この研究では、マイクロコンピュータ断層撮影(micro-CT)と造影剤をex vivo サンプルで組み合わせて、新生仔マウスの脳の高解像度画像を取得する手順について説明します。これらの画像で脳の大きさと形状を定量化するための基本的な形態測定分析について説明します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
ニューロイメージは、動物モデルを用いた実験で脳の形態を研究するための貴重なツールです。磁気共鳴画像法(MRI)は軟部組織の標準的な方法となっていますが、空間分解能が低いため、小動物には限界があります。ここでは、マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)を使用して、マウス新生児の脳と頭蓋骨の高解像度3次元(3D)情報を取得するためのプロトコルについて説明します。プロトコルには、サンプルの解剖、脳の染色とスキャン、および臓器全体と関心領域(ROI)の形態測定値を取得するために必要な手順が含まれています。画像解析には、構造物のセグメンテーションとポイント座標のデジタイズが含まれます。要するに、この研究は、マイクロCTと造影剤としてのルゴール溶液の組み合わせが、小動物の周産期脳をイメージングするための適切な代替手段であることを示しています。このイメージングワークフローは、発生生物学、生物医学、および脳の発達に対する多様な遺伝的および環境的要因の影響の評価に関心のあるその他の科学に応用されています。
概要
マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)イメージングは、さまざまな研究分野にとって貴重なツールです。生物学では、石灰化した組織でX線を吸収するため、骨研究に特に適しています。この特徴により、骨の発達1、代謝2、進化3,4など、さまざまな疑問にマイクロCTの助けを借りてアプローチしてきました。2008年、de Crespignyらは、ヨウ素を造影剤として用いることで、成体のマウスとウサギの脳のマイクロCT画像が得られることを示しました。この研究は、ヨウ素がX線の影響を受けない軟部組織からの画像の取得を可能にしたため、このイメージング技術の新しいアプリケーションを開きました。したがって、マイクロCTとヨウ素系造影剤を組み合わせる一般的な目的は、軟部組織をメゾまたはマクロの解剖学的レベルで識別および識別できる高解像度画像を取得することです。
この手法は、実験デザインで広く使用されているマウス胚などの小さな標本の詳細なex vivo表現型特性評価を必要とする研究に顕著な可能性を秘めています6。ヨウ素造影剤とマイクロ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
すべての実験手順は、カナダ動物管理評議会のガイドラインに従った。
1. サンプルの採取と調製
- 500 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調製します。
- キャビネット内の抽出フラックスの下で、1 L のガラスビーカー中の 250 mL の 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に 20 g の PFA 粉末を加えます。磁石付きのビーカーを磁気攪拌プレートの上に置きます。
- 加熱しながらかき混ぜます。温度計で溶液の温度を常にチェックし、60°C未満に保ちます。
- プラスチック製のパスツールピペットを使用して、溶液に1 M NaOHを滴下し、PFAを溶解します。PFA粉末が完全に溶解したら、溶液を室温(RT)で冷却します。
- 1x PBSで容量を500 mLに調整します。プラスチック製のパスツールピペットで1 M HClの滴を加えて、pHを7.2〜7.3に調整します。
- ペーパーフィルターとガラス漏斗を使用して、1Lのガラス瓶で溶液をろ過します。
- ガラス瓶を密閉し、フラックスキャビネットから取り出し、-4°Cの冷蔵庫で保管してください。
- 脳のサンプルを収集します。
- サンプルを採取するには、生後0.5日齢(P 0.5)の生後翌朝に生贄マウスの新生児を、....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
ここでは、新生仔マウスの脳の高解像度画像を取得するための基本的なプロトコルが提示されます。頭部はルゴール溶液に浸漬した後にスキャンした。サイズが小さいにもかかわらず、嗅球、皮質、中脳、小脳、後脳などの主要な脳の解剖学的構造を区別することができます(図1)。
これらの画像を入力として使用して、さまざまな分析を実行できます。2つの異なる解剖学的平面のランドマークとセミランドマークのセットがデジタル化されました。 図2に見られるように、点は脳の境界に沿って選択された平面に配置されています。デジタイズが終了すると、ポイントの座標を.txtファイルで読み取ることができます(図3)。ポイントのデジタイズの目的は、幾何学的形態解析でさらに使用できる生の座標を取得することでした。提示されたプロトコルは単一の標本に焦点を当てており、形態測定分析はより大きなサンプルに適していますが、同じポイントのセットを使用して得られた結果.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
この研究では、造影剤を用いたマイクロCTを用いてマウスの新生児脳組織をスキャンするための簡潔なプロトコルが紹介されています。さらに、定量的および定性的な出力を得るための簡単な手順が含まれています。これらの方法に基づいて、さらに代替的または補完的な分析を実行できます。
プロトコルに示されているように、マイクロCT画像はさまざまな方法で分析できます。これまでの研究で、私たちのグループは、点の座標をデジタル化し、幾何学的形態測定技術を適用することにより、マウスの周産期脳のサイズと形状の変化を推定しました8,14。座標のデジタイズは、単純なユークリッド距離推定を使用して線形計測値を取得する場合にも役立ちます。これは、脳とROIのセグメンテーションから得られるボリュームとともに、従来の形態測定評価のための貴重なインプットです。
ここで紹介するプロトコールは、私たちが使用したような ex vivo の小さ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは、競合する利害関係はないと宣言しています。
謝辞
Wei Liu氏の技術支援に感謝します。この研究は、ANPCyT PICT 2017-2497 および PICT 2018-4113 から資金提供を受けています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| &マイクロ;CT 35 | Scanco Medical AG | Scancoは &CT35はもう。彼らの最小のスキャナーは現在 &マイクロ;CT45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| フラックスキャビネット | Esco | AC2-458 | |
| ガラスビーカー | Glassco | GL-229.202.10 | |
| びん | Simax | CFB017 | |
| ガラス漏斗 | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | フラックスキャビネットの下で操作し、個人用保護具(マスク、ガラス、手袋)を使用しますI |
| 2 | Cicarelli | 804211 | I2KIを準備するときは、フラックスキャビネットの下で操作し、個人用保護具(マスク、ガラス、手袋)を使用しますKI |
| シカレリ | PA131542.1210 | I2KIを準備するときは、フラックスキャビネットの下で操作し、個人用保護具(マスク、ガラス、手袋)を使用してください磁気 | |
| 攪拌アル | カノ | 4925 | |
| NaOH | チカレリ | 1580110 | フラックスキャビネットの下で操作し、個人用保護具(マスク、ガラス、手袋)を使用しますオー |
| ビタルシェー | カーBiomint | BM021 | |
| パラホルムアルデヒド | バイオパック | 2000959400 | フラックスキャビネットの下で操作し、個人用保護具(マスク、ガラス、手袋)を使用しますパ |
| トンスパチュラ | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | バイオパック | 2000988800 | |
| プラスチックパスツールピペット | Daigger | 9153 | |
| RRプロジェクト | Rのパッケージジオモーフは、プロトコル(https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | ||
| はさみ | Belmed | ||
| ジ化ナトリウム | バイオパック | 2000163500 | |
| 温度計 | Daigger | 7650 |
参考文献
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
