機器エンジニアリングによる下流の病原体検出のための柑橘類の芽処理の自動化

Summary

師部が豊富な樹皮の柑橘類のつぼみ組織を迅速に処理する機器を設計、製造、検証しました。現在の方法と比較して、バッドウッド組織抽出器(BTE)はサンプルスループットを向上させ、必要な人件費と設備コストを削減しました。

Abstract

ウイルス、ウイロイド、バクテリアなどの柑橘類の移植片伝染性の師部制限病原体は、世界中で壊滅的な流行と深刻な経済的損失の原因となっています。たとえば、柑橘類のトリステザウイルスは世界中で1億本以上の柑橘類の木を殺しましたが、「Candidatus Liberibacter asiaticus」はフロリダに90億ドルの費用をかけました。病原体でテストされた柑橘類の芽を樹木の繁殖に使用することは、そのような病原体の管理にとって重要です。カリフォルニア大学リバーサイド校の柑橘類クローン保護プログラム(CCPP)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを使用して、カリフォルニアの柑橘類を保護し、全米クリーンプラントネットワークにクリーンな繁殖ユニットを提供するために、毎年柑橘類の芽木源の木から数千のサンプルをテストしています。柑橘類ウイルスおよびウイロイドのハイスループット分子検出における深刻なボトルネックは、植物組織処理ステップです。

適切な組織調製は、高品質の核酸の抽出とPCRアッセイにおけるダウンストリーム使用に不可欠です。核酸の分解を避けるために、低温での植物組織の粉砕、計量、凍結乾燥、粉砕、および遠心分離は、時間と労力を要し、高価で特殊な実験装置を必要とします。この論文では、柑橘類の芽から師部に富む樹皮組織を迅速に処理するように設計された、芽木組織抽出器(BTE)と呼ばれる特殊な機器の検証を紹介します。BTEは、現在の方法と比較してサンプルスループットを100%向上させます。さらに、それは人件費と設備のコストを削減します。この研究では、BTEサンプルのDNA収量(80.25 ng / μL)は、CCPPのハンドチョッピングプロトコル(77.84 ng / μL)に匹敵しました。この機器と迅速な植物組織処理プロトコルは、カリフォルニアのいくつかの柑橘類診断研究所とプログラムに利益をもたらし、世界中の他の木本多年生作物の組織処理のモデルシステムになります。

Introduction

ウイロイド、ウイルス、バクテリアなどの柑橘類の移植片伝染性師部制限病原体は、世界のすべての柑橘類生産地域で壊滅的な流行と深刻な経済的損失を引き起こしています。柑橘類のウイロイドは、三葉、三葉の雑種、みかん、クレメンタイン、みかんなどの経済的に重要な柑橘類の種類で引き起こす外皮質と悪液質の病気のために、生産要因を制限しています^1,2,3。カリフォルニアでは、これらのウイロイドに敏感な柑橘類の種類は、皮をむきやすく、セグメント化され、^{種のない果物}に対する消費者の好みの変化傾向に続いて、「イージーピーラー」の成長と収益性の高い市場の基盤となっています4,5,6。したがって、柑橘類のウイロイドは、カリフォルニア州食品農業省(CDFA)の「柑橘類の苗床害虫清浄度プログラム-上院法案140」の下で規制されており、CDFAの植物害虫診断部門の研究所は、毎年何千もの柑橘類のウイロイド検査を実施しています7,8,9,10 .カンキツトリステザウイルス(CTV)は、1930年代の世界的な流行が始まって以来、1億本以上の柑橘類の木の死の原因となっています^3,9,10,11。カリフォルニアでは、ウイルスの茎の孔食と三葉の破壊抵抗分離株が、36億ドルのカリフォルニアの柑橘類産業に深刻な脅威をもたらします12,13,14。その結果、CDFAはCTVを規制されたクラスAの植物害虫として分類し、中央カリフォルニアトリステザ根絶局(CCTEA)の研究所は毎年広範な現地調査と数千のウイルス検査を実施しています^15,16。細菌「Candidatus Liberibacter asiaticus」(CLas)と黄龍峰(HLB)病は、柑橘類の作付面積が40%減少し、柑橘類の操業が57%減少し、約8,000人の雇用が失われた結果、フロリダに90億ドル近くの経済的損害をもたらしたと推定されています^17,18。カリフォルニア州では、HLBによる柑橘類の作付面積の仮想的な20%の減少は、8,200人以上の失業と州の国内総生産の50億ドル以上の減少をもたらすと予測されました。したがって、柑橘類の害虫および疾病予防プログラムは、カリフォルニア^14,17,19,20からのCLaをテスト、検出、および根絶するための調査に年間^4,000万ドル以上を費やしています。

柑橘類のウイロイド、ウイルス、バクテリアの管理の重要な要素は、樹木生産のための病原体テストされた繁殖材料(すなわち、芽木)の使用です。病原体検査済みの柑橘類の芽は、高度な病原体除去および検出技術を採用した包括的な検疫プログラム内で生産および維持されています^10,21。カリフォルニア大学リバーサイド校の柑橘類クローン保護プログラム(CCPP)は、カリフォルニアの柑橘類を保護し、柑橘類の全国クリーンプラントネットワークの機能をサポートするために、州と米国に新たに輸入された柑橘類の品種と柑橘類の芽木源の木から毎年何千もの芽材サンプルをテストしています10,17,22.大量の柑橘類検査を処理するために、ハイスループット、信頼性が高く、費用対効果の高い病原体検出アッセイは、CCPP ^7,10,22などのプログラムの成功のための基本的な要素です。

ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの分子ベースの病原体検出アッセイにより、植物診断ラボのスループットが大幅に向上しましたが、私たちの経験では、ハイスループットプロトコルの実装における最も重要なボトルネックの1つは、植物組織サンプル処理ステップです。これは、葉の葉柄や芽木の樹皮などの師部に富む組織の処理に現在利用可能なプロトコルが労働集約的で時間がかかり、高価で特殊な実験装置を必要とするため、特に柑橘類に当てはまります。これらのプロトコルでは、核酸の分解を避けるために、低温での手切り、計量、凍結乾燥、粉砕、および遠心分離が必要です^8,23,24。たとえば、CCPP診断ラボでは、サンプル処理には、(i)手切り(6〜9サンプル/時間/オペレーター)、(ii)凍結乾燥(16〜24時間)、(iii)粉砕(30〜60秒)、および(iv)遠心分離(1〜2時間)が含まれます。このプロセスには、特殊な消耗品(頑丈な安全ロックチューブ、ステンレス鋼の粉砕ボール、アダプター、ブレード、手袋など)と複数の高価なラボ機器(超低冷凍庫、凍結乾燥機、組織粉砕機、液体窒素凍結、冷蔵遠心分離機など)も必要です。

他の業界と同様に、機器のエンジニアリングとプロセスの自動化は、コストを削減し、スループットを向上させ、高品質で均一な製品とサービスを提供するための鍵です。柑橘類業界では、操作に最小限のスキルしか必要としない低コストの組織処理機器が必要であり、診断ラボやフィールド操作に簡単に転送できるため、下流の病原体を迅速に検出するための高いサンプル処理能力が可能になります。テクノロジーエボリュービングソリューション(TES)とCCPPは、師部に富む柑橘類の組織(すなわち、芽)を迅速に処理するための低コスト(すなわち、特殊な実験装置の必要性を排除した)機器を開発(すなわち、設計および製造)し、検証しました(すなわち、柑橘類のサンプルでテストし、標準的な実験室手順と比較して)、芽木組織抽出器(BTE)と名付けました。 図1に示すように、BTEには、電源と制御用のベースコンポーネントに加えて、柑橘類の芽を処理するための取り外し可能なチャンバーが含まれています。BTEチャンバーは、師部に富む樹皮組織を柑橘類の芽から取り除くために特別に設計された砥石で構成されています。細断された樹皮組織は、スライドポートから抽出バッファーを含むシリンジに迅速に排出され、ろ過され、追加の取り扱いや準備なしで核酸の抽出と精製の準備が整います(図1)。BTEシステムには、ペーパーレスのサンプル追跡アプリケーションと統合された計量アプリケーションも含まれており、サンプル処理情報をオンラインデータベースにリアルタイムで記録します。

BTEシステムは、CCPPのラボ診断能力を100%以上向上させ、PCRアッセイを使用した高品質の核酸の精製と柑橘類の移植片伝染性病原体の下流検出に適した柑橘類組織抽出物を一貫して製造してきました。具体的には、BTEは組織処理の時間をサンプルあたり24時間以上から~3分に短縮し、60,000ドルを超えるラボ機器を置き換え(図2、ステップ2-4)、より大きなサンプルサイズの処理を可能にしました。

この論文では、CCPP Rubidoux Quarantine FacilityとLindcove Foundation Facilityからのすべての適切なポジティブコントロールとネガティブコントロールを含む、ソースツリーからの柑橘類の芽木サンプルを使用したBTEハイスループット柑橘類樹皮組織処理、核酸抽出、および病原体検出検証データを紹介します。また、現在のラボ手順と比較したスループットと処理時間の変化も示します(図2)。さらに、この作業は、柑橘類病原体検査ラボに詳細な段階的なプロトコルを提供し、BTEが病原体クリーンな苗床、調査、および根絶プログラムの機能をどのようにサポートできるかを示しています。

図1:バッドウッド組織抽出器。 BTEには、電源と制御用のベースコンポーネントに加えて、柑橘類の芽を処理するための取り外し可能なチャンバーが含まれています。BTEチャンバーは、師部に富む樹皮組織を柑橘類の芽から取り除くために特別に設計された砥石で構成されています。細断された樹皮組織は、スライドポートからシリンジに迅速に排出され、ろ過され、追加の取り扱いや準備なしで核酸の抽出と精製の準備が整います。略語:BTE =バッドウッド組織抽出器。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:従来のハンドチョッピングラボ手順とBTE処理の段階的な比較。 BTE処理には、ハイスループットの柑橘類樹皮組織処理、核酸抽出、および病原体検出が含まれます。各ステップの時間は括弧内に示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

1.柑橘類のつぼみサンプルを収集して出荷する

1. テクノロジー進化ソリューションにツリー情報のスプレッドシートを送信して、Webサーバーにロードします(最終的には、ユーザーは新しいツリーを作成します)。
2. 電話アプリ TES トラッカー を使用してツリーを選択し、近距離無線通信 (NFC) カラー タグを電話機に保持してツリー情報をタグに読み込みます。
3. 3〜4個の柑橘類のつぼみサンプルをBTE互換のビニール袋キャリアに挿入し、蓋をして閉じます。
   1. つぼみの長さが8インチを超えず、5インチ以上であることを確認してください。
      1. 長さが8インチを超える場合は、滅菌済みの使い捨てかみそりの刃を使用するか、10%漂白剤溶液(1%次亜塩素酸ナトリウム)で除染した剪定ばさみを使用して短くします。
      2. 長さが5インチ未満の場合は、別のつぼみのサンプルを収集してバッグに入れます。
   2. 腋窩の成長や大きなとげは、手で、または10%の漂白消毒された切削工具(1%次亜塩素酸ナトリウム)を使用して除去するようにしてください。
      注意: このステップは、つぼみがチャンバーの開口部で操作しやすくするために重要です。
   3. 湾曲した特徴を持つつぼみのサンプルがないことを確認してください。その場合は、10%漂白消毒切削工具(1%次亜塩素酸ナトリウム)を使用してそれらを取り除き、サンプルのまっすぐな部分のみをBTEバッグに入れます。
      注意: 湾曲したつぼみは、機器への操作が非常に難しく、樹皮の縞模様が不均一になります。
4. 電話アプリの TESトラッカー を使用して、ツリーのNFCカラータグをスキャンし、サンプルバッグのNFCクリップタグにリンクします。
5. オペレーターがBTEチャンバー内の師部に富んだ芽木の樹皮をどのように剥がすかを決定するため、芽の木の厚さに注意してください。
   1. つぼみの厚さが0.20インチ未満の場合、チャンバー内の高速回転糸が芽木全体を樹皮層を超えて師部に富む木と髄の組織に粉砕するため、つぼみを剥がすときは注意してください。
   2. 師部が豊富でない芽木の組織を避けながら樹皮組織を剥がす方が簡単であるため、より厚い芽木を選択してください。
6. サンプルをいくつかのアイスパックを備えた断熱輸送コンテナに入れます。

2.ドラフト内のセットアップ

注意: BTEはドラフト内で操作することをお勧めします。これにより、植物組織の相互汚染や実験室汚染のリスクが軽減されます。

1. 10%(1%次亜塩素酸ナトリウム)スプレーボトルを使用して消毒します。
   1. フードの表面にスプレーし、漂白剤を約1分間放置してから、ペーパータオルで拭きます。
   2. ペーパータオルに漂白剤溶液をスプレーします。TE ベース、重量計コンポーネント (はかり、エア シールド、タワー)、およびマーカー ペンを拭きます。
2. 処理するサンプル数分のシリンジセットを開梱し、蓋付きの段ボール箱に入れます。
3. 必要に応じて、フードの外側に綿棒のパックを用意してください。
4. 体重計を準備します。
   1. ウェイトタワーをはかりから取り外し、電源ボタンを押したままにして電源を入れます。スケールが0を表示した後、スケールの中央にタワーを配置します。
   2. 重量計のエアシールドをはかりの前面にスライドさせます。
5. 背面のスイッチを切り替えて、組織抽出ベースを準備します。ボックスの左側にあるスイッチが上部で押されていることを確認します。チャンバーの準備ができていることを示す緑色のLEDが点滅するのを待ちます。

3.クリーニングステーションをセットアップします(補足図S1)。

1. 超音波洗浄機に1Lの水を入れます。
2. 超音波洗浄機の上部に2つのゴミ袋を巻きます。
3. 10%漂白剤(1%次亜塩素酸ナトリウム溶液)を超音波洗浄機に~5L注ぎます。
4. チャンバーを沈めるのに十分な水で水槽を満たします。
5. エアコンプレッサーをオンにしてバルブを開きます。
6. チャンバーの乾燥中に液体をキャッチするように背景を設定します。

4.柑橘類のつぼみ樹皮ストリッピング用のBTEの材料の処理

1. チャンバーをBTEベースにロードします。
   1. BTEチャンバーを準備します。
      1. 空のサンプルバッグをチャンバーの背面に取り付けます。2つのOリングを使用して、空のバッグをBTEチャンバーのバックノズルに固定します。
      2. ブレードに摩耗や損傷の兆候がないか調べます(ブレードがプラスチックに続くところに切り傷が形成されている、または先端に切り傷が形成されているなど)。ブレードの矢印が単一のロック記号と一致していることを確認します。
      3. チャンバーの底部の空気放出が O 記号に向かっていることを確認します。チャンバーの開口部に透明な蓋を置き、チャンバーの右側のトラックを使用して透明なBTEスライドをチャンバーにスライドさせます。チャンバーの下部にあるロックをスライドに入ることができる限り押します。プランジャーキャップがスライドの上部に取り付けられていることを確認します。
   2. BTEベースのノズルをチャンバーの背面に突き出させて、チャンバーをBTEベースに置きます。青いLEDが点滅して、配置が成功したことを示すのを待ちます。
2. NFCクリップタグの白いステッカーをボックスの右側のZに移動して、サンプルをBTEベースにロードします。黄色のライトが点滅し始めるまで、Z上でゆっくりと円を描くようにタグを動かします。サンプルをBTEベースに取り付け、サンプルバッグに穴がないことを確認します。穴がある場合は、テープでパッチを当てます。Oリングをサンプルバッグの上に置き、BTEノズルの前面に固定します。
3. 未使用のシリンジセットをロードします。
   1. シリンジセットを風袋引きします。未使用のシリンジセットを計量スケールタワーに置きます。赤いライトが点滅し始めたとき、またはスケールに0が表示されたら、シリンジセットを取り外します。
   2. フィルター付きのシリンジからプランジャーを取り外します。液体がボトム(非フィルター)シリンジに入っていることを確認します。プランジャーをペーパータオルの上、または黒いプランジャーが表面に触れていないタワーの上に置きます。
   3. 出口ポートをシリンジに押し込み、90°回転させて、シリンジをスライド出口ポートに取り付けます。
4. つぼみのサンプルを処理します。
   注意: BTEには高速可動部品があります。すべての操作はドラフト内で行う必要があります。すべてのユーザーは、保護眼鏡、イヤーマフ(耳栓)、および手袋や白衣などの他のすべての個人用保護具(PPE)を使用する必要があります。
   1. 上部の黒いボタンを押して、マシンを起動します。もう一度押すと、処理中いつでもモーターが停止します。
      注意: ボックスには速度と温度の検知機能があり、正しく機能することを確認します。
   2. バッグを通して1本のバッドウッドスティックをつかみ、BTEノズル の上部 に通します。
   3. もう一方の手でチャンバーの反対側にあるつぼみの棒をつかみ、ゆっくりとブレードにインチダウンします。つぼみが樹皮から剥ぎ取られていることを示す穏やかなブーンという音を聞いてください。つぼみを回転させながらゆっくりと前後に動かします。
      1. 大きくて攻撃的なチョッピング音が聞こえる場合は、ブランチをすばやく一番上に移動するか、トップボタンを押してモーターを停止します。モーターを停止するには、右側のスイッチを使用して処理を終了します(手順4.4.3.2を参照)。
      2. 切断時に出口から材料が出ていない場合は、チャンバーに詰まりがあります。モーターの電源を切り、スライドプランジャーキャップを取り外し、綿棒のプラスチックを使用して詰まりを機械の出口から押し出します。右側のスイッチを使用して処理を終了します:上=前方切断。中央=モーターオフ。ダウン=逆カット。
   4. 残りのブランチに対して手順 4.4.2 と手順 4.4.3 を繰り返します。
      注意: 十分な芽木の樹皮が剥がれたことを示す一般的な指標は、注射器の25%が植物組織で満たされたときです。柑橘類の移植片伝染性病原体は、木に不均一に分布している可能性があります。そのため、柑橘類の樹冠周辺から3〜4本の芽木サンプルが採取されます。BTEキャリーバッグ内のすべてのバッドウッドサンプルが最終的な粉砕組織サンプルに寄与し、完全な樹木代表サンプルが病原体についてテストされることを確認することが重要です。
   5. 上部の黒いボタンを押して処理を停止します。ライトが再び黄色に点滅し始めるのを待ちます。
5. サンプルの重量を確認します。
   1. シリンジを90°回転させ、引き下げて取り外します。プランジャーをシリンジに戻し、シリンジをタワーに置きます。
   2. スケールがサンプルを自動検出するのを待ち、適切な重量範囲(0.25 ± 0.05 g)内にあるかどうかを判断します。サンプル重量が低すぎる(<0.20 g)場合は、ステップ4.4を繰り返します。赤いLEDが点滅し始めます。サンプルの重量が高すぎる(>0.30 g)場合は、サンプル材料の一部を取り除きます。黄色のLEDがゆっくり点滅し始めます。サンプルが範囲内にある場合、緑色のLEDが点滅し始めます。
6. 芽木サンプルの均質化
   1. サンプルの入ったシリンジからプランジャーを取り外し、サンプルと一緒にシリンジに液体を押し込み、プランジャーを再度追加します。プランジャーは、バッファーと植物樹液をメッシュフィルター(大きな樹皮組織片を差し控える)とゴムチューブ を介して 空のシリンジに押し込みます。
   2. バッファーと植物樹液を一方のシリンジからもう一方のシリンジに前後に押してサンプルを混合します。~3x-4xを繰り返し、サンプルが均質な緑色の液体混合物になるまで繰り返します。
   3. 十分に均質化されたら、メッシュフィルターなしで植物樹液サンプルをシリンジに押し込み、ゴムチューブとフィルター付きシリンジをサンプル付きのシリンジから取り外します。
   4. 植物樹液サンプルをシリンジから2 mL滅菌マイクロ遠心チューブに排出し、さらに使用するまで-20°Cで保存します。永久マーカーを使用して、サンプルにバッグ番号のラベルを付けます。
      注:ステップ4.6.5の植物サンプル樹液は、利用可能な核酸、RNAまたはDNA、フェノール-クロロホルム、シリカカラム、または磁気ビーズ9,25,26,27に基づく抽出方法のいずれかで処理できるようになりました核酸抽出および精製(ステップ7を参照)および柑橘類の移植片伝染性病原体の下流検出(ステップ8を参照)。

5. BTEリムーバブルチャンバーの消毒

注意: シリンジセットのバッファーがチャンバーまたはスライドに付着した場合は、すすぎ、実験室のすべての安全規則に従って清掃してください。シリンジセットにはチオシアン酸グアニジンが含まれています。シリンジセットのバッファーが漂白剤と接触すると、シアン化物ガスが発生します。

1. 10番目のサンプルがチャンバー内で処理された後、次の手順を実行します。緑色のLEDは青色の点滅に移動するのではなく、点滅し続けることに注意してください。
2. BTEチャンバーを分解して、考えられるすべての汚染物質を洗浄します。透明なプラスチックカバーを取り外し、チャンバースライドを片付け、チャンバースライドの詰まりポートを外します。
3. チャンバー底部のエアリリースバルブを開いた位置に回します(南京錠のマークが開いています)。チャンバーコンポーネントをセットアップ超音波洗浄機に配置します(手順3.1を参照)。チャンバーが浮かないように、チャンバーの下に蓋を置きます。超音波洗浄機を15分間実行します。
   注意: 超音波洗浄槽(5 L)は、最大2つのチャンバーを保持できます。
4. チャンバーコンポーネントを水浴(ステップ3.4)で少なくとも30秒間すすぎます。チャンバーコンポーネントを乾燥ステーションに移動します。
   注意: 乾燥すると、チャンバー内の部品の動きが速くなり、大きな音(~85デシベル[dB])、および飛散する可能性があります。すべてのユーザーは、手術室の安全規則で義務付けられている保護眼鏡、イヤーマフ(耳栓)、白衣、およびその他すべてのPPEを使用する必要があります。
5. BTEチャンバーを乾燥させます。
   1. エアガンをチャンバーの上部開口部の溝(通常はスライドがある場所)に沿って配置します。ガンの引き金を押して、~30秒間空気を分配します。
      注意: 開口部がユーザーから背景に向かって離れていることを確認してください。これにより、ブレードセットが回転して、その下に閉じ込められた液体が除去されます。
   2. エアガンをチャンバーの上部ノズルに向けて配置します。エアガンのトリガーを押し、各ノズル入口の3つの完全な円をゆっくりとトレースします。
   3. エアガンをBTEの中央に配置します。最も内側のポイントから開始して、トリガーを押したまま、エアガンがスライドがある場所を指すまで移動します。
   4. チャンバー全体を前後にすばやく空気を流して、表面の水を外部から取り除きます。
6. BTE スライドを乾かします。
   1. エアガンをスライドのプランジャースロットに配置し、トリガーを押してスライド出口から水を排出します。
   2. スライドの内面に沿ってエアガンを走らせて乾かします。
   3. スライド溝に沿ってエアガンを走らせて水を押し出します。
   4. 外装全体にすばやく空気を流して、地表水を取り除きます。
7. コンポーネントを乾燥させます。
   1. スライドプランジャーキャップとOリングを手に持ち、トリガーを押します。
   2. 蓋の内面にエアガンをかぶせます。
   3. コンポーネントをチャンバーに入れ、スライドさせて乾燥を続けるか、再組み立てします。
      注:複数の機能的なBTEを備えた高組織処理環境では、10個のチャンバーを同時に除染できるバッチ消毒システムを提供できます。

6.廃棄と消毒

1. シリンジとゴムチューブは、指定されたグアニジン廃棄物容器に廃棄してください。
2. バイオハザード廃棄物容器内の植物材料を廃棄してください。
3. BTEチャンバーをBTEベースから取り外します。
4. BTEチャンバーを分解し、手順5の説明に従って除染に進みます。

7.BTE柑橘類の芽木抽出物から精製されたRNAの組織処理と品質の評価

注:このプロトコルでは、255本の柑橘類の木からの芽木サンプルを使用して、柑橘類の芽木の組織処理に必要な時間と、BTEによって調製された樹皮組織抽出物から精製されたRNAの品質(図2、右側、ステップ1、ステップ5、およびステップ6)を、手の皮むきと切り刻みを利用する規制で承認された柑橘類のつぼみ組織処理法に従って調製したものと比較しました。 バーク組織の凍結乾燥、粉砕、および遠心分離は、Dangら²³ によって記載されている(図2、左側、ステップ1〜6)。

1. 現在の実験室手順:規制で承認された方法²³に従って、組織処理用の芽木サンプルを準備します。
   1. Dangら²³ (図2、左側、ステップ1〜6)に記載されているように、樹皮組織の手剥離および細断、凍結乾燥、粉砕、遠心分離、および植物液のRNA抽出チューブへの移し替えを行う(図2、左側、ステップ1〜6)。
   2. テストした各木から3〜4本の芽木サンプルを手で剥がした後、すべての芽木をBTE互換のビニール袋キャリアに入れ、BTE処理まで4°Cで保管します(ステップ7.2)。
2. BTE手順:BTE柑橘類のつぼみ組織の処理を開始します(セクション4、ステップ4.1〜4.6; 図2、右側、ステップ1、ステップ5、およびステップ6)。
   1. ステップ7.1.2のBTEキャリーバッグ内に保管されているバッドウッドサンプルを使用します。
3. 規制で承認された半自動磁気ビーズベースの方法8,23,28を使用して、現在の実験室手順(ステップ7.1.1)およびBTE手順(ステップ7.2.2)から得られた植物樹液からRNAを抽出して精製します。
4. RNAの濃度、純度、完全性を測定することにより、RNAの品質を評価します8,23,24,29,3 ^3,31。
   1. 濃度を計算するには、波長260 nmでの分光光度法と光学密度(OD)を使用します。
   2. 純度を評価するには、260/280の分光光度OD比を使用します。
   3. 完全性をチェックするには、NADHデヒドロゲナーゼシトラス遺伝子^24,32のmRNAを標的とする逆転写(RT)定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)反応を使用します。

8. BTE柑橘類の芽木抽出物から精製したRNAを用いた柑橘類ウイルスとウイロイドの交差汚染と検出の評価

注:このプロトコルでは、72本の非感染柑橘類の木とウイルスとウイロイドに混合感染した1本の木の芽木サンプルを使用して、BTEで処理した場合のサンプル間の相互汚染の可能性(図2、右側、ステップ1、ステップ5、およびステップ6)と、柑橘類ウイルスおよびウイロイドのRT-qPCR検出のテンプレートとして使用するBTEによって調製された樹皮組織抽出物から精製されたRNAの適合性を評価しました。

1. 最初のBTEサンプル処理:72の非感染サンプルでベースライン実験を実施します。
   1. 3つの(A-C)BTEチャンバーを準備します(ステップ4.1.1)。
   2. すべての非感染柑橘類芽サンプル(1-72)をBTEキャリーバッグで準備し、2シリンジBTEサンプル収集システムで、各サンプルに1つのシリンジシステムで同数(72)を準備します(ステップ2.4)。
   3. サンプルキャリーバッグとサンプル収集シリンジを、それぞれ12サンプルの6つのバッチ(I-VI)に分けます。
   4. 以下のシーケンス(ステップ8.1.4.1-8.1.4.6)に従って、BTE柑橘類のつぼみ組織処理(ステップ4)を開始します( 表1、最初のBTEサンプル処理を参照)。
      1. バッチI/サンプル1〜12の場合、チャンバーAを使用して12サンプルを処理し、サンプル12の後にチャンバーAを消毒します(ステップ5)。
      2. バッチII/サンプル13〜24の場合、チャンバーBを使用して12サンプルを処理し、サンプル24の後にチャンバーBを消毒します(ステップ5)。
      3. バッチIII/サンプル25-36の場合、チャンバーCを使用して12サンプルを処理し、サンプル36の後にチャンバーCを消毒します(ステップ5)。
      4. バッチIV /サンプル37〜48の場合、消毒チャンバーAを使用して12サンプルを処理します(ステップ8.1.4.1)。
      5. バッチV /サンプル49--60の場合、消毒チャンバーBを使用して12サンプルを処理します(ステップ8.1.4.2)。
      6. バッチVI /サンプル60〜72の場合、消毒チャンバーCを使用して12サンプルを処理します(ステップ8.1.4.3)。
   5. すべてのサンプルが入ったBTEキャリーバッグは、ステップ8.2で使用するまで4°Cで保管してください。
   6. ステップ8.1.4.1-8.1.4.6で生成された72個の植物樹液サンプルから、規制で承認された半自動磁気ビーズベースの方法^8,23,28を使用してRNAを抽出し、精製します。
   7. 前述の^ように、柑橘類ウイルスおよびウイロイドの検出のためにRT-qPCRを行う8^、33。
2. 2回目のBTEサンプル処理では、70個の非感染サンプルと2個の混合感染サンプルでクロスコンタミネーション実験を実行します。
   1. 3つの(A-C)BTEチャンバーを準備します(ステップ4.1.1)。
   2. 混合感染した柑橘類のつぼみサンプル(73)を2つのBTEキャリーバッグ(ステップ1.3)に入れて、合計2つの感染サンプルを調製します。
   3. サンプル3-バッチIとサンプル51-バッチV(ステップ8.2.4のサンプル交換を参照)を除く、ステップ8.1.5の非感染柑橘類の芽のサンプルを含むBTEキャリーバッグを収集し、感染していないサンプルの総数70個を収集します。
   4. バッチIのサンプル3の代わりに混合感染サンプル73を入れた最初のBTEキャリーバッグと、バッチVのサンプル51の代わりに2番目のBTEキャリーバッグを含めて、合計72サンプルにします。
   5. 2シリンジBTEサンプル収集システムに同数(72)を準備し、各サンプルに1つのダブルシリンジシステムを用意します(ステップ2.4)。
   6. 72個のサンプルキャリアバッグとサンプル収集シリンジを、それぞれ12サンプルの6つのバッチ(I-VI)に分けます。
   7. 手順 8.1.4.1-8.1.4.6 と同じ手順に従って、BTE 柑橘類のつぼみ組織の処理 (手順 4) を開始します。
      注:唯一の違いは、バッチIのサンプル3とバッチVのサンプル51を感染したサンプル73に置き換えることです(ステップ8.2.4)(表1、2番目のBTEサンプル処理)。
   8. ステップ8.1.6と同様に、ステップ8.2.7で生成された72個の植物樹液サンプルからRNAを抽出して精製します。
   9. ステップ8.1.7のように、柑橘類のウイルスとウイロイドの検出のためにRT-qPCRを実行します。

Results

BTE処理した柑橘類組織を用いたRNA抽出・精製・品質および組織処理時間の評価
このテストでは、255本の代表的な柑橘類の木の芽木サンプルを使用して、BTEのRNA品質と標準的な手順を比較しました。サンプルは、バッドウッド組織抽出器(BTE)(プロトコルステップ4.1〜4.6および 図2、右側、ステップ1、ステップ5、およびステップ6)によって処理されるか、Dangらによって説明されているように、樹皮組織の手の剥離およびチョッピング、凍結乾燥、粉砕、および遠心分離を利用する規制的に承認された柑橘類のつぼみ組織処理方法に従って調製された²³(図2、 左側、ステップ1〜6)。

BTEと柑橘類組織処理のための従来の手切りおよび実験装置プロトコルとを並べて比較したところ、抽出された核酸の品質(すなわち、濃度、純度、および完全性)(図3A-C

Discussion

HLB柑橘類病の出現により、損失を減らすために、柑橘類産業、規制当局、および診断研究所は、病気管理の実践と組み合わせて、個々の樹木の検査のために、低スループットの手動サンプル処理およびqPCR³⁴ などの病原体検出アッセイと組み合わせたハイスループット核酸抽出法に依存するように促されています³⁵.カリフォルニア州のHLB陽性率は、2012年の0.01%から2020年には1.2%になりました。qPCRは強力で信頼性の高い病原体検出ツールですが、現在利用可能な技術では十分な量の植物組織をサンプリングして処理することができず、カリフォルニアの柑橘類の木のCLasの明確なアンダーサンプリングとアンダーテストが発生します。アンダーサンプリングとアンダーテストは、テストされた木の数と処理される木あたりの植物材料の量(つまり、葉の数)の両方に関連して発生し、樹冠内の感染した葉の散発的な分布のために、早期または軽度の感染を見逃す可能性が高くなります。サンプリングとCLasテストの現在の方法は、コスト(人件費や設備など)のために需要の増加に合わせて拡張できませ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08インチ六角トリマーライン	PowerCare	FPRO07065	ブレードの交換が必要です。
1 Hp、8 gal 空気圧縮機	カリフォルニア エア ツール	8010	すぎた後、チャンバーをすばやく乾燥させます
1.5 mL 微量遠心チューブ	グローブ サイエンティフィック	111558B	syinges
10 mL シリンジ セット	テクノロジー 進化するソリューション	TE006-F1-10A-G1000-E1	シリンジの材料をカットします。グアニジンチオシアン酸緩衝液入り1Lボトル。警告 - グアニジンチオシアン酸塩、必要な有害廃棄物サービスが含まれています - 漂白剤12
"定規	Westcott	&lrmと混合しないでください。16012
12% 次亜塩素酸ナトリウム	Hasa	1041	処理後にチャンバーを消毒します
-20 C 冷凍庫	記章	NS-CZ70WH0	処理後のサンプルを保管
4インチ x 12インチ ビニール袋	Plymor	FP20-4x12-10	輸送中に枝を保持するための袋。Oリングは、詰ま
りを除去するために	6インチの綿	ピューリタン	806-PCL
7ガロン収納トート	HDX	206152	次亜塩素酸ナトリウム溶液を保持してチャンバーを消毒し、チャンバーをすすぐための水
エアブローガン	JASTIND	‎JTABG103A	でチャンバーに空気を導き
ブラックシャーピー	シャーピー	S-19421	1.5 mLチューブをマークして、後でサンプルを識別できるようにします
ボトルトップディスペンサー	ブランド	Z627569	グアンジンをシリンジに分配するための調整可能なボトルトップディスペンサー
BTEチャンバー	技術 進化するソリューション	TE002BB-A05-E1	つぼみの処理に使用されます。Oリング、BTEスライド、スライドプランジャー、ドレンバルブ、蓋、ブレードセット、ブレードセット取り外しツールが含まれています
ディッシュソープ	ドーン	57445CT	次亜塩素酸ナトリウムのチャンバーへの浸透を改善するためのサーフェクト
HEPAフィルター付きヒュームフード	エアサイエンス	P5-36XT-A	HEPAフィルター付きヒュームフード(ASTS-030)  可能な汚染を制限し、化学物質のこぼれから保護する
断熱フォーム輸送コンテナ	PolarTech	261/J50C	サンプルを採取した後、氷上で輸送するための断熱輸送用コンテナ
ラボコート	レッドカップ	KP14WH LN 46	ラボコートにより、汚染の可能性を制限し、化学物質の流出から保護する
ノートパソコン	Microsoft	Surface	Wifi対応のノートパソコンでTES GUIを実行可能。初期設定に必要で、組織処理ベースに関するより詳細な情報を提供します
NFC対応電話	サムスン	ギャラクシーS9	電話をダウンロードして使用するために TES電話アプリ NFC
クリップタグ	テクノロジー進化ソリューション	TE005-Clip-E1	ツリーにリンクできるサンプルタグ。TES電話アプリ
NFCカラータグ	テクノロジー進化ソリューション	TE005-Collar-E1	ツリーに取り付けられています。TES電話アプリで機能するように作られています
ニトリルグローブ	Usa Scientific	3915-4400	手袋 汚染の可能性を制限し、化学物質の流出から保護する
ノイズリダクションイヤーマフ	3M	90565-4DC-PS	エアコンプレッサーとティッシュ処理ベースを操作しながら耳を保護します
ポリウレタン反動エアホース	FYPower	‎510019	コンプレッサーにエアガンを取り付けます
安全なメガネ	Solidwork	SW8329-US	化学的および物理的な危険から目を保護します
スプレーボトル	JohnBee	B08QM81BJV	表面を分解するためのスプレー漂白剤
ティッシュエクストラクタ ベース	テクノロジー 進化するソリューション	TE001-A-E1	植物組織を処理するシステム。機能するにはBTEまたはLTEチャンバーが必要です。電源ケーブル、ブレードアダプター、8/32インチ六角レンチが含まれています
ティッシュプロセッシングベースウェイトスケール	テクノロジー 進化するソリューション	TE003-A05-200g-01-E1	200g、0.01解像度のウェイトスケールは、ティッシュプロセッシングベースに接続して重量範囲を強化したり、サンプルとウェイトをリンクしたりします。スケール、電源ケーブル、接続ケーブル、5mlシリンジホルダー、タワーエアシールドが含まれています
バーミキュライト	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	を使用して有害廃棄物(グアニジンチオシアン酸塩)を輸送するために必要。
		BOWC-06002-トリ	マーラインをカットするUSワイヤーカッター