プロバイオティクス菌の噴霧乾燥プロセス開発と製品品質評価

サマリー

このプロトコルは、噴霧乾燥プロバイオティクス製品の製造および物理化学的特性評価に関連するステップを詳述しています。

要約

プロバイオティクスとプレバイオティクスは、その健康上の利点のために、食品および製薬業界にとって非常に興味深いものです。プロバイオティクスは人間と動物の健康に有益な効果をもたらすことができる生きたバクテリアであり、プレバイオティクスは有益な腸内細菌を養う栄養素の一種です。粉末プロバイオティクスは、摂取の容易さと実用性、および栄養補助食品としての食事への組み込みのために人気を博しています。ただし、高温はプロバイオティクス細菌を不活性化するため、乾燥プロセスは細胞の生存率を妨げます。これに関連して、この研究は、噴霧乾燥プロバイオティクスの製造と物理化学的特性評価に関連するすべてのステップを提示し、保護剤の影響を評価することを目的としていました(模擬スキムミルクとイヌリン:マルトデキストリン関連)粉末収量と細胞生存率の増加における乾燥温度。結果は、シミュレートされたスキムミルクが80°Cでより高いプロバイオティクス生存率を促進することを示しました。 この保護剤を使用すると、入口温度が上昇する限り、プロバイオティクスの生存率、水分含有量、および水分活性(Aw)が低下します。プロバイオティクスの生存率は、乾燥温度によって逆に低下します。120°Cに近い温度で、乾燥したプロバイオティクスは約90%の生存率、4.6%w / wの水分含有量、および0.26のAwを示しました。製品の安定性を保証するのに十分な値。これに関連して、粉末調製物における微生物細胞の生存率と貯蔵寿命、および食品加工および保管中の生存を確保するために、120°Cを超える噴霧乾燥温度が必要です。

概要

プロバイオティクスとして定義されるためには、食品(またはサプリメント)に添加された微生物は生きたまま消費され、宿主の胃腸管での通過中に生存し、有益な効果を発揮するのに十分な量の作用部位に到達できなければならない^1,2,7。

プロバイオティクスへの関心の高まりは、免疫系の刺激、血清コレステロール値の低下、有害な微生物に対する作用による腸のバリア機能の強化など、プロバイオティクスが人間の健康に与えるいくつかの利点、および過敏性腸症候群の治療におけるそれらの有益な効果によるものです。 とりわけ^2,3。さらに、いくつかの研究は、プロバイオティクスが、不均衡な微生物群集が感染症を引き起こす可能性のある人体の他の部分にプラスの影響を与える可能性があることを実証しています^3,4,5。

プロバイオティクスが治療的に効果的であるためには、製品には消費時に10^{6-10 7 CFU} / gの細菌が含まれている必要があります⁶。一方、イタリア保健省カナダは、食品中のプロバイオティクスの最小レベルは、それぞれ1日あたりまたは1食あたり10⁹ CFU / gの生細胞でなければならないことを確立しました⁷。有益な効果を保証するために大量のプロバイオティクスが必要であることを考えると、加工、貯蔵貯蔵、および胃腸(GI)管を通過する際の生存を保証することが不可欠です。いくつかの研究は、マイクロカプセル化がプロバイオティクスの全体的な生存率を改善するための効果的な方法であることを示しています⁸、^9、10、11。

これに関連して、プロバイオティクスのマイクロカプセル化のために、噴霧乾燥、凍結乾燥、噴霧冷却、エマルジョン、押出、コアセルベーション、および最近では流動床¹¹、^12、13、14などのいくつかの方法が開発されてきた。噴霧乾燥(SD)によるマイクロカプセル化は、シンプルで高速で再現性のあるプロセスであるため、食品業界で広く使用されています。スケールアップが容易で、低エネルギー要件11,12,13,14で高い生産歩留まりが得られます。それにもかかわらず、高温および低含水量への曝露は、プロバイオティクス細胞の生存および生存率に影響を及ぼし得る¹⁵。両方のパラメータは、培養を事前に適応させ、噴霧乾燥条件(入口および出口温度、微粒化プロセス)および封入組成物を最適化するための培養年齢および条件の影響を決定することによって、所与の菌株について改善することができる⁸、¹⁴、¹⁶、^17、18。

カプセル化溶液の組成も、悪環境条件に対する保護のレベルを定義できるため、SD中の重要な要素です。イヌリン、アラビアガム、マルトデキストリン、およびスキムミルクは、プロバイオティクス乾燥のためのカプセル化剤として広く使用されています5,17,18,19。イヌリンは、強力なプレバイオティクス活性を示し、腸の健康を促進するフラクトオリゴ糖です¹⁹。スキムミルクは、乾燥した細菌細胞の生存率を維持するのに非常に効果的であり、良好な再構成特性を有する粉末を生成する¹⁷。

ラクチプランティバチルス・パラプランタルムFT-259は、プロバイオティクス形質^20,21に加えて、バクテリオシンを生成し、抗リステリスター活性を示す乳酸菌です。15°Cから37°^C20まで増殖し、恒常性体温に適合する通性ヘテロ発酵棒状グラム陽性菌です。この研究は、噴霧乾燥プロバイオティクス(L. paraplantarum FT-259)の製造と物理化学的特性評価に関与するすべてのステップを提示し、保護剤と乾燥温度の影響を評価することを目的としています。

プロトコル

1.プロバイオティクス細胞の生産

1. デマンロゴサとシャープ(MRS)ブロスを準備します。
2. MRSブロスで目的の培養物の1%(v / v)を再活性化します(ここでは、 ラクチプランティバチルスパラプランタルム FT-259を使用しました)。
3. 適切な温度で24時間インキュベートします(37°Cを使用しました)。

2.細菌を培養物から分離します

1. 50 mLコニカルチューブを使用して、細菌培養物を7,197 x g で4°Cで5分間遠心分離します。手順の前にチューブの重量のバランスをとることが重要です。
2. ピペットを使用して、上清を取り除き、適切な容器に捨てます。ペレットをリン酸緩衝液(pH 7)で洗浄し、溶液を均質化する。
3. 前述のように遠心分離プロセスを繰り返します。
4. ペレットを得るには、ピペットを使用して上清を除去し、適切な容器に廃棄します。

3.乾燥助剤の添加

1. イヌリン:マルトデキストリン混合物と模擬スキムミルクの2つの乾燥助剤組成物(保護剤)の組み合わせを選択します(表1)^22,23。
2. 5 gのイヌリンと5 gのマルトデキストリンを量って、保護剤の最初の組み合わせを得ます。
3. 3 gのイヌリン、3 gのラクトース、0.4 gのコロイド状SiO 2、および3.6 gのホエイタンパク質を量って、保護剤の₂番目の組み合わせを得ます。
4. 各乾燥助剤を超純水(1:10)に加え、可溶化されるまで磁気攪拌を行います。
5. 保護剤と水が均一であることを確認してから、プロバイオティクスペレットを混合物に加え、20分間適度に攪拌します。

乾燥助剤	イヌリンとマルトデキストリン	模擬スキムミルク
マルトデキストリン	5%	-
ホエイプロテイン	-	3.60%
乳糖	-	3%
イヌリン	5%	3%
コロイド状SiO2	-	0.40%

表1:乾燥助剤の組成。

4.噴霧乾燥

1. スプレードライヤー(SD)の電源を入れ、乾燥ガス流量、入口乾燥温度、アトマイザーガス流量と圧力を次のように設定します。
   入口温度:80°C
   空気流量:60 m³/h
   送り速度:4グラム/分
   霧化流量:17リットル/分
   霧化圧力:1.5キログラム/cm²
   アトマイザーノズルの直径:1 mm
2. 保護剤組成物を調製し、濃縮プロバイオティクスペレットを添加する。
3. 蠕動ポンプを通してプロバイオティクス組成物(細胞と保護剤)の供給を開始します。
4. タイマーを開始し、溶液がアトマイザーに入ったら製品収集容器を置きます。
5. 5分ごとに出口温度を登録して、起こりうる温度不安定性を追跡します。
6. すべてのプロバイオティクス組成物がSDに供給されたら、タイマーを停止します。
7. 生成物回収容器を秤量して、システムに供給される組成物の量および回収された乾燥生成物の量を決定し、乾燥機内の質量バランスを通じて乾燥収率(生成物回収)を計算する。
8. 模擬スキムミルクを使用して、5つの異なる噴霧乾燥温度(80°C、100°C、120°C、140°C、および160°C対出口温度59°C、70°C、83°C、96°C、および108°C)を設定することにより、プロバイオティクス細胞の生存率に対する温度の影響を評価します。

5. 粉末の特性評価

1. 製品の含水率
   1. 乾燥製品100 mgを正確に計量し、カールフィッシャー装置の滴定容器に入れます。
   2. 開始ボタンを押して、サンプル中に存在する水のバイアンペロメトリック滴定を開始します。
2. 水分活性
   1. 乾燥製品0.6gを湿度計のサンプルコンパートメントに25°Cで計量します。
   2. 機器カバーを閉じます。
      注意: テストは自動的に開始され、サンプルがサンプルコンパートメント内の平衡蒸気圧に達すると停止します。

6.プロバイオティクスの生存率

1. 事前に調製した細菌懸濁液を9 mLのペプトン水(0.1%、v / v)で希釈します。
2. 完全に分散するまで渦。
3. 9 mLの生理食塩水(0.9%NaCl)で連続10進希釈(1:10)を実行します。
4. 希釈液をMRS寒天プレートに播種し、37°Cで24〜48時間インキュベートします。
5. 拡大レンズ付きのコロニーカウンターを使用してコロニー形成単位(CFU / g)をカウントします。
6. 次の式に従って、乾燥製品のプロバイオティクス生存率を計算します。
   EE (%) = (N∕N_o) × 100
   ここで、 N は噴霧乾燥後の生細胞数であり、 No_は 噴霧乾燥前の細菌細胞数である。
7. 生細胞数を製品分散液のCFU/gで表します。

7.データ分析

1. 得られたデータを統計ソフトで集計し、多重比較検定(ANOVA)を用いて分析を行います。

結果

この研究では、L. paraplantarumは、食品グレードのカプセル化剤(イヌリン:マルトデキストリンおよび模擬粉乳)を使用してSDによってカプセル化され、細菌細胞の生存率を維持する上で高い製品品質と有効性を示しました^17,19。

80°CでのプロバイオティクスのSDの結果は、異なる保護剤システム(イヌリン:マルトデキストリンおよび模擬スキムミルク)がプロバイオティクス細胞の効率的な保護を促進し、生存率がそれぞれ95.1%および97.0%であることを示しました。生成物収率は、両方の保護剤システムで50%w/w近くであり、模擬スキムミルクではわずかに優れており、外観と流動性に優れた製品を生成しました。次に、模擬スキムミルクと組み合わせたプロバイオティクス組成物を、80°Cから160°Cの高温での噴霧乾燥にかけました(図1)。

予想通...

ディスカッション

L.パラプランタルム FT-259はグラム陽性の棒状細菌であり、抗リステリア活性を有するバクテリオシンの生産者であり、高いプロバイオティクスポテンシャル^{を有する20}。Son et ^al.24 は以前、 L. paraplantarum 株の免疫賦活剤および抗酸化能力を実証した。さらに、それらは、人工胃および胆汁条件下での安定性、抗生物質に対する感受性、腸細胞への結合などの特性を備えた、大きなプロバイオティクスの可能性を秘めています。さらに、それらは胃腸管に悪影響を及ぼす可能性がある代謝産物を産生しない。さらに、ChoiとChang²⁵は、 L. plantarum EMを研究し、その胆汁酸塩加水分解酵素活性と細胞表面結合能力に基づいてコレステロール低下の可能性を報告しました。 L. plantarum EMは、酸ストレスや胆汁ストレスに対する耐性に加えて、病原体に対する抗菌活性や抗生物質耐性も示し、プロバイオティクスとしての...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Aqua Lab 4TEV	Decagon	Devices-Water	Activity meter
Centrifuge (mod. 5430 R)	Eppendorf-Centrifuge		Colloidal
SiO2 (Aerosil 200)	Evokik	7631-86-9	乾燥補助
剤 チコリ由来のフラクトオリゴ糖	Sigma-Aldrich	9005-80-5	乾燥補助
GraphPad Prism (version 8.0)ソフトウェア	GraphPad Software	-	米国カリフォルニア州サンディエゴ
Karl Fischer 870 Titrino Plus	Metrohm-Moisture		content
Lactose	Milkaut	63-42-3	乾燥助剤
マルトデキストリン	イングレディオン	9050-36-6	乾燥助剤
Milli-Q	Merk	-	超純水システム
MRS 寒天	オキソイド		-培養培地
MRS ブロス	オキソイド	-	培養培地
OriginPro (バージョン 9.0) ソフトウェア	OriginLab	-	ノーサンプトン、マサチューセッツ州、米国
噴霧乾燥機 SD-05	Lab-Plant Ltd	-	噴霧乾燥機
ホエイプロテイン	Arla Foods Ingredients S.A.	91082-88-1	乾燥助剤