In vitroモデルとしての新生児蝸牛外植片全体

サマリー

現在のプロトコールは、以前のプロトコールを更新し、高品質の蝸牛外植片を培養するための比較的簡単なアプローチを取り入れています。これにより、生細胞および固定細胞における信頼性の高いデータ取得と高解像度イメージングが可能になります。このプロトコルは内耳の細胞を調査することの進行中の傾向を支える。

要約

難聴を治療せずにいると、世界の医療システムに多大なコストがかかり、個人の生活の質が損なわれます。感音難聴は、蝸牛の感覚有毛細胞と聴神経の累積的かつ不可逆的な喪失を特徴としています。蝸牛外植片全体および重要な蝸牛外植片は、有毛細胞の喪失を検出し、内耳細胞の分子メカニズムを特徴付けるための聴覚研究における基本的なツールの1つです。何年も前に、新生児の人工内耳隔離のプロトコルが開発され、時間の経過とともに変更されましたが、まだ改善の余地があります。

この論文では、蝸牛の全長にわたる有毛細胞とらせん状神経節ニューロン細胞の研究を可能にする、新生児の蝸牛外植片全体をマルチウェル培養チャンバーで単離および培養するための最適化されたプロトコルを紹介します。このプロトコルは、マウスおよびラットの蝸牛外植片を用いて試験されました。有毛細胞、らせん神経節ニューロン細胞、および周囲の支持細胞間の相互作用を研究するために、健康な蝸牛外植片を取得しました。

この方法の主な利点の1つは、外植片の品質を損なうことなく臓器培養ステップを簡素化できることです。コルチの器官の3つの回転はすべてチャンバーの底に取り付けられており、 in vitro 実験と外植片の包括的な分析を容易にします。本稿では、生体外植片と固定外植片を用いたさまざまな実験から得られた蝸牛画像の例をいくつか紹介し、外植片が耳毒性薬に曝露されてもその構造を保持していることを実証する。この最適化されたプロトコルは、哺乳類の蝸牛の統合分析に広く使用できます。

概要

感音難聴のほとんどの症例は、感覚有毛細胞、聴覚神経細胞、および/または聴覚シナプスの変性^{によるものです1。}感覚細胞におけるこの変性過程は進行性であり、通常は不可逆的であり、したがって難聴を引き起こします²。したがって、ストレス条件下での感覚細胞の生存率とシグナル伝達経路の変化に関する情報は、細胞を損傷、ひいては損失から保護するために極めて重要です。培養中の蝸牛外植片の検査により、組織複合体の再現と正常な細胞間ネットワークの維持が可能になり、シグナル伝達プロセスのより良い説明が可能になります。耳毒性の実験モデルを確立するために、抗生物質ゲンタマイシンと化学療法剤シスプラチンは、耳毒性の副作用があることが知られているため、しばしば使用され^{てきました3。}

蝸牛外植片のin vitro培養システムは、時間の経過とともに開発され、変更されてきました。しかし、蝸牛外植片全体の培養に関する段階的プロトコールの記述は、いくつかの出版物で欠落していることがよくあります。Cortiのマウス器官の初代培養のための最初のビデオプロトコルの1つがParkerらによって発表され、著者らは感覚上皮の単離、ガラスカバーガラスでの培養、およびトランスフェクション実験のための外植片のエレクトロポレーションの手順を^{説明しました4。}ガラス製のカバーガラスを使用した別のプロトコルも以前に発表されており、内耳の細胞構造の構成^{が考慮されていました}5。コルチ器官および前庭器官のマウス外植片の培養にミリセル膜を使用する代替^{プロトコルが報告されています}6。これらのビデオレポートは、メソッドの高度化に貢献していますが、解決すべき課題がまだ残っています。ガラス製のカバーガラスやインサートの使用から生じる多くの問題に対処するために、本プロトコルは、臓器培養のステップを合理化し、信頼性の高いデータを得るために高品質の臓器を培養することを目的としています。これは、実験手順中の臓器の直接的な取り扱いを最小限に抑え、生細胞と固定細胞の高解像度画像を取得する前に臓器の移植を回避することで達成されます。

現在のプロトコルは前に出版された生体外の文化システムを更新し、文化条件およびそれ以上の分析を改善するための新しいスライドの部屋の統合と同様、Cortiの器官の隔離および文化部屋への移動の複数の最適化をもたらす。この最適化されたプロトコルは、培地交換中または^{さらなる分析のために}カバーガラスまたはメンブレンから臓器を移送する際に発生する可能性のある臓器の損傷のリスクを軽減します4,5,6。ガラス製のカバーガラスは、プラスチック製のカバーガラスよりも反射率が優れています。ただし、壊れやすく、壊れやすくなります。ここで使用するマルチウェルチャンバーは、顕微鏡スライドに取り付けられており、臓器培養や高解像度イメージングに適しています。孤立した臓器の移送は、以前に推奨された^4,5,6のようにピペットで力を加えるのではなく、臓器を正しい方向に持っていき、チャンバーにスライドさせることを可能にするスパチュラで行われます。

ポリ-D-リジンでコーティングされたマルチウェルチャンバーは、十分な培地を含み^{、前述のように}、接着圧力をかけることなく、臓器の重なりを避けながら、臓器の移植と外植片の適切な配置を容易にします6。さらに、偶発的な臓器の重なりや不均一な構造は、共焦点Zスタックを使用して解決されます。このプロトコルは、マウスやラットの外植片、コルチや蝸牛の器官の外植片、血清含有および無血清培地での培養、耳毒性評価、一般的な薬物反応実験など、さまざまな用途に最適化されています。蝸牛外植片は、カバーガラス底部を備えたチャンバーに装着およびインキュベートされるため、in vitro 実験、外来植物の後処理、および生きた蝸牛外植片および固定された蝸牛外植片のイメージング中に最適な取り扱いのために、蝸牛外植片のチャンバーへの接着が容易になります。コルチの臓器の全長の視覚化と有毛細胞の定量化が合理化されます。さらに、支持細胞、螺旋神経節ニューロン細胞、および神経突起の評価は正確です。従って、このプロトコルは哺乳類の蝸牛のセルの広範囲の分析に使用することができる。

プロトコル

すべての動物の処置は、スイスのバーゼル市の動物福祉委員会のガイドラインと規制に従って行われました。実験には、出生後のC57BL/6JRマウス、Wistarラット、およびSTAT1欠損マウス(C57BL/6-129/SvEvの混合)7(3-5日齢)^と 雌雄のマウスを使用しました。

1. マルチウェルチャンバーのコーティング

1. 完全な培地を準備します。
   1. コルチ外植片の器官には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、10%ウシ胎児血清(FBS)、25 mM HEPES、および30 U/mLペニシリンを含む培地を調製します。
   2. コルチ外植片および蝸牛外植片の臓器には、DMEM/F12、N2サプリメント1個、抗酸化物質を除いたB271個、およびペニシリン30 U/mLを含む培地を調製します。
2. 層流フード内で5 mgのポリ-D-リジンに10 mLの細胞培養水を加えて、ポリ-D-リジンのストック溶液を調製します。ポリ-D-リジンの最終濃度は0.5 mg/mLです。
   注:残りの原液を分注し、-20°Cで保存します。
   1. 原液を滅菌水で1:10に希釈して、ポリ-D-リジンの作業溶液を調製します。
3. 8ウェルチャンバーに150 μL/ウェルのポリ-D-リジンワーキング溶液をコーティングし、室温で30分間インキュベートします。
   注:4ウェルチャンバーを使用する場合は、300 μL/ウェルのポリ-D-リジンワーキング溶液でコーティングします。
4. 真空またはピペッティングで溶液を吸引します。
5. 200 μLの滅菌水で2回洗浄し、200 μLの完全培地またはDMEMで1回洗浄します。
6. 各ウェルに150μLの完全培地を添加します。
   注:4ウェルチャンバーを使用する場合は、250 μL/ウェルの完全培地を添加します。
7. チャンバーを37°C、5%_CO2 のインキュベーターに少なくとも30分間置いてから、外植片を配置します。

2.側頭骨の解剖

1. 手術台を70%エタノールで消毒し、ガラス製の微小球滅菌器ですべての器具を滅菌します。
2. 滅菌した60mmシャーレを氷の入ったバケツに置きます。
3. 数ミリリットルの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を注ぎ、氷上に保管します。
   注:細菌汚染を避けるために、1x PBSに30 U/mLのペニシリンを使用してください。
4. 滅菌パッドを滅菌トレイに置き、操作ハサミで子犬の動物の首をすばやく切り落とします。汚染が頻繁に発生する場合は、ヘッドを70%エタノールに5秒間浸します。
   注:このプロトコルは、P3〜P5の年齢のマウスおよびラットでテストされました。蝸牛組織は、高齢のマウスやラットから解剖するのが難しく、培養中の外植片の生存は限られています。
5. 動物の頭を滅菌パッドの上に置きます。下顎骨を取り除きます。皮膚を持ち上げ、頭蓋骨から剥がします。
6. 鉗子を眼窩腔に配置して頭蓋骨を保持します。
7. 矢状縫合糸に沿って頭蓋骨を慎重に切断し、蝸牛を傷つけることなく鋭利なメスの刃で冠状縫合糸領域を切断します。
   注意: 無理な圧力をかけたり、メスで前後に動かしたりすると、蝸牛の骨、ひいては蝸牛管が損傷する可能性があるため、避けてください。
8. 2つの頭蓋骨の半分から脳を慎重に取り除きます。
9. 頭蓋骨の半分を、ステップ2.3で調製した氷冷PBSを入れた60mmのシャーレに移します。

3.蝸牛の分離

1. 顕微鏡下で側頭骨の蝸牛を局在化させます。鉗子を上半規管に入れます。
2. インスリン注射器(マウス)または鉗子(ラット)を使用して、蝸牛と側頭骨の間の周囲の組織を緩めます。
3. 側頭骨を慎重に蝸牛から引き離し、蝸牛を側頭骨で前庭に取り付けたままにします。側頭骨を脇に押し出す前に、蝸牛が周囲の組織から自由であることを確認してください。
   注意: 力を入れすぎると、蝸牛管が損傷します。
4. 蝸牛を固定位置に保持し、もう一方の手で軟骨性蝸牛カプセルを慎重に取り出します。鉗子の先端を頂点領域またはターンの間(白い線で見える)に慎重に挿入し、カプセルを少しずつ取り外します。蝸牛管を露出させます。
5. 鉗子を蝸牛の下に慎重に置き、前庭器官と側頭骨から取り外します。
6. 蝸牛を氷冷PBSを含む新しい60mmディッシュに移します。
7. 顕微鏡の倍率を調整して、外植片をよりよく視覚化します。
8. コルチ外植片の器官については、次の手順に従います。
   1. 鉗子で臓器を基部に保持します。蝸牛管を鉗子でつかんで、基底フック領域を静かに取り外します。
   2. 蝸牛管を引き裂かずに、蝸牛管から巻き戻します。
   3. 線条血管筋のあるらせん靭帯を、臓器の根元を持って引き離して慎重に取り除きます。
      注:組織の分離は、ベース領域の代わりに頂点領域を保持することによっても達成できます。これは、ラットの臓器や高齢のマウスの仔マウス(>P5)を解剖する際に役立ちます。
   4. ライスナー膜を根元に保持し、少しずつ引き剥がして、慎重に取り除きます。
      注:これは、ライスナー膜がイメージングの取得を妨げないため、オプションのステップです。
9. 蝸牛外植片の場合は、次の手順に従います。
   1. インスリン注射器(マウス)または鉗子(ラット)を使用して、骨性らせん状椎弓層かららせん神経節を剥離します。
   2. デタッチメント中にモディオルスを静かにほどきます。
      注:外植片は、取り扱いを改善するために2つに分けることができます。
   3. 鉗子でフック領域をつかみます。
   4. 線条血管筋のあるらせん靭帯を引き抜いて慎重に取り外します。
   5. ライスナー膜を根元に保持し、少しずつ引き剥がして、慎重に取り除きます。
      注:ライスナー膜は通常、ニューロンフィラメントを折りたたんで覆うため、実験に影響を与える可能性があるため、この手順をお勧めします。

4. 蝸牛外植片の培養

1. 外植片をペトリ皿からマルチウェルチャンバーに移します。有毛細胞を上に向けて、実験室のスパチュラを使用して外植片を持ち上げます。サンプルがヘラにくっつかないように、数マイクロリットルの1x PBSを含めます。
   注意: ひどく損傷した外植片はヘラに付着します。
2. 培地の中でスパチュラを静かに振って、外植片をスパチュラからチャンバーにスライドさせます。8ウェルチャンバースライドのウェルごとに1つの外植片を配置します。
   注意: 外植片がヘラにくっつく場合は、ヘラを培地に入れ、鉗子を使用して外植片を取り外します。鉗子は常に外植片の内側の境界(有毛細胞から離れた場所)に配置します。
3. 外植片が正しい向きに移され、ウェルの中央に配置されていることを顕微鏡で確認します。
   注:有毛細胞が下を向いている外植片の向きが間違っていると、幅に沿って上向きにU字型を示す傾向があります。外植片をチャンバーの隅に移動して向きを修正し(より多くの培地が利用可能です)、回転するように指示します。
4. 100 μLのピペットを使用して培地80 μLを除去し、廃棄します。
5. 有毛細胞とらせん神経節ニューロン細胞が見えるかどうかを顕微鏡で確認します。必要に応じて、鉗子を使用して、重なり合った組織をそっと押し広げます。
6. 残りの培地を取り除き、~10秒待ちます。
7. 培地をピペットでつなぎます。外植片の隣に培地を1〜2滴加え、残りの培地を外植片から少し離れた場所に追加して、外植片が剥がれないようにします。
   注:外植片がチャンバーに付着している場合でも、外植片の隣に1〜2滴ピペッティングして培地を必ず最初に添加する必要があります。このようにして、残りの完全な培地が添加されても、外植片は持ち上げられません。
8. チャンバーをインキュベーターに戻し、2時間インキュベートして、臓器がチャンバーの底にしっかりと付着できるようにします。
9. 培地を取り除き、100 μLまたは200 μLのピペットを使用して、300 μLの予熱した新鮮な完全培地を慎重に加えます。1 mLのピペットは使用しないでください。
   注:前処理が必要な場合は、2時間付着させた後、目的物質を含む300 μLの完全培地を加えます。4ウェルチャンバーを使用する場合は、最大500 μL/ウェルを使用してください。
10. チャンバーをインキュベーターに戻します。

5.耳毒性物質の試験

1. 外植片を一晩放置して、培養条件に適応し、回復させます。
2. さまざまな濃度の耳毒性剤を調製して、約50%の有毛細胞喪失を伴う耳毒性モデルを確立するための適切な濃度を見つけます。ゲンタマイシンには50 μM〜250 μM、シスプラチンには40 μM〜320 μMを使用します。シスプラチン溶液を新鮮に調製し、光から保護します。
3. 培地を取り除き、目的の耳毒性薬物を含む培地300 μLを慎重に加えます。
4. 外植片をゲンタマイシンおよびシスプラチンとともに37°Cで24時間から48時間インキュベートし、有毛細胞の生存率を決定します。
   注:薬物濃度と曝露時間は、研究の目的に応じて選択されます。外植片の保存は72時間までここにテストされた。長期培養を計画している場合は、血清を使用しないでください。
5. 次のセクションに従って、蝸牛細胞を染色します。

6.固定と免疫蛍光法

1. 実験終了時に培地を廃棄し、直ちに200 μLの予熱した1x PBSで外植片を洗浄します。
2. 外植片を200 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で化学ヒュームフード下で15分間固定します。
   注意:PFAは危険な化学物質です。PFAを初めて使用する前に、製品安全データシート(MSDS)をお読みください。
3. 外植片を200 μLの1x PBSで2回洗浄します。染色手順を延期する必要がある場合に備えて、外植片を1x PBSで4°Cで保存します。
4. 1x PBSと1%-5%Triton-X100からなる透過処理溶液を調製します。
5. 1x PBSを廃棄し、200 μLの透過処理溶液を加え、外植片を15分間インキュベートします。
6. ブロッキング溶液を調製します。
   1. コルチ外植片の臓器には、1x PBS、10%正常ヤギ血清(NGS、ヤギ二次抗体用、または二次抗体と同じ種由来の別の血清)からなるブロッキング溶液を調製します。あるいは、細胞がファロイジンのみで染色されている場合は、1%〜5%のウシ血清アルブミン(BSA)を使用します。
   2. 蝸牛外植片の場合、螺旋神経節細胞を染色するためにマウス一次抗体(例:マウス抗TuJ1)を使用する場合は、1x PBS、10% NGS、およびFabフラグメント(Fabフラグメントヤギ抗マウスIgG H+L、希釈率1:200)からなるブロッキング溶液を調製します。
7. 200 μLのブロッキング溶液を加え、外植片を1時間インキュベートします。
8. ブロッキング溶液を廃棄します。Fabフラグメントとインキュベートした外植片に、200 μLの4% PFAを加え、5分間インキュベートします。
9. 外植片を1x PBSで5分間洗浄します。
10. 1x PBS、5% NGS、および0.1%-0.25% Triton-X100からなる抗体溶液を調製します。
11. 一次抗体を抗体溶液(MYO7A(ab3481を1:500で希釈またはMYO7A 138-1で1:100)で希釈して有毛細胞を標識し、TuJ1(1:400)でらせん神経節ニューロンを標識します。
    注:有毛細胞がファロイジンのみで標識されている場合は、ファロイジンを1x PBSで1:150に希釈し、室温で40分から1時間インキュベートし、ステップ6.22に進みます。
12. 一次抗体を省略することにより、二次抗体の非特異的結合のためのコントロールを含む。
13. 一次抗体を含む抗体溶液170 μLを対応するウェルに加え、穏やかに振とう(40〜60 rpm)しながら4°Cで一晩インキュベートします。
14. 外植片を1x PBSでそれぞれ5分間4回洗浄します。
15. 二次抗体を抗体溶液(例:ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488またはヤギ抗マウスAlexa Fluor 568 IgG)で希釈し、希釈率を1:500にします。
16. 170μLの抗体溶液と二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートします。
    注意: このステップ以降、外植片を長時間の光にさらされないように保護してください。
17. 外植片を1x PBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。
18. 次のステップに進み、外植片の連続した二重標識を行います。目的の2番目の一次抗体(有毛細胞のMYO7Aなど)とともに、4°Cで穏やかに振とう(40〜60rpm)して一晩インキュベートします。または、ファロイジン(1:150)と室温で40分から1時間インキュベートし、ステップ6.22に進みます。
    注:一次抗体が同じ宿主種由来の場合は、逐次標識を行ってください。マルチプレックス免疫蛍光法の末端にファロイジン標識を行います。
19. 外植片を1x PBSでそれぞれ5分間4回洗浄します。
20. 二次抗体を抗体溶液(例:ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488またはヤギ抗マウスAlexa Fluor 568 IgG)で希釈し、希釈率を1:500にします。
21. 二次抗体170μLを添加し、室温で1時間インキュベートします。
22. 外植片を1x PBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。
23. 1 mg/mLのDAPIストック溶液を調製し、-20°Cで保存します。 DAPI 原液を 1:10 に希釈して 0.1 mg/mL の作業溶液を調製し、4 °C で保存します。
    メモ: DAPI を含む実装メディアを使用する場合は、手順 23 をスキップして手順 26 に進みます。
24. DAPIワーキング溶液を1x PBSで1:100に希釈し、外植片を200 μLのDAPI溶液で5分間インキュベートします。
25. 外植片を1x PBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。
26. 1x PBSを可能な限り取り外して、チャンバーの底を乾かします。外植木を乾かさないでください。
27. 2〜5秒待ってから、外植片に直接封入剤を1滴加えます。
    注:外植片の封入剤は、表面張力により所定の位置に留まります。硬化封入剤を使用できます。
28. イメージングするまでチャンバーを4°Cで保存してください。

7. 外植片由来の生細胞の免疫蛍光法

1. 単離された外植片は、一晩インキュベーションした後に使用してください。
2. 培地を取り除き、125 μMのシスプラチンを含む培地300 μLを慎重に加えます。
3. 外植片を18時間インキュベートして、生きた外植片中のミトコンドリアスーパーオキシドを測定します。
4. 薬物曝露の最後に培地を廃棄します。
5. 細胞のROS(例:250 nMのmito-hydroethidine)および/またはカスパーゼ-3(例:核酸結合色素に結合した2 μMのDEVDペプチド)を検出するために、300 μLの透過性プローブを添加します。
6. 37°Cで30分間インキュベートします。
7. 外植片を200 μLの温かいハンク平衡塩溶液(HBSS)または適切な緩衝液で2回穏やかに洗浄します。
8. 400 nmの蛍光励起と590 nmの発光検出により、2時間以内に細胞をイメージングします。
9. 実験終了時に培地を廃棄し、直ちに200 μLの予熱した1x PBSで外植片を洗浄します。
10. 外植片を固定し、上記のように蝸牛細胞を染色します。

8. 共焦点イメージングによる可視化

1. スピニングディスク共焦点ユニットを備えた顕微鏡または点走査型共焦点ユニットを備えた共焦点顕微鏡を使用して外植片を画像化します。
2. 20倍の空気対物レンズ(開口数:0.75)を備えた回転ディスクを使用して細胞をカウントし、画像を取得します。または、40倍の空気対物レンズ(開口数:0.95)または100倍のオイル対物レンズ(開口数:1.45)を備えた点走査型共焦点顕微鏡を使用して画像を取得し、シナプスを視覚化してカウントするか、立体繊毛を画像化します。
   注意: 各チャンネルのレーザー強度と露光時間を調整して、画像の過飽和と過飽和を回避します。同じ実験のすべての外植片に同じ設定を適用します。
3. 20倍の空気対物レンズ、Zスタック、および自動ステッチングツールを使用して、蝸牛外植片全体の3D画像をキャプチャするように顕微鏡をセットアップします。マウスの外植片には15%のオーバーラップを持つ3 x 3の隣接フィールドを使用し、ラットの外植片には4 x 4の隣接フィールドを使用します。
4. 顕微鏡のソフトウェアまたは無料のオープンソースFIJI^{ソフトウェア8}を使用して画像を調整します。
   注:画像処理技術であるデコンボリューションは、共焦点画像に適用して、コントラストと解像度^をシャープにすることができます^9-11。

結果

本プロトコルは、新生仔マウスおよびラットの蝸牛で試験されている。この論文では、さまざまな実験から得られた外植片の画像を紹介します。コルチの器官の外植片はゲンタマイシンまたはシスプラチンに曝露され、有毛細胞の喪失が見られました。コルチ器官の外植片は、通常の条件下とストレス条件の両方でその構造と全長を維持しました(図1 および 図2)。以前にシスプラチンに曝露されたラット外植片の全長に沿って生き残った有毛細胞は、個別に検出可能でした(図1)。生き残った有毛細胞の検出に加えて、アポトーシスを起こしている有毛細胞も検出されました(図2)。このアプローチは、生存細胞の可視化とカウントを容易にし、これは、前述のように、深層学習アプローチを使用して実行することができる¹²。また、適切な細胞透過性プローブを用いて、生きた蝸牛細胞の生物学的プロセスを検出することも可能でした(図3)。

螺旋神経節ニューロンを含む蝸牛外植片の場合、外植片を2つに切断するか、または頂点領域を切り取って、より良い培養条件を提供することができます。ここでは、頂点領域を分離することを選択しましたが、これは、応力条件下での影響が少ないためです。図4は、蝸牛外植片の基部領域と内側領域を示しています。有毛細胞マーカーMYO7Aで標識された有毛細胞が検出されました。同様に、健康で損傷した螺旋神経節細胞体と、ニューロンマーカーTuJ1で標識された神経突起が同定されました。螺旋神経節領域の解析は、手動で行うか、FIJIなどのオープンソースソフトウェアと神経突起トレース¹³用のNeuronJプラグイン、または形態学的セグメンテーション用のTrackMateやCellposeなどの拡張機能を使用して実行できます^14,15。マウス外植片を詳しく調べたところ、蝸牛細胞と有毛細胞立体繊毛の高解像度が明らかになりました(図5)。

図1:ゲンタマイシンに曝露されたラットのコルチ器官の外植片。 (A)コントロールおよび(B)ゲンタマイシン曝露(200 μM、24時間)外植片の代表的な画像(最大強度投影)。有毛細胞はファロイジンで標識されており、蝸牛の全長に沿って視覚化できます。わかりやすくするために、画像はグレートーンになっています。画像は、20倍の対物レンズ(開口数:0.75)を備えた回転ディスク共焦点顕微鏡を使用して取得されました。スケールバー = 500 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:シスプラチンに曝露したマウスのコルチ器官の外植片。 (A)コントロールおよび(B)シスプラチン曝露(160 μM、48時間)外植片の代表的な画像(最大強度投影)。有毛細胞はファロイジン(赤)で標識され、アポトーシス有毛細胞はフルオレシンで標識されています。画像は、点走査型共焦点顕微鏡と20倍対物レンズ(開口数:0.75)を使用して取得されました。スケールバー = 200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:ライブイメージング実験によるコルチ器官の外植。 野生型マウスの外植片の代表的な画像(最大強度投影)は、(A)対照外植片および(B)外植片を125 μMシスプラチンに18時間ばく露した結果を示しています。有毛細胞は、mito-hydroethidineおよびカスパーゼ-3で標識されています。画像は、回転ディスク共焦点顕微鏡と20倍対物レンズ(開口数:0.75)を使用して取得されました。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:シスプラチンに曝露したSTAT1ノックアウトマウスの蝸牛外植片。(A)対照外植片と(D)外植片を40 μMシスプラチンに48時間曝露した代表的な画像(最大強度投影)。有毛細胞体はMYO7A抗体(緑)で標識され、らせん状神経節細胞はTuJ1抗体(赤)とDAPI核標識(青)で標識されています。画像は、点走査型共焦点顕微鏡と20倍対物レンズ(開口数:0.75)と2.15ズーム(B、C、E、F)を使用して取得されました。スケールバー = (B,C,E,F) 50 μm および (A,D) 200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:コルチ外植片のマウス器官。 (A-D) 野生型マウスの完全長外植片の代表画像(最大強度投影)。(A,B)外植片は、MYO7A抗体、ファロイジン、およびDAPI核標識で標識されました。(B)拡大した概観では、MYO7A抗体で標識された有毛細胞(緑色)の細胞体がはっきりと見える。(C、D)ファロイジンは、有毛細胞の立体繊毛とクチクラ板を標識します。外植片はファロイジンで標識した。(D)拡大された概要では、個々の内有毛細胞立体繊毛のデコンボリューション画像がよく識別されているのに対し(下段)、個々の外有毛細胞立体繊毛はより描写が困難です(上段)。パネルAとCの画像は、20倍対物レンズ(開口数:0.75)のスピニングディスク共焦点顕微鏡で取得しました。パネルBの画像は、同じ顕微鏡で40倍の空気対物レンズ(開口数:0.95)で取得されました。パネルDの画像は、点走査型共焦点顕微鏡と100倍オイル対物レンズ(開口数:1.45)で取得され、さらに3.46倍のズームで取得されました。スキャンはXYセクションごとに4回平均され、ピクセルサイズは0.02μmでした。スケールバー = (D) 3 μm、(B) 100 μm、(A,C) 200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルを更新する目的は、外植片の単離から生および固定蝸牛細胞のイメージングまでのステップを合理化することでした。単離中のいくつかのステップを改善し、高品質の外植片を得るための効率的で円滑なプロトコルを確立することを目的として、いくつかの革新的なツールを導入しました。説明されている方法は、以前のレポート^4,5から最適化されたプロトコルです。さらに、現在の研究の中には、段階的に更新されたプロトコルが欠けているものもあります。このプロトコルは、外植片の培養ステップが簡素化されているため、再現性のあるデータに不可欠な保存状態の良い外植片を簡単に取り扱うことができます。内耳外植片用のポリマーカバーガラスを備えたマルチウェルチャンバーの導入により、臓器の付着と無傷の外植片の保存が改善されます。ここでは、有毛細胞の喪失や神経突起の損傷にもかかわらず、培養中の臓器が細胞組織を維持することを実証するために、ストレス条件下での実験例をいくつか紹介します。

内耳器官の培養における課題の1つは、外植片の完全性、治療への反応、およびその後の検査に影響を与えるため、臓器の剥離や浮遊を回避することです。以前は、外植片はガラスカバーガラス上で培養されていました^4,5。ガラス表面への培養は良い代替手段のようですが、ガラスのコーティングには時間がかかり、カバーガラス自体は壊れやすくデリケートです。ミリセル細胞培養インサートを用いた代替プロトコルは、この問題を解決しようとするものです⁶。しかし、外植片で膜を切断して転写することは、そのプロトコルのデリケートなステップのようです。さらに、カバーガラスの取り付けおよび密封中に外植片が損傷する可能性があります。私たちが提案するアプローチでは、外植片をポリ-D-リジンでコーティングされたチャンバーに移し、正しい位置に配置すると、それ以上の転写やカバーガラスによるカバーガラスのカバーは必要ありません。このプロトコルのさらなる利点は、臓器外植片に最適な培養条件を提供する薄いガス透過性ポリマーカバースリップを備えたチャンバーの使用です。このポリマーはガラスに似た光学特性を持つため、高解像度顕微鏡での細胞イメージングに適しています。

培地への血清の添加は、1%-10%FBS ^4,5,6,16による内耳外植片の培養を含む、細胞および組織培養のためのほとんどのプロトコルで使用されます。血清の存在は実験の培養条件に影響を与えます。したがって、特定の状況では、血清を含まない培養が好ましい。蝸牛外植片の培養における血清の不在は、DMEMへのN2の添加またはNeurobasal-A^培地へのN2の添加のいずれかによって置き換えられました^5,6。この点に関して、外植片の培養条件を血清の有無にかかわらず試験しました。どちらの条件下でも、内耳細胞は重要であり、耳毒性状態に反応しました。これらの条件を72時間試験しましたが、^{他の研究で}示唆されているように、特にN2、B27、および成長因子とともに無血清培地でインキュベートした場合、外植片はさらに長く培養中に維持できます^5,16。

内耳外植片の分離における一般的な重要なステップに加えて、臓器の隔離期間や使用される抗生物質など、このプロトコルにはいくつかの重要なステップもありますが、これらは管理可能です。この方法の重要なステップの1つは、臓器が挿入された後、チャンバー内に残る培地の体積に関連しています。これは、外植片を生きたまま底面に付着させるように最適化されています。もう1つの重要なステップは、外植片をチャンバーの底部に付着させるのに必要なインキュベーション時間に関するものです。数マイクロリットルの培地で2時間を超えるインキュベーション時間は、外植片の健康に影響を与える可能性があります。1時間などの短いインキュベーション時間も、外植片を切り離さないように注意する限り使用できます。もう一つの重要な側面は、ポリ-D-リジンの残基である。ポリ-D-リジンの臭化物塩の残留物は細胞に有毒である可能性があるため、ポリ-D-リジンの洗浄手順に厳密に従う必要があります。洗浄ステップを正確に実行した後、ポリ-D-リジンでコーティングすると、外植片がチャンバーにスムーズに付着しやすくなり、チャンバーの底にしっかりと付着する前に位置を修正することができます。

この方法の限界の1つは、正立顕微鏡を用いた細胞のイメージングです。これは、倒立顕微鏡を使用している研究室にとって重要な問題になる可能性があります。取り外し可能なシリコンチャンバーを備えたスライドガラスは、直立顕微鏡と倒立顕微鏡に使用できます。ただし、ポリ-D-リジンを使用したコーティング条件は、最初にテストする必要があります。さらに、インサートは取り外しができず、蓋付きの1つのチャンバーの全高は、標準的な顕微鏡スライドの高さ1mmと比較して約11mmであるため、チャンバーの保管にも制限があります。ただし、8ウェルチャンバーは、¹⁶以前に提案された4ウェルプレートよりも少ないスペースを使用します。

ここでは、2台の顕微鏡で撮影した画像を紹介します。点走査型共焦点顕微鏡は光学面が薄いため、組織の高解像度画像を提供しますが、スピニングディスク共焦点顕微鏡は、優れた解像度でより速いイメージング時間を提供します。内有毛細胞(IHC)と外有毛細胞(OHC)の立体繊毛は、共焦点顕微鏡を使用して視覚化されます。IHCの立体繊毛はOHCよりも大きいため、この研究では繰り返しよく可視化されました。OHC立体繊毛の場合、超解像顕微鏡(SRM)など、他の代替顕微鏡で可視化を改善できます。スピニングディスク顕微鏡で取得された外植片画像は、深層学習アプローチ¹²を用いた自動有毛細胞計数の容易な統合に十分である。さらに、取得時間が短いことは、生細胞や組織を用いた実験にとって重要です。さらに、このプロトコルは新生児の蝸牛外植子に限定されません。いくつかの最適化により、前庭器官や胚組織などの他の外植片も培養できます。

有毛細胞やニューロンなどの蝸牛細胞の in vitro での定量は、細胞の生存率、ひいては損傷または失われた細胞の割合を評価するために重要です。シグナル伝達経路と細胞機能の研究は、死と生存のメカニズムを明らかにするのに役立ちます。胎児および新生児の蝸牛組織の検査は、蝸牛の発達段階を調べるのに役立ちます。したがって、このプロトコルは、耳毒性モデルの確立、発達段階の調査、シグナル伝達経路の評価、薬物スクリーニング研究の実施など、内耳外植片の in vitro 研究を最適化するのに役立ちます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mL 高透明度ポリプロピレン コニカル チューブ 17 x 120 mm スタイル	FALCON	352096
45°角度付き鉗子	Fine Science Tools	11251-35
50 mL ポリプロピレン コニカルチューブ 30 x 115 mm スタイル	FALCON	352070
退色防止 封入剤	VECTASHIELD	H-1000
Alexa Fluor 568 ファロイジン	サーモフィッシャー	2151755
抗ベータ III チューブリン抗体 [TUJ-1]	Abcam	ab14545
退色防止 封入剤DAPI	VECTASHIELD	H-1200
抗ミオシン VII ウサギ ポリクローナル	Abcam	ab3481
B-27 サプリメント (50x)、抗酸化物質を差し引いた	サーモフィッシャー	10889038
炭素鋼外科用ブレード 23	Swann Moiton	210
CellEvent™カスパーゼ-3/7 緑色検出試薬	サーモフィッシャー	C10723
DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX	サーモフィッシャー	31331028
ダブルスパチュラ、湾曲した端部	VWR	RSGA038.150
エチルアルコール 70% V/V 1,000 mL	ビヒセル	160 0 106 00
ウシ胎児血清、認定	サーモフィッシャー	16000036
PBS	サーモフィッシャー	201255309/201255305
	イントララックス®	5100
ホイヘンス プロフェッショナル バージョン 21.10	サイエンティフィック ボリューム イメージング
同上 µ-スライド 8 ウェル	同上	80826
顕微鏡	ライカ	M80
顕微鏡	ライカ	MS5
MitoSOX&貿易;赤色ミトコンドリアスーパーオキシドインジケーター、生細胞イメージング用	サーモフィッシャー	M36008
N2 サプリメント (100x)	Thermofisher	17502048
Nikon Eclipse Ti 顕微鏡、横河電機CSU-W1スピニングディスク共焦点ユニット、Photometrics Prime 95Bカメラ。	ニコン
ニコン エクリプス Ti 顕微鏡 A1 点走査型共焦点ユニット	ニコン
手術ハサミ	ファインサイエンスツール	14005-16
手術ハサミ	ファインサイエンスツール	14088-10
手術ピンセット	ファインサイエンスツール	11008-15
PBS pH 7.2 (1x), 500mL	サーモフィッシャー	20012-019
ペニシリン	Sigma-Aldrich	P3032
POLY-D-LYSINE 臭化水素酸塩 MOL WT GT 30	Sigma-Aldrich	P7405
メスハンドル #4	Fine Science Tools	10004-13
Steri 250 Second Sterilizer	Simon Keller AG	031100
滅菌器、乾燥剤ペレット	Simon Keller AG	31120
組織培養ディッシュ 60 x 15 mm	FALCON	353802
ティッシュカルチャーディッシュ 60 x 15 mm	FALCON	353004
Trito X-100	Σ	T9284
型破りなミオシン-VIIa	Developmental Studies Hybridoma Bank	138-1s
WFI for Cell Culture[-]抗菌剤、500 mL	サーモフィッシャー	A12873-01