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方法論記事

マウス新生児脳のマイクロCTイメージングと形態解析

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DOI：

10.3791/65180

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2023年5月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Unidad Ejecutora de Estudios en Neurociencias y Sistemas Complejos (ENyS, CONICET-UNAJ-HEC), 2Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de La Plata, 3Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 4Department of Cell Biology and Anatomy, Cumming School of Medicine, University of Calgary

この記事について

サマリー

この研究では、マイクロコンピュータ断層撮影(micro-CT)と造影剤をex vivo サンプルで組み合わせて、新生仔マウスの脳の高解像度画像を取得する手順について説明します。これらの画像で脳の大きさと形状を定量化するための基本的な形態測定分析について説明します。

要約

ニューロイメージは、動物モデルを用いた実験で脳の形態を研究するための貴重なツールです。磁気共鳴画像法(MRI)は軟部組織の標準的な方法となっていますが、空間分解能が低いため、小動物には限界があります。ここでは、マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)を使用して、マウス新生児の脳と頭蓋骨の高解像度3次元(3D)情報を取得するためのプロトコルについて説明します。プロトコルには、サンプルの解剖、脳の染色とスキャン、および臓器全体と関心領域(ROI)の形態測定値を取得するために必要な手順が含まれています。画像解析には、構造物のセグメンテーションとポイント座標のデジタイズが含まれます。要するに、この研究は、マイクロCTと造影剤としてのルゴール溶液の組み合わせが、小動物の周産期脳をイメージングするための適切な代替手段であることを示しています。このイメージングワークフローは、発生生物学、生物医学、および脳の発達に対する多様な遺伝的および環境的要因の影響の評価に関心のあるその他の科学に応用されています。

概要

マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)イメージングは、さまざまな研究分野にとって貴重なツールです。生物学では、石灰化した組織でX線を吸収するため、骨研究に特に適しています。この特徴により、骨の発達1、代謝2、進化3,4など、さまざまな疑問にマイクロCTの助けを借りてアプローチしてきました。2008年、de Crespignyらは、ヨウ素を造影剤として用いることで、成体のマウスとウサギの脳のマイクロCT画像が得られることを示しました。この研究は、ヨウ素がX線の影響を受けない軟部組織からの画像の取得を可能にしたため、このイメージング技術の新しいアプリケーションを開きました。したがって、マイクロCTとヨウ素系造影剤を組み合わせる一般的な目的は、軟部組織をメゾまたはマクロの解剖学的レベルで識別および識別できる高解像度画像を取得することです。

この手法は、実験デザインで広く使用されているマウス胚などの小さな標本の詳細なex vivo表現型特性評価を必要とする研究に顕著な可能性を秘めています6。ヨウ素造影剤とマイクロCTイメージングの組み合わせは、臓器7および画期的な3次元(3D)構造8,9の体積定量化を得るために使用されています。近年、げっ歯類の脳表現型の特徴を記述するために、染色されたサンプルのマイクロCTスキャンが適用されており10、技術に対するさまざまな改良が提案されている。成人の脳では、ヨウ素に48時間浸漬し、ヒドロゲルによる灌流の前工程を行うプロトコルにより、高品質の画像が生成されることがわかった11。Gignacら12は、ヨウ素で染色されたラットの脳を処理すれば、日常的な組織学的手法を実行できることを示し、この技術の限界を拡大しました。同様に、これらの手順は、胎児および離乳前のげっ歯類の脳に対して有望な結果を示しています8,13,14,15。

神経科学は、脳の発達のさまざまな構造的および機能的側面を評価するために主に顕微鏡ベースの技術を適用してきましたが、そのような研究は、特定の細胞集団または空間的に制限された構造を特徴付けるのに適しています。逆に、マイクロCTイメージングは、顕微鏡技術を補完する、関連する空間情報を保持する構造全体の記述と3Dモデルの取得を可能にします。磁気共鳴画像法(MRI)は、小動物の構造的特徴を調査するために適用される標準的な技術でもあります16,17,18。しかし、造影剤を使用したマイクロCTには、ex vivo固定サンプルに対する2つの主な利点があります:マイクロCTスキャナーは、MRI12よりも安価で操作が簡単で、高い空間分解能を可能にします。

この研究は、ヨウ素ベースの造影剤であるルゴール溶液で染色した後、マイクロCTスキャンを使用して新生仔マウスの脳から高解像度画像を取得する手順を説明することを目的としています。サンプルの採取や組織の固定などの前段階から始まり、染色、マイクロCT画像取得、標準処理を経る包括的なプロトコルが提示されます。画像処理には、頭部全体と脳の3Dボリュームのセグメンテーションと、形態測定分析で使用できる点座標をデジタル化するための特定の解剖学的平面の選択が含まれます。ここでは新生仔マウスの脳に焦点を当てていますが、同様の戦略を他の軟部組織にも適用できます。したがって、ここで紹介するプロトコルは、微妙な変更を加えて、他のタイプのサンプルに適用できる柔軟性があります。

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プロトコル

すべての実験手順は、カナダ動物管理評議会のガイドラインに従った。

1. サンプルの採取と調製

  1. 500 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調製します。
    1. キャビネット内の抽出フラックスの下で、1 L のガラスビーカー中の 250 mL の 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に 20 g の PFA 粉末を加えます。磁石付きのビーカーを磁気攪拌プレートの上に置きます。
    2. 加熱しながらかき混ぜます。温度計で溶液の温度を常にチェックし、60°C未満に保ちます。
    3. プラスチック製のパスツールピペットを使用して、溶液に1 M NaOHを滴下し、PFAを溶解します。PFA粉末が完全に溶解したら、溶液を室温(RT)で冷却します。
    4. 1x PBSで容量を500 mLに調整します。プラスチック製のパスツールピペットで1 M HClの滴を加えて、pHを7.2〜7.3に調整します。
    5. ペーパーフィルターとガラス漏斗を使用して、1Lのガラス瓶で溶液をろ過します。
    6. ガラス瓶を密閉し、フラックスキャビネットから取り出し、-4°Cの冷蔵庫で保管してください。
  2. 脳のサンプルを収集します。
    1. サンプルを採取するには、生後0.5日齢(P 0.5)の生後翌朝に生贄マウスの新生児を、外科用ハサミで首を切り落とす。
    2. 体を押さえながら新生児の首にハサミを入れ、1回だけきれいに切ります。
  3. サンプルを PFA で固定します。
    1. 50 mL のコニカルチューブに 40 mL の 4% PFA を充填します。
    2. 固定剤としてPFAを含むチューブに各ヘッドを浸します。このアクションには、パトンヘラまたはスプーンを使用します。
    3. コニカルチューブを-4°Cの冷蔵庫で48時間保存した後、防腐剤として0.1%アジ化ナトリウムを含む40 mLの1x PBSに変更します。冷蔵保存は-4°Cで保存してください。

2. サンプル染色

  1. ルゴール溶液(3.75%w / v)を調製します。
    1. キャビネット内の抽出フラックス下で、1Lのガラスビーカーに、10gのKlおよび5gのI2 を400mLの蒸留水に溶解し、マグネチックスターラーを使用して一定に混合します。
  2. 各ヘッドを、40 mLのルゴール溶液を含む50 mLのコニカルチューブに浸します。
    1. 体の大きさが約1.3 gの新生児の場合は、オービタルシェーカーを使用して絶えず混合しながら、サンプルを15〜20時間浸漬しておきます。
    2. スキャンする前に、10 mL の 1% アガロースを含む 15 mL のコニカルチューブにサンプルを 30 分間入れます。

3. マイクロCTスキャン

注意: マイクロCTスキャンには特定の機器が必要です。この種のスキャナーにはさまざまなオプションがあり、取得の詳細は使用機器の特性によって異なります。Hallgrímsson博士の研究室では、マイクロCTスキャナーの代替品を頼りにしています。ここでは、このプロトコルは、世界中のラボで使用されている小動物イメージングマシンの中で最もアクセスしやすい基本的なデスクトップスキャナーの使用に基づいています。スキャン対象が頭蓋骨の場合は、プロトコルのセクション2のステップをスキップして、セクション3に進みます。頭蓋骨をスキャンした後、染色プロセスと脳のスキャンを実行して、脳と頭蓋骨の両方の同じ標本から画像を取得できます。

  1. サンプルをマイクロCTホルダーに入れます。
    1. サンプルを 50 mL のコニカルチューブに入れます。スキャナーセッション中に動きないようにサンプルを固定します。この目的のために、チューブの空の部分を埋めるためにいくつかのポリウレタン材料を使用することができる。
    2. 装置を開き、サンプルの入ったチューブをマイクロCTホルダーに入れます。
    3. マイクロCTコントロールパネルにログインし、スキャンするサンプルを登録します。これにより、サンプル番号が自動的に生成されます。番号に加えて、「名前」フィールドに入力します。サンプル名とサンプル番号の両方を、生データを再度取得する必要がある場合に備えて、別の場所(スプレッドシートなど)に記録する必要があります。
    4. スキャンプログラムを起動します。サンプルの名前または番号を入力し、スキャンパラメータを含む 制御 ファイルを選択します。
  2. サンプルをスキャンします。
    1. マイクロCTソフトウェアの画面で、0.012 mmの等方性ボクセルサイズ、45 kVp、177 lA、800,000 msの積分時間、および180°あたり500の投影のパラメータを設定します。
    2. スキャン領域を設定するには、 スカウトビューを選択します。参照画像が表示されたら、 基準線 を押して領域を設定します。緑色の実線をサンプルの端に移動し、 Shift キーを押しながらカーソルをドラッグして、スキャン領域をサンプルのもう一方の端まで拡張します。
    3. [ OK ] を選択してスキャンを開始します。
  3. スキャンを評価してエクスポートします。
    1. マイクロCTスキャナー評価プログラムを開き、サンプルと測定の選択をクリックします。[フィルタ]フィールドにサンプル名を入力し、サンプルを選択して、測定ファイルを選択します。
    2. ファイルはスライスとしてロードされ、その数は最初のスキャンウィンドウによって異なります。[ すべてロード ]ボタンをクリックすると、すべてのスライスがロードされ、後でスライス間の移動が容易になります。
    3. 「タスク」>「評価 3D」を選択して、スライスの周囲に切り抜きボックスを初期化します。3D-Evaluationプロンプトが表示され、Task/Evaluation、VOI(Volume of Interest)、Start X、Y、Z、Dimension X、Y、Zなど、いくつかのフィールドが表示されます。
    4. 再構成、セグメンテーション、形態測定(骨密度など)、ファイルの変換や転送など、さまざまな評価タスクを実行できるため、[ タスク>評価3D ]フィールドを適切なスクリプトに設定します。 Default Evaluation スクリプトはガイドとして使用できます。
    5. スクリプトを選択したら、メイン画像のVOIボックスを調整します。最初のスライスから始めます。ボックスに評価する解剖学的構造が含まれていることを確認します。ボックスの端に向かって小さな白い正方形の1つを右クリックし、マウスの中央ボタンを使用してVOIのサイズを変更して、VOIを移動します。または、[ ディメンション ] フィールドを数値で調整します。
    6. 画像の下にあるスクロールバーを使用してサンプルに目を通し、すべての解剖学的構造がVOIボックスにキャプチャされていることを確認します。ソフトウェアの左上付近にある XY、 XZ、または YZ をクリックして、方向を変更します。
    7. [ 評価の開始] を選択します。タスク評価スクリプトに応じて、対応する .txt ヘッダー ファイルを含む 3D .aim イメージ ファイルが生成されます。さらに、スクリプトでパスを指定して、特定の場所へのイメージ転送プロトコル (FTP) を指定できます。

4. 画像処理

  1. 画像処理ソフトで画像を開きます。
    注:画像処理は、さまざまなソフトウェアを使用して実行できます。このプロトコルには、この分野で広く受け入れられている商用ソフトウェアの基本的な手順が含まれており、基本的および高度な処理のための汎用性の高いツールを備えています。さらに、再構成されたマイクロCT画像にはさまざまな許容形式があります。この側面は、通常、取得に使用される機器とそのソフトウェアによって異なります。ここでは、.bmp画像で画像処理を行う。.tiff画像やその他のタイプにも同じ手順を適用できます。取得はデフォルトの形式として.aimのスキャナーで実行されるため、.aimから.bmpへの変換が最初に表示されます。
    1. .aim ファイルを開くには、[ ファイル] > [データを開く ] を選択し、ファイルを選択します。その後、「ファイル形式の選択」というタイトルのウィンドウが開きます。[ 生データ] を選択します。
    2. 「生データパラメータ」というタイトルのウィンドウが開きます。このウィンドウで、各 .aim ファイルに対して生成されるヘッダー.txtファイルの情報に続くパラメーターを入力します。[ データ タイプ] で、[ヘッダー] に [16 ビット ] を選択し、[画像データがバイト オフセットで始まる] の後の番号を付けます。また、寸法とボクセル サイズは、ヘッダー .txt ファイルの情報を使用して設定します。パラメータが完成したら、[ OK]を押します。
    3. .aim から .bmp への変換が必要な場合は、メインパネル>プロジェクトビューで .aim オブジェクトを右クリックし、 [変換] > [画像タイプの変換] オプションを選択します。[プロパティ] で、[出力の種類] として [8 ビット] を選択します。[適用] を選択します。
    4. 新しい 8 ビット オブジェクトを右クリックします。[ 名前を付けて保存] を選択します。 [.bmp ] を選択して保存します。
    5. .bmpファイルを開くには、[ ファイル] > [データを開く ] を選択し、ファイルを選択します。その後、画像のパラメータを含むウィンドウが開きます。パラメータを確認し、正しければ受け入れます。
    6. プロジェクトビュー>メインパネルで、.bmpファイルの名前で新しいオブジェクトが作成されます。このオブジェクトを右クリックし、[オルソ スライス]オプションを選択します。[プロパティ]で、表示するスライス番号と方向平面を選択します。
  2. ヘッド全体の3Dボリュームを取得します。
    1. メインパネル>プロジェクトビューで、画像オブジェクトを右クリックします。「作成」>「インタラクティブしきい値」オプションを選択します。[プロパティ] で、[最小 RGB] と [最大 RGB] の値を変更して、動物の頭に対応する画像の部分を選択します。[適用] を選択します。
    2. メインパネル>プロジェクトビューで、しきい値が設定されたオブジェクトが作成されます。このオブジェクトを右クリックし、[プロパティ]で[等値面]を選択します。[プロパティ] で、サーフェスを視覚化するしきい値を選択し、[適用] をクリックします。この閾値は経験的に選択する必要があり、その後、異なる値を調べる必要があるかもしれません。
  3. ポイント座標のデジタイズ
    1. 3D ポイント座標は、スライスまたは抽出されたサーフェスに基づいてデジタイズできます。最初のオプションでは、画像オプションを右クリックして[スライス]を選択します。「移動」(Translate) で、軸平面内の目的のスライスを選択します。平面が正しく配置されていない場合は、[プロパティ]の[オプション]>[回転]をクリックして、正しい方向を設定します。
    2. ランドマークをデジタイズするには、プロジェクトビュー>メインパネルで右クリックし、オブジェクトを作成>ポイントと線>ランドマークを選択します。新しい Object Landmarks を右クリックし、[Landmark View] を選択します。ランドマーク ビューの [サイズ] でポイントのサイズを変更します。[プロパティ]でランドマークを追加するには、[編集モードで追加]オプションを使用します。
      注:新生児の場合、脳の軸曲線と矢状曲線の周りの一連のランドマークとセミランドマークが以前に発表されました14。
    3. まず、嗅球の最も吻側と皮質の最も尾側の点と交差する軸面を選択します。
    4. [Object Landmarks] を選択し、[プロパティ] で [Landmark Editor] を選択します。矢印を使用して、ポイントをデジタイズする場所をクリックします。
    5. 提案されたランドマークのセットでは、選択した軸平面で 24 個のポイントがデジタイズされます。正中線にある脳の最も尾側の点にある最初のものをデジタル化します。
    6. 中脳と皮質の交点にある次のランドマークまで、曲線(セミランドマーク)の周囲に均等に分布した5つのポイントをデジタイズします。
    7. 次に、皮質の周りの8つの点(セミランドマーク)をデジタイズします。
    8. 皮質と嗅球の交点にある新しいランドマークをデジタイズします。次に、嗅球の周りの4つの点(セミランドマーク)をデジタイズします。
    9. 正中線の嗅球の最吻側にある新しいランドマークをデジタイズします。次に、両方の嗅球の間にある2つの点(セミランドマーク)をデジタイズします。
    10. 正中線の嗅球の最も尾側にある新しいランドマークをデジタイズします。
    11. 矢状点の場合は、脳の右側に、脳が最も尾側が目立つ傍矢状面にスライスを確立します。
    12. 提案されたランドマークのセットでは、選択した傍矢状面で 33 個のポイントがデジタイズされます。間脳と後脳の交点にある最初のものをデジタル化します。次に、脳の腹側限界にある9つのポイント(セミランドマーク)をデジタル化します。
    13. 嗅球の最も吻側にある新しいランドマークをデジタイズします。次に、嗅球の周りの3つのポイント(セミランドマーク)をデジタイズします。
    14. 嗅球と皮質の交点にある新しいランドマークをデジタイズします。次に、嗅球の周りの3つのポイント(セミランドマーク)をデジタイズします。
    15. 嗅球と皮質の交点にある新しいランドマークをデジタイズします。次に、皮質の周りの7つの点(セミランドマーク)をデジタイズします。
    16. 大脳皮質と中脳の交差点にある新しいランドマークをデジタイズします。次に、皮質の周りの7つの点(セミランドマーク)をデジタイズします。
    17. 大脳皮質と中脳の交差点にある新しいランドマークをデジタイズします。次に、中脳の周りの6つの点(セミランドマーク)をデジタイズします。
    18. 中脳と小脳の交差点にある新しいランドマークをデジタイズします。次に、小脳の周りの2つの点(セミランドマーク)をデジタイズします。
    19. 小脳と後脳の交点にある新しいランドマークをデジタイズします。
    20. デジタイズされたポイントを保存します。 オブジェクトのランドマーク を右クリックし、[ データの保存]オプションを選択します。
  4. ポイント座標を解析します。
    注:一連の試験片のポイント座標がデジタル化されると、幾何学的形態測定ツールを使用して基本的な分析を実行し、サイズ(重心サイズ)と形状変数(形状またはプロクラステス座標)を取得できます。分析は、統計分析に特に適した無料のオープンソフトウェア環境で行われます。
    1. メモ帳を使用して、デジタル化されたすべての標本の座標を含むファイルを作成します。このためには、https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm で説明されているように、TPS 形式に従います。
    2. 統計ソフトウェアを開きます。 [ファイル] > [ディレクトリの変更] を選択して 、.tps ファイルが保存されているディレクトリを選択します。
    3. [ パッケージ] > [パッケージのインストール] を選択します。 クランミラーを1つ選択します。 geomorph を探してインストールします。
    4. コンソールに 「library(geomorph)」 と「 library(Morpho)」と入力してパッケージをロードします。
    5. コンソールに 「dataset <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps", specID="ID")」と入力して、データセットを読み込みます。
    6. コンソールに 「GPA<- gpagen(dataset)」と入力して、一般化プロクラステス分析を実行します。
    7. コンソールに 「CS<-GPA$Csize」と入力して、重心サイズを取得します。
    8. コンソールに 「ProcCoord<- GPA$coords」と入力して、プロクラステス座標を取得します。
    9. コンソールに 「plotAllSpecimens(ProcCoord)」と入力して、プロクラステス座標と平均形状をプロットします。
  5. ROIのセグメンテーション
    注:脳をセグメント化して3D再構成を取得するには、各スライスの脳組織を手動で識別します。同じ手順を、嗅球、皮質などの特定のROIに適用できます。
    1. プロジェクトビュー>メインパネルを右クリックし、ラベルフィールド>オブジェクトを作成を選択します。
    2. ラベルフィールドオブジェクトを選択し、[プロパティ]の[セグメンテーションエディタ]オプションを押します。
    3. [マテリアル] で、新しいマテリアルを追加し、必要に応じて名前を「Brain」に変更します。
    4. 「選択」で、「現在のスライス」オプションを選択して、各スライスの脳に対応する組織をセグメント化します。
    5. [ツール] にあるオプションを使用して、各スライスの脳組織を選択します。この場合、魔法の杖とブラシが最適です。
    6. 各スライスで選択範囲を作成したら、[選択範囲に追加]を押します。
    7. すべてのスライスでの選択が終了したら、メインパネルのProject Viewに戻り、Label Fieldを右クリックしてGenerate Surfaceを選択し、Applyをクリックします。
    8. サーフェスを取得したら、[ サーフェスの抽出](Extract Surface)を適用してエクスポートします。
    9. セグメント化された構造の体積を取得するには、メインパネル>プロジェクトビューで、ラベルを含むオブジェクトを選択し、右クリックして、体積率>測定と解析を選択します。次に、「適用」をクリックします。

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結果

ここでは、新生仔マウスの脳の高解像度画像を取得するための基本的なプロトコルが提示されます。頭部はルゴール溶液に浸漬した後にスキャンした。サイズが小さいにもかかわらず、嗅球、皮質、中脳、小脳、後脳などの主要な脳の解剖学的構造を区別することができます(図1)。

これらの画像を入力として使用して、さまざまな分析を実行できます。2つの異なる解剖学的平面のランドマークとセミランドマークのセットがデジタル化されました。 図2に見られるように、点は脳の境界に沿って選択された平面に配置されています。デジタイズが終了すると、ポイントの座標を.txtファイルで読み取ることができます(図3)。ポイントのデジタイズの目的は、幾何学的形態解析でさらに使用できる生の座標を取得することでした。提示されたプロトコルは単一の標本に焦点を当てており、形態測定分析はより大きなサンプルに適していますが、同じポイントのセットを使用して得られた結果...

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ディスカッション

この研究では、造影剤を用いたマイクロCTを用いてマウスの新生児脳組織をスキャンするための簡潔なプロトコルが紹介されています。さらに、定量的および定性的な出力を得るための簡単な手順が含まれています。これらの方法に基づいて、さらに代替的または補完的な分析を実行できます。

プロトコルに示されているように、マイクロCT画像はさまざまな方法で分析できます。これまでの研究で、私たちのグループは、点の座標をデジタル化し、幾何学的形態測定技術を適用することにより、マウスの周産期脳のサイズと形状の変化を推定しました8,14。座標のデジタイズは、単純なユークリッド距離推定を使用して線形計測値を取得する場合にも役立ちます。これは、脳とROIのセグメンテーションから得られるボリュームとともに、従来の形態測定評価のための貴重なインプットです。

ここで紹介するプロトコールは、私たちが使用したような ex vivo の小さ...

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開示事項

著者らは、競合する利害関係はないと宣言しています。

謝辞

Wei Liu氏の技術支援に感謝します。この研究は、ANPCyT PICT 2017-2497 および PICT 2018-4113 から資金提供を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
 &マイクロ;CT 35Scanco Medical AGScancoは  &CT35はもう。彼らの最小のスキャナーは現在 &マイクロ;CT45 
AvizoVisualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 MiceBioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubesDaiggerCH-CI4610-1856
フラックスキャビネットEscoAC2-458 
ガラスビーカー GlasscoGL-229.202.10
びんSimaxCFB017
ガラス漏斗HDAVI1108
HClCarlo Erba403872フラックスキャビネットの下で操作し、個人用保護具(マスク、ガラス、手袋)を使用しますI
2Cicarelli804211I2KIを準備するときは、フラックスキャビネットの下で操作し、個人用保護具(マスク、ガラス、手袋)を使用しますKI
シカレリPA131542.1210I2KIを準備するときは、フラックスキャビネットの下で操作し、個人用保護具(マスク、ガラス、手袋)を使用してください磁気
攪拌アルカノ4925
NaOHチカレリ1580110フラックスキャビネットの下で操作し、個人用保護具(マスク、ガラス、手袋)を使用しますオー
ビタルシェーカーBiomintBM021
パラホルムアルデヒド バイオパック2000959400フラックスキャビネットの下で操作し、個人用保護具(マスク、ガラス、手袋)を使用しますパ
トンスパチュラGlasscoGL-377.303.01
PBSバイオパック2000988800
プラスチックパスツールピペットDaigger9153
RRプロジェクトRのパッケージジオモーフは、プロトコル(https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
はさみ Belmed
ジ化ナトリウムバイオパック2000163500
温度計Daigger7650
ガラスで使用されました。ア

参考文献

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