C. elegans芝生回避アッセイのためのスマートフォンベースのイメージング法

Summary

この記事では、スマートフォンや発光ダイオード(LED)ライトボックスなどのすぐに利用できるアイテムを使用して、 Caenorhabditis elegansの芝生回避行動を記録する簡単で低コストの方法について説明します。また、ビデオファイルをカウントしやすい形式に処理するためのPythonスクリプトも提供しています。

Abstract

有毒または病原性の細菌にさらされると、線虫 Caenorhabditis elegansは 、ワームが徐々に食料源を離れ、細菌の芝生の外に留まることを好む、学習された芝生回避行動を示します。このアッセイは、有害な条件に適切に反応するために外部または内部の手がかりを感知するワームの能力をテストする簡単な方法です。単純なアッセイですが、特に複数のサンプルではカウントに時間がかかり、一晩にわたるアッセイ時間は研究者にとって不便です。長期間にわたって多くのプレートをイメージングできるイメージングシステムは便利ですが、コストがかかります。ここでは、 C. elegansにおける芝生回避を記録するためのスマートフォンベースのイメージング手法について述べる。この方法では、スマートフォンと発光ダイオード(LED)ライトボックスのみが透過光源として機能します。無料のタイムラプスカメラアプリケーションを使用すると、各電話は最大6枚のプレートを撮影でき、芝生の外でワームを手動でカウントするのに十分なシャープネスとコントラストを備えています。結果のムービーは、毎時10秒のオーディオビデオインターリーブ(AVI)ファイルに処理され、その後、カウントしやすいように各プレートを表示するようにトリミングされます。この方法は、回避欠陥の検査を検討している人にとって費用対効果の高い方法であり、他の C.エレガンス アッセイに拡張できる可能性があります。

Introduction

C. elegansを研究することの多くの利点の中で、その単純な神経系は、遺伝的および細胞レベルでの変化がネットワーク機能と行動出力にどのように影響するかを研究する機会を提供します。ニューロンの数が限られているにもかかわらず、C.エレガンスは広範囲の複雑な行動を示します。これらの1つは芝生回避であり、細菌性線虫は細菌の芝生を離れることによって有害な食料源に反応します。C.エレガンスは、病原性細菌の芝生^1,2,3、毒素を産生する細菌の芝生、または毒素をスパイクする細菌^の芝生1,4、さらには標的遺伝子ノックダウンがワームの健康に有害であるRNAi発現細菌^4,5さえも避けます。研究によると、ワームは病原菌によって生成された代謝物などの外部の手がかりに反応することが示されています^1,6、または食物がそれらを病気^にしていることを示す内部の手がかり^4,7。これらの手がかりは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路やトランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)経路などの保存されたシグナル伝達経路を介して処理され、腸と神経系の間の通信を必要とします⁴、^6、7、8。

アッセイは単純ですが、学習された行動は何時間にもわたって、しばしば一晩で進行します。離脱できない変異体もいますが、その場合、ある時点でのスコア回避で欠陥を実証するのに十分ですが、多くの変異体は最終的に去りますが、出てくるのが遅くなります。これらの場合、ワームの動きは数時間ごとに追跡する必要があり、一晩で行うのは難しい場合があります。カウント自体にも時間がかかり、プレート間にラグタイムが生じるため、同時にテストできるプレートの数が制限されます。イメージングセットアップを使用して、アッセイの全期間にわたって多くのプレートを同時に記録することは非常に便利ですが、研究室の資金調達状況によっては、セットアップのコストが法外なものになる可能性があります。

これに対処するために、スマートフォンを使用して回避アッセイを記録する非常に簡単な方法を考案しました。各電話は、最大6つのアッセイプレートのタイムラプスビデオを録画できます。透過光を提供するために、オンラインで簡単に購入できる発光ダイオード(LED)ライトボックスを使用しています。アッセイプレートは、中空の長方形のトンネルで支えられた高架プラットフォームに配置され、入射光を集束させ、コントラストを作り出します。また、ビデオをオーディオビデオインターリーブ(AVI)ファイルに変換するPythonスクリプトも提供しており、各時間ポイントの10秒のクリップを表示します。その後、ビデオは個々のプレートにトリミングされ、手動カウントに使用するために個別のファイルに保存されます。

この方法は、ほとんどの人がすぐに利用できるアイテムを使用して、非常に使いやすい低コストの手順を提供します。ここでは、ヒト病原体緑膿菌(PA14)に対する十分に確立された芝生回避アッセイを使用する方法について説明し、そのプロトコルは以前に説明されています^2,9。最後に、他のC.エレガンス行動実験に適用したい人のために、イメージング方法の考慮事項と制限についてもレビューします。

Protocol

1.撮像装置のセットアップ(図1A-E)

1. 次の最小要件のスマートフォンカメラが利用可能であることを確認してください。
   12 メガピクセル (MP) カメラ
   1080p解像度のビデオ
   5 GBのストレージスペース(20分のビデオは3〜4 Gbです)
   アプリケーションストアのタイムラプスビデオアプリ(無料のアプリケーションが利用可能)
2. LEDライトボックスを、アッセイが行われる25°Cインキュベーターの一番下のラックに置きます。
3. LEDライト表面の点線パターンを隠すには、2枚のティッシュを広げてLEDボックスの表面全体をカバーします。
4. 試験片用の高架ステージを作成します(図1A、D)。高架ステージは、中空の長方形のトンネルで支えられた透明なプラスチックシートです。トンネルは集光器のように機能し、光を集束させ、試料とのコントラストを高めます(図1C)。光の散乱を最小限に抑えるために、トンネルの壁がやや暗くなっていることを確認してください。この研究では茶色の紙箱を使用しました。トンネルの寸法は5.5センチメートル×17センチメートル×4.5センチメートル(幅×長さ×高さ)です。LEDライトボックスは最大5つのトンネルに適合します。
5. ステージの上に別のラックを配置して、録音用の電話機を配置します(図1B、E)。各電話機は3〜6枚のプレート(3枚のプレートの1〜2列)を記録するため、それに応じてラックの高さを調整します。これは、標本の約15 cm上になります(図1B)。
6. インキュベーター内に電源タップを入れて、一晩の録音中に電話を接続します。

2. バッファーと培地の調製

1. 蒸留H2O1LにKH2PO43g、Na2HPO46g、NaCl5gを添加してM9緩衝液を調製し、₁₂₁°Cで20分間オートクレーブ滅菌する。バッファーを冷却し、1 mLの1 M MgSO₄を加えます。
2. 108.3gのKH 2 PO 4および35.6gのK 2 HPO 4を1 LのH₂Oに添加することにより、1 MKPO₄バッファーを調製し、KOHを添加してpHを6.0に調整する。オートクレーブ滅菌で滅菌します。
3. 1 mLの漂白剤、0.4 mLの1 M NaOH、および2.6 mLのH₂Oを混合することにより、ワーム漂白溶液を調製します。
4. 線虫増殖培地(NGM)寒天プレートを準備します。
   1. 3 Lフラスコに3 gのNaCl、2.5 gのバクトペプトン、および17 gのバクト寒天を加えます。975mLの蒸留水を加え、攪拌子を挿入します。
   2. オートクレーブ滅菌後、55°Cに冷却し、コレステロール1 mL(エタノール溶液5 mg/mL)、1 M CaCl₂ 1 mL、1 M MgSO 4 1 mL、および1 M KPO₄バッファー(pH 6.0)25 mLを加えます。よくかき混ぜます。6 cmのプレートに注ぎます。プレートを少なくとも2日間乾燥させます。
5. NGM寒天プレートにOP50大腸 菌 を播種し、OP50の一晩培養物を約1mLピペッティングして細菌の芝生を形成します。使用する準備ができるまで室温(RT)で放置します。

3. ハイペプトンNGMプレートの調製(PA14用)

注:これらのプレートは、アッセイの少なくとも5日前に作成する必要があります。

1. NGMに0.35%ペプトンを含有させます。0.3 gのNaCl、0.35 gのバクトペプトン、および1.7 gのバクト寒天を250 mLの三角フラスコに混合します。97.5mLの蒸留水を加え、攪拌子を挿入します。
2. フラスコの口をアルミホイルで覆い、オートクレーブを121°Cで20分間放置する。
3. 55°Cまで冷却し、コレステロール0.1 mL(エタノール溶液5 mg/mL)、1 M CaCl₂ 0.1 mL、1 M MgSO 4 0.1 mL、および1 M KPO₄バッファー(pH 6.0)2.5 mLを加えます。よくかき混ぜます。
4. 高ペプトンNGMを35 mmのペトリ皿に注ぎます。
5. プレートを少なくとも2日間乾燥させます。

4.漂白によるワームの同期

注:このステップは、アッセイの3日前に開始してください。

1. 妊娠した成虫のプレートを取り、M9バッファーでプレートを洗浄して1.7 mLマイクロチューブに集めます。
2. できるだけ多くの液体を取り除き、400μLの漂白液を加えます。成虫の体が壊れて卵を放出するまで、断続的な渦で約4〜5分待ちます。
3. M9バッファーを追加してマイクロチューブの残りの部分を満たし、漂白溶液を希釈します。最高速度(12,000〜13,000 x g)で1〜2秒間回転します。上清を除去し、M9バッファーでさらに3回洗浄します。
4. 卵をM9バッファーを含む空の35mmペトリ皿に移します。卵を20°Cで一晩孵化させます。 食物がない場合、孵化したワームはL1幼虫期に逮捕し、すべての虫の発生段階を同期させます。
   注意: 35 mmのペトリ皿をゼラチン溶液(オートクレーブ水中の0.05%ゼラチン)でコーティングすると、卵が底にくっつくのを防ぎ、卵の損失を最小限に抑えることができます。
5. 翌日、L1ステージワームをOP50シードNGMプレートに移します。
6. ワームがL4幼虫期に達するまで、ワームを20°Cで53〜54時間インキュベートします。

5.細菌の調製(緑膿菌、PA14)

注:アッセイの4日前にこのステップを開始します。

1. 抗生物質を含まないLuria Bertani(LB)寒天プレート上で-80°Cからストリーク解凍した細菌を、37°Cで一晩インキュベートした。
   注意: 常に新鮮なバクテリアを使用してください。縞模様のプレートは、4°Cで1週間以内保管してください。
2. 単一のコロニーを3 mLのキングスブロスに接種し、37°Cの振とうインキュベーターで一晩増殖させます。
3. 翌日、一晩培養液7 μLをハイペプトンNGMプレートに播種し、37°Cで24時間インキュベートします。
4. 播種したプレートをRTに移動し、使用前にさらに24時間インキュベートします。準備ができたら、次の24時間以内にプレートを使用します。

6.録音の準備

注:アッセイの直前にこれを行います。

1. スマートフォンを電源コンセントに接続されている電源タップに接続します。録音中に電話がロック画面に戻らないように、自動ロック設定を無効にしてください。
2. タイムラプスカメラアプリを開き、タイムラプス間隔を2秒に設定します。ビデオ品質を1080fpsで30pに設定します。
3. 画面を上に向けてスマートフォンを置き、背面カメラで録画します。画面をチェックして、紙箱のトンネルが視野内に収まることを確認します。

7.芝生回避アッセイ

1. プラチナワイヤーピックを使用して、30個の同期L4ステージワーム(L53から54〜1時間)をPA14プレートに移します。バクテリアの芝生の真ん中にワームを置きます。この研究の各条件について、2つのプレートがテストされました(すなわち、条件ごとに60匹のワーム)。
2. 蓋を下に向けて、記録装置の高架ステージに2枚のプレートを置きます。寒天のある側はカメラに向かって上を向きます。
3. スマートフォンの画面で、プレートがある場所をタップすると、カメラがアッセイプレートに焦点を合わせることができます。カメラがそれを使用して正しく焦点を合わせることができるので、プレートにラベルを付けたり書いたりすると便利です。
   注意: プレートの底に書いても、端に向かっている限り、ワームのイメージングを妨げません。幸いなことに、ワームは去った後も芝生の近くにとどまるので、芝生のすぐ周りの領域だけを遮るもののないビューが必要です。
4. 録音を開始します。
5. 録音が開始されたら、ステージにプレートを追加します。ピッキングによってワームを転送するのにかかる時間のために、プレート間にかなりのラグタイムがあるかもしれません。各条件が開始時にカウントできるように、その後のラグ タイムに注意してください。
6. ステージに置かれた最後のプレートセットから20時間記録します。最終的なタイムラプスビデオでは、20時間の録画により20分の長さのビデオになります。
   注:アッセイ後、少なくとも最初の数回は、プレートから直接ワームを数えることは価値があるかもしれません。これをビデオイメージングで取得した値と比較して、同様の数値が得られることを確認できます。

8. Pythonスクリプトを使用したビデオの処理

1. 動画ファイルをパソコンに転送して処理します。拡張子はMOV(iPhone)またはMP4ファイル(アンドロイド)になります。
2. Python コードを使用してビデオを処理します。コードは github.com/khyoon201/wormavoid にあります。
3. Python スクリプトを実行するには、ビデオファイルを変換するためのツールである ffmpeg (インストールの手順は Web サイト、ffmpeg.org/download にあります)、および Python パッケージ os、pandas、tkinter、ffmpeg-python がコンピュータにプレインストールされていることを確認してください。
4. extract_frame.pyスクリプトを使用して、各プレートの寸法と座標を見つけます。
   1. extract_frame.py スクリプトを実行します。コンピューターに保存されているビデオファイルを選択するウィンドウが表示されます。実行が完了すると、同じ名前のjpegファイルが同じディレクトリに表示されます。
   2. jpeg ファイルを ImageJ (imagej.org) で開きます。
   3. メニューから 、「測定>セット」を選択します。[ ディスプレイラベル] チェックボックスがオンになっていることを確認します(図2A)。ウィンドウを閉じます。
   4. 直線ツールを使用して、プレートを横切る線を描画し、メニューから「解析>計測」を選択して、プレートの直径を測定します。ビデオが1080pの場合、各プレートの幅は約480ピクセルになります。この情報を書き留めて、[結果] ウィンドウを閉じます。
   5. マルチポイントツールを使用して、各プレートの左上にポイントをマークします。これらのポイントは、トリミングされたビデオの左上隅になります(図2B)。順序は重要です。プレートが開始された順にマークします。すべてのプレートのポイントを作成したら、メニューから[解析>測定]を選択します。ポイントの X 座標と Y 座標を含む計測値が [結果] ウィンドウに表示されます。
   6. 複数のビデオを処理するには、他のjpegファイルを使用してImageJでこのプロセスを繰り返します。すべての X 座標と Y 座標が同じ 結果 ウィンドウに一覧表示されます。
   7. [結果] ウィンドウを csv ファイルに保存します。ファイルは、ムービーファイルと同じディレクトリに保存する必要があります。
5. 各プレートの開始時間を見つけます。
   1. コンピューターまたは電話でムービーを再生し、カメラの下に置かれたプレートの各セットの開始時間をメモします。
   2. 座標を含む結果.csvファイルを開き、「開始」列を追加します。個々のプレートに対応する各行について、「開始」列の下に適切な開始時刻を秒単位で入力します(たとえば、開始時刻が0:00:08の場合は8と入力します)。セーブ。
      注: 列名は、トリミングとトリミングのために次のスクリプトで認識されるために、"start" (小文字、引用符なし) である必要があります。
6. ビデオをトリミングしてトリミングします。
   1. crop_n_trim.py スクリプトを実行します。
   2. プロンプトが表示されたら、[ 結果.csv ] ファイルを選択します。
      注: Results.csv ファイルとすべてのムービー ファイルが同じディレクトリにあることを確認してください。
   3. プレートの寸法を入力します。前にメモしたピクセル値を入力します。
      注:スクリプトは 、Results.csv ファイルの各行を読み取り、「ラベル」列のファイル名を読み取って正しいムービーファイルを見つけ、「X」列と「Y」列に示されている座標に従ってトリミングします。各プレートの開始時間は、「開始」列に示されている時間によって決定されます。スクリプトの実行が終了すると、ムービーと同じ名前のフォルダが表示され、その後に開始時間(「Movie1_8」など)が表示され、アッセイの各時間ポイントに対応する10秒のビデオが保存されます。

9. ImageJを使用した手動カウント

1. ImageJ で各 AVI ファイルを開きます。
2. 芝生の外に見えるワームを数えます。あるフレームで重なっているワームは、通常、正しくカウントできるように別のフレームで離れて移動します。
3. 各時点の占有率を計算します。
   占有率=(ワームの総数-芝生の外のワームの数)/ワームの合計
   注:ビデオ中にワームは芝生に出入りしますが、結果が大幅に変わることはありません。平均と思われる数、または正確な時間ごとの時点(ビデオの5秒)でのワームの数を使用してみてください。

Results

スクリプトによって生成される最初のビデオは、アッセイの開始から1時間です。ワームが芝生内でアッセイを開始するため、0時間のビデオは保存されないため、占有率は常に100%です。

野生型N2ワームをnpr-1変異体と比較し、その芝生回避欠陥は文献^6,10で十分に確立されています(図3A-E)。野生型に見られるように、ワームは徐々に細菌の芝生を離れて外にとどまります(図3A、B)。結果をグラフにプロットし、時間の経過に伴う占有率の変化を示します(図3B)。外のワームはビデオではっきりと見られますが、厚いバクテリアの芝生の中のワームは区別が困難です(

Discussion

直接観察に頼るのではなく、動物の行動を画像化することは、便利であるだけでなく、視覚的な文書化を残すという利点もあります。これにより、客観的な第三者によるブラインド分析が可能になり、画像認識技術を使用した自動分析にも使用できます。利点にもかかわらず、通常提供される標準機器はコストが高いため、購入後はセットアップに専念します。

スマートフォンを使用して単純な C.エレガンスの 行動のビデオ録画を収集することには、いくつかの利点があります。技術知識への知識は最小限で、簡単かつ安価に調達できるアイテムを使用して、セットアップが非常に簡単です。もう一つの利点はスマートフォンの携帯性です-それは小さなスペースに収まることができます、そしてそれはそれ自身のストレージを持っているので、それはコンピュータに接続し直す必要はありません。これにより、スペースが非常に限られている場合でも、セットアップをどこにでも配置できます。録画したビデオファイルをコンピューターに移動すると便利です-ファイルは圧縮MPEG-4形式でエンコードされているため、ファイルはそれほど大きくありません。ファイルの...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm シャーレ	SPL	#10035
バクト寒天	BD#	214010
バクトペプトン	BD	#211677
CaCl2	DAEJUNG	2507-1400
コレステロール	バイオベーシック	CD0122
リン酸水素二カリウム (K2HPO4)	JUNSEI	84120-0350
グリセロール	バイオベーシック	GB0232
キングB ブロス	MBセル	MB-K0827
LEDライトボックス マルチパッド	Artmate	N/A	これは、トレースと描画用のUSB給電LEDライトパッドです。Artmateは韓国のブランドですが、どの検索エンジンでも「トレース用LEDライトボックス」を検索すると、他のブランドから多数のオプションがヒットするはずです。全体の寸法は約9インチ×12インチ(A4サイズ)です。たとえば、amazon US の場合: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2ブライト%2Bボックス&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1
MgSO4	DAEJUNG	5514-4400
プラスチックペーパースリーブ (透明)	Smead	#85753	少し硬さのある透明なプラスチックシートなら何でもステージとして使用できます。たとえば、Amazon US の場合: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8
二水素カリウム(KH2PO4)	JUNSEI	84185-0350
電源タップ			3台の電話と1台のLEDボックスを収容するには、少なくとも4つのコンセントが必要です。
スマートフォン	N/A	N/A	最小要件:12MPワイドカメラ、30fpsでの1080p HDビデオ録画
塩化ナトリウム(NaCl)	DAEJUNG	#7548-4100
リン酸二塩基性無水ナトリウム(Na2HPO4)	YAKURI#	31727