の相互作用は、花粉管破裂と2つの精子細胞の放出で最高潮に達し、二重受精をもたらします。花粉管の成長と二重受精は花の組織内に深く隠れているため、この過程を 生体内で観察することは困難です。
モデル植物シロイヌナズナの受精の生細胞イメージングのためのセミインビトロ(SIV)法が開発され、いくつかの研究で実施されています。これらの研究は、顕花植物で受精プロセスがどのように起こるか、そして雄と雌の配偶体の相互作用の間にどのような細胞的および分子的変化が起こるかという基本的な特徴を解明するのに役立ちました。ただし、これらの生細胞イメージング実験には個々の胚珠の切除が含まれるため、イメージングセッションあたりの観察数が少なく、このアプローチは面倒で非常に時間がかかります。他の技術的困難の中でも、花粉管がin vitroで胚珠を受精させることができないことがしばしば報告され、そのような分析はひどく混乱します。
ここでは、花粉管の受容と受精を自動化されたハイスループットな方法でイメージングするための詳細なビデオプロトコルが提供されており、イメージングセッションごとに花粉管の受容と破裂を最大40回観察できます。遺伝的にコードされたバイオセンサーとマーカーラインの使用と組み合わせることで、この方法は、時間の投資を抑えて大きなサンプルサイズを生成することを可能にします。花の病期分類、解剖、培地調製、イメージングなど、この技術のニュアンスと重要なポイントは、花粉管の誘導、受容、および二重受精のダイナミクスに関する将来の研究を容易にするために、ビデオ形式で明確に詳細に説明されています。
概要
有性生殖生物における遺伝的にユニークな子孫の生成は、男性と女性の配偶子の融合の成功に依存しています。顕花植物では、二重受精中の2つの雄性配偶子(精子細胞)と2つの雌配偶子(卵細胞および中心細胞)との相互作用は、花粉管(雄性配偶体)からの精子放出に依存する。このプロセスは花粉管受容と呼ばれ、胚嚢内に存在する相乗細胞(雌性配偶体)によって大きく制御されています1,2。花粉管受容は花の奥深くで行われるため、セミインビトロ(SIV)花粉管受容と呼ばれる生細胞イメージングを可能にする方法が確立されました3。この方法では、切除されたシロイヌナズナを半液体の花粉発芽培地に置き、スタイル伝達管接合部で切断された雌しべの柱頭とスタイルを通して成長する花粉管によって標的とされます3,4。この技術の開発以来、詳細な観察により、花粉管の誘導、受容、および受精を取り巻くいくつかの発見につながりました。とりわけ、これらの発見には、柱頭3を介した成長による花粉管標的能力の獲得、花粉管到達時の相乗作用における細胞内カルシウム振動の開始5,6,7,8,9、および花粉管破裂時の精子細胞の放出と受精のダイナミクスが含まれます10.しかし、この技術は胚珠の摘出に依存しているため、受精の観察数は限られており、花粉管の受容が異常であることが多く、花粉管破裂の失敗につながります(ビデオ1および補足ファイル1)。したがって、花粉管の受容と受精のハイスループット分析を可能にする、より効率的なアプローチが必要です。
このプロトコルの開発では、花粉管の受容を分析するためのいくつかの新しいアプローチがテストされ、最も「in vitro」の方法から最も「in vivo」の方法まで、中隔全体の切除に基づく効率的な技術が決定され、1日あたり最大40回の受精観察が可能になりました。ここでは、花の病期分類、解剖、培地の準備、イメージング設定など、技術のニュアンスと重要なポイントについて概説します。このプロトコルに従うことにより、花粉管誘導、花粉管受容、および二重受精に焦点を当てた研究が促進されるはずです。この方法が可能にするより高いサンプルサイズは、ライブイメージング実験から導き出された結論の科学的健全性を強化することが期待されます。この技術の潜在的な用途には、遺伝的にコードされたバイオセンサーの使用による配偶体相互作用中の細胞質カルシウム濃度([Ca2+]cyt)、pH、またはH2O2の分子的および生理学的変化の観察を行うことが含まれるが、これらに限定されない。さらに、受容的相乗作用の変性、精子細胞移動、または核分裂などの細胞学的変化は、この改良された方法を使用してより容易に観察することができる。最後に、受精のさまざまな段階のタイミングを広視野顕微鏡で監視し、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)または2光子励起顕微鏡(2PEM)を使用してより詳細な分析を行い、より高い解像度と3D再構成を行うことができます。
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プロトコル
注意: このプロトコルで使用される材料と機器のリストについては、 材料の表 を参照してください。
1. イメージング実験の設計に関する考慮事項
- 観察したい現象を捉えるために必要な撮影時間とサンプリング周波数を事前に決定します。たとえば、ナイキストのサンプリング定理に従うと、サンプリング周波数は入力サンプルの最高周波数の2倍より大きくなければなりません。したがって、Synergid[Ca2+]cyt 振動を正確に捉えるためには、約10秒おきにイメージングを行うが、花粉管排出時の精子細胞の速度を測定するには、1秒10未満の時間分解能を確保する。
- 目的の細胞の蛍光マーカーのうち、バックグラウンド自家蛍光を超えて十分に明るいものを選択します。バイオセンサーを使用する場合は、一般的に感度が高く、露光時間が少なくて済むため、細胞機能を乱さない最も明るい線を選択してください。
- 目的の現象を捉えるのにどのタイプの蛍光顕微鏡と倍率が最も適しているかを検討してください。広視野顕微鏡と低倍率対物レンズを使用して、より深い被写界深度から光を取り込み、時間の経過とともに焦点を維持し、胚珠全体などのより大きな物体を画像化するか、色シフトアーチファクトに敏感なレシオメトリックセンサーを使用します。CLSMまたは2PEMを高倍率対物レンズとともに使用して、細胞および細胞内オブジェクトの解像度を向上させますが、時間の経過とともに焦点を維持するのが難しいことに注意してください。
- 実験ごとに画像化するサンプルの数を推定します。例えば、オートフォーカスと多段階取得機能に必要な時間のため、3つのセプタムをイメージングし、実験ごとに最大40の受精イベントをイメージングするには、最小サンプリング時間が~30秒の10倍の対物レンズを使用します。
2.花粉発芽培地の調製
- 液体花粉発芽培地(5mM CaCl2、1mM MgSO4、5mM KCl、0.01% [w/v] H3BO3、および10% [w/v] スクロース)を調製し、各微量栄養素の1 Mアリコートストックを使用し、-20°Cで保存します。 pHを0.1 M KOHで7.5に調整します。培地を4°Cで最大2週間保存します。
注意: pHは時間の経過とともに低下する可能性があります。 - 10 mLビーカーに2.5 mLの液体培地を加え、32 mgの超低融点アガロース(~1.3%)を高速回転する攪拌子でゆっくりと加えます。
- 65°Cのホットプレートでアガロースを溶かし、ビーカーをナッツ状にして側面から結露を集めます。
- 130 μLの培地を35 mmガラス底皿の14 mmウェルにピペットで入れ、培地がウェルを覆うまでディッシュを回転させます。
- ディッシュの中央からピペットで合計40 μLを吸引し、総容量90 μLを残します。
注:より多くの培地をウェルから吸引して、総容量を減らすことができます。これは、作動距離の短い高倍率対物レンズに必要になる場合があります。ただし、寒天パッドが薄いほど、乾燥が早くなります。 - 湿度チャンバー内のアルミニウムブロックで皿を冷却して、均一な冷却を確保します。プレートを4°Cで一晩保管し、翌朝使用します。
3.セプタムドナー、スティグマドナー、花粉ドナーの花の病期分類
図1:中隔ドナー、柱頭ドナー、花粉ドナーの花の病期分類。 (A)花序内の シロイヌ ナズナの花(Ler-0)の段階。ステージ12Bのつぼみは、開こうとしている花びらと黄色の無葯を持っていますが、すべてのがく片、花びら、雄しべを取り除くことによって去勢する必要があります。雌しべ(雌の配偶体メーカーを抱く)は、24時間後にセプタムドナーとして使用できます。(B)花序内の シロイヌナ ズナの花(Col-0)の段階。ステージ12Bの芽は、花びらからかろうじて出ている黄色の葯と柱頭があり、すべてのがく片、花びら、雄しべを取り除くことによって去勢する必要があります。雌しべは、24時間後に柱頭ドナーとして使用でき、開いて花粉を落とす花(雄の配偶体マーカーを宿す)によって受粉する必要があります。受粉した柱頭は受粉から1時間以内に解剖されるべきです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- イメージングの前朝、セプタムドナーとスティグマドナーとして使用する シロイヌ ナズナ植物を選択します。彼らが健康であり、最近シリケを生産し始めていることを確認してください。
注:ランツベルク エレクタ (Ler-0)は、セプタムが頑丈で、胚珠の間に小さな節間があるため、セプタムドナーとして使用するのに適したアクセッションです。コロンビア(Col-0)は、花粉管の成長を助長するようであるため、柱頭ドナーとして使用するのに適したアクセッションです。 - 雄しべ、がく片、花びらを取り除くことにより、少なくとも3つのステージ12Bセプタムドナー花と12ステージ12B柱頭ドナー花を去勢します(図1A、B)。同じ花序の古い花も取り除き、去勢された花を受粉させる可能性があります。
- 24時間後の朝、花粉を容易に排出している花粉ドナーの花(例えば、花粉管または精子細胞マーカーを抱いている)で柱頭ドナーを受粉させる。柱頭が花粉でほぼ完全に覆われると、受粉は完了します(図1B)。
4.セプタム解剖
図2:中隔と柱頭の解剖のクイックガイド 。 (A)中隔解剖のステップ。インスリン注射針で雌しべを両面テープに固定し、スタイル-卵巣接合部と卵巣-椎弓根接合部に切り込みを入れ、続いていずれかの心皮の中隔に沿って浅い切り込みを入れます(ステップ1)。カーペットの壁をはがしてテープに戻します(ステップ2)。上部のセプタムの下でリプラムを切ります(ステップ3)。スタイルでセプタムを切り、ペディセルで鉗子を使用して取り外します(ステップ4)。セプタムを寒天培地に置き、鉗子でやさしく埋め込みます。(B)スティグマ解剖のステップ。雌しべ(受粉<1時間前)を両面テープに固定し、かみそりの刃でスタイルと卵巣の接合部で切断します(ステップ6)。中隔の横にあるインスリン針で寒天培地に柱頭を置き、距離を約250μmに調整します(ステップ7〜8)。スタイルのマイクロパイルとベースの周りに半液体プールが形成されていることを確認します(ステップ9)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 受粉の30分後、茎で健康で成熟した中隔ドナー雌しべを収集し、テープの端から柱頭がちょうど突き出た状態で、スライドガラスに取り付けられた新しい両面粘着テープに置きます。
注意: 雌しべが粘着テープ上にある解剖時間を制限して、できるだけ短くしてください。解剖は高湿度で行われるべきであり、それはスライドの隣に加湿器を置くことによって達成することができる。 - 去勢から残ったがく片、花弁、雄しべの破片を取り除く前に、新しいインスリン注射針の裏側を使用して椎弓根をそっと押し、卵巣に沿って雌しべをテープにしっかりと固定します。
- ステレオスコープの下で、インスリン注射針を使用して、スタイル-卵巣接合部と卵巣-椎弓根接合部で心皮ごとに2つの切り込みを入れ、続いて各心皮の中隔に沿って浅い切り込みを入れます(図2、ステップ1)。
注:中隔に沿って深く切りすぎると、フニキュラスの胚珠が切断されます。 - 卵巣壁をテープに注意深く剥がし(図2、ステップ2)、2つのセプタムの間で針をそっとスライドさせて、胚珠を乱すことなく雌しべの全長に沿ってリプラムを切ります(図2、ステップ3)。
注:スタイルから茎の方向にリプラムをカットして、上部の中隔の胚珠ができるだけ乱されないようにします。 - スタイルとの接合部と椎弓根の両方の上部中隔を穏やかに切り、鉗子で中隔を椎弓根側から取り外します(図2、ステップ4)。
注意: セプタムが平らに保たれ、湾曲しないように、このカットをまっすぐに穏やかに保ちます。 - 胚珠の小丘が上向きで同じ焦点面になるように、中隔を培地上にできるだけ平らに置きます。胚珠が培地にわずかに埋め込まれるまで、セプタムを培地にそっと押し込みます(図2、ステップ5)。
注:胚珠の小丘が花粉管にアクセスできるように中隔を配置することが重要です(アクセスできない胚珠は針で穏やかに再配置できます)。埋め込み後、セプタムの周りに小さな液体のプールが形成されるはずです。 - さらに最大2つの雌しべについて手順4.1〜4.6を繰り返し、セプタムを端から端まで配置します。
5.スティグマ解剖
- 受粉した柱頭ドナー雌しべを、子房スタイルの接合部がテープの端から外れるように、スライドガラスに取り付けられた新しい両面粘着テープに置きます(図2、ステップ6)。
- 新しいかみそりの刃を使用してスタイルをまっすぐに切り落とし、持ち上げて柱頭を刃に付けたままにします(図2、手順6)。
注意: 最もきれいなカットのためにテープの端でカットします。 - インスリン注射針で刃から柱頭を取り除き、胚珠から約250〜300μm平らに置きます(図2、ステップ7〜8)。
注: スタイルは横向きに水平にする必要があります。さもなければ、花粉管のほとんどは中隔の下で成長します。スタイルの入り口にある小さな液体のプールは、1分間媒体に横たわった後に表示されます。花粉管はスタイルからスムーズに出るので、これは良い兆候です。 - 最大12の柱頭に対して手順5.1〜5.3を繰り返し、各セプタムの両側に2つずつ配置します。胚珠の小丘の周りに形成される液体の小さなプールを探します。これは、胚嚢への花粉管のアクセスとターゲティングを支援します(図2、ステップ9)。
注意: 培地と胚珠が乾燥するのを防ぐために、皿が開いている時間を制限してください。
6. イメージング
図3:SIV兼セプタムイメージングスキーム。 (A)ステレオスコープを通して見たように、12の受粉柱頭と3つのセプタムを備えた完全なSIV兼セプタムセットアップ。(B)10倍対物レンズを使用したインキュベーション後5時間で見られた完全なSIV兼セプタムセットアップのマージ画像と、5つの概要領域(それぞれ~1 mm)に多段階取得用にマークされています。緑色のボックスは、シナジイドで爆発的なバーストを受けた花粉管を受け取った胚珠を示しています。(C)異なる時点での概観領域2の詳細なビュー。顕微鏡の湿度チャンバーでインキュベートしてから約3時間後、花粉管は小丘の近くに到着し、6時間のイメージングまでに、ほとんどの胚珠は花粉管(緑色の四角)を適切に受け取っているはずです。これらの胚珠は、爆発的な花粉管破裂(アスタリスク)を受けます。スケールバー = (A) 5 mm, (B,C) 500 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 解剖が完了し、皿を画像化する準備ができたら、相対湿度92%、21°Cに維持された顕微鏡上の湿度チャンバーでインキュベートします。
注:顕微鏡に使用できる湿度チャンバーがない場合は、蓋と皿の外縁を少量の水で裏打ちすると、皿内の湿度を高く維持するのに役立ちます。 - 低光強度の明視野下でサンプルに焦点を合わせてから蛍光灯に切り替え、ステージの概要上のサンプルの領域を画像化します。
注意: 10倍の倍率では、約5つの領域にマークを付けて、合計3つのセプタムにマークを付けることができます(図3)。蛍光灯による光毒性やサンプルの加温を最小限に抑えるために、概要領域のマーキングに使用する時間を制限します。 - 各オーバービューエリアの最初にオートフォーカス機能を備えた多段階取得スキームを使用してイメージングを開始します。花粉管はサンプルをインキュベートしてから~1時間後にスタイルから出てくるので、花粉管が小丘に達するまで取得を2時間遅らせます。オートフォーカスが100 μmの範囲(7 μmの大きなステップと1 μmの細かいステップ)に設定されていることを確認して、中隔が時間の経過とともにわずかに移動および沈むときに胚珠に焦点を合わせ続けます。
- サンプルインキュベーションを開始してから~9時間後に画像取得を停止し、この時点でほとんどの胚珠が花粉管を引き付けて受け取っているはずです。
注:胚珠の数が少ないと花粉管を引き付ける場合は、ステレオスコープで皿を注意深く観察することで、次回胚珠またはスタイルの向きをどのように改善できるかを判断するのに役立ちます。
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結果
シロイヌナズナの花粉管破裂に対する受容性シナジイドの核変性のタイミングを評価するとともに、左右のシナジロイドが受容シナジロイドになる運命にあるかどうかを観察するために、ここで説明したSIV兼中隔法を採用し、雌性配偶体核マーカーとシグイド細胞質マーカー(pFG:roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1)をセプタムドナーとし、雄性配偶体マーカー(pLAT52:R-GECO)を花粉ドナーとする。セプタムと受粉した柱頭は、プロトコルのセクション4〜5に従って、去勢の24時間後に解剖され、前日に準備された培地でガラス底皿に置かれました。各皿を顕微鏡上の湿度チャンバーに入れ、5つの概観領域を備えた10倍の対物レンズ(開口数:0.4)を使用して多段階実験を行いました(図3)。各領域の画像は、R-GECO(25ミリ秒)の場合はチャンネル(1)560/640、roGFP2-ORP1(60ミリ秒)の場合はチャンネル(2)488/520、roGFP2-ORP1(60ミリ秒)の場合はチャンネル(3)3...
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ディスカッション
この原稿は、 シロイヌナズナの花粉管受容と二重受精のイメージングのための効率的なプロトコルを紹介します。改良された方法であるSIV cum septumは、イメージングセッションごとに観察可能な花粉管受信イベントの成功率と総数を大幅に増加させます。ここに示す代表的な結果は、41個の花粉管受容イベントが成功し、10個の胚珠が受容障害(~80%効率)を示すイメージングセッションを示しています。これは、元のSIV摘出胚珠法を使用して合計8回のイメージングセッションでキャプチャされた花粉管受容イベントの2倍以上です(ビデオ1)。5回の技術反復でSIV 兼セプタム 法を使用し、合計8回の隔壁で、花粉管の平均受容効率は79%でしたが、SIV切除隔壁法では8回の技術反復で平均28%でした(図4)。
花粉管の受容効率はSIV 兼中隔 法の方がはるかに高いですが、花粉管の異常増殖の例は、いくつかの要因に応じて、さまざまな速度で発生します...
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開示事項
著者らは利益相反を報告していない。
謝辞
pFG:roGFP2-ORP1-NLSコンストラクトを寄贈してくださったSara Simonini氏とStefano Bencivenga氏、顕微鏡に関するアドバイスをくださったChristof Eichenberger氏、Johann Almendinger氏、Vincent Sutter氏、Celia Baroux氏に感謝します。ラヴィ・パラニヴェル、フィリップ・デニンガー、シャロン・ケスラー、マーク・ジョンソン、川島智和、および2022年の有性植物生殖に関する国際会議で、SIV兼セプタムに関するプロトコルに関心を示した他のすべての人からのアドバイスに感謝します。この研究は、チューリッヒ大学とスイス国立科学財団から英国への助成金によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1mmスライドガラス | エプレディア | ||
| 35 mmガラス底皿(14 mm井) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 塩化カルシウム | ロス | CN93.1 | |
| コロンビア (Col-0) | ノッティンガムシロイヌナズナストックセンター(NASC) | 柱頭ドナー | |
| 解剖スコープ | オリンパス | SZX2-ILLT | |
| インスリン針 (0.3 G) | BD | 304000 | |
| ランズベルク エレクタ (Ler-0) | ノッティンガムシロイヌナズナストックセンター(NASC) | セプタムドナー | |
| 硫酸マグネシウム | メルク | 5886 | |
| 塩化カリウム | ロス | 6781.1 | |
| カミソリ刃 | ベルデュラ | 7026797 | |
| スコッチ両面テープ | スコッチ | 768720 | 厚さが少なく、柱頭解剖に適しています |
| 塩化ナトリウム | Roth | 3957.1 | |
| ショ糖 | ITW試薬 | A2211,1000 | |
| テサ両面テープ | テサ | 05681-00018 | 非常に粘着性があり、セプタム解剖に適しています |
| 超低ゲル化温度アガロー | FMC SeaPrep | 50302 |
参考文献
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- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
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- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645(2014).
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- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
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再版と許可
