本研究では、植物由来の生体材料の脱細胞化、物性評価、イメージング、 in vivo 移植の方法、および足場における細胞の播種と分化の方法について詳しく説明します。記載された方法は、骨組織工学的応用のための植物ベースの生体材料の評価を可能にする。
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この記事について
サマリー
要約
植物由来のセルロース生体材料は、さまざまな組織工学用途に採用されています。 In vivo 研究では、天然由来のセルロースで作られた足場の驚くべき生体適合性が示されています。さらに、これらの足場は複数の組織に関連する構造的特徴を有しており、哺乳類細胞の侵入と増殖を促進します。脱細胞化リンゴのヒパンチウム組織を用いた最近の研究では、その細孔径が海綿骨の孔径と類似していること、および骨形成の分化を効果的にサポートする能力が実証されています。本研究では、骨組織工学(BTE)用途におけるリンゴ由来のセルロース足場の可能性をさらに検討し、in vitro および in vivo の機械的特性を評価しました。MC3T3-E1骨芽細胞をリンゴ由来のセルロース足場に播種し、骨形成能と機械的特性を評価しました。アルカリホスファターゼおよびアリザリンレッドS染色により、分化培地で培養した足場における骨形成分化が確認されました。組織学的検査では、足場全体に広範囲にわたる細胞浸潤と石灰化が示されました。走査型電子顕微鏡(SEM)により、足場の表面に鉱物凝集体が発見され、エネルギー分散型分光法(EDS)により、リン酸塩とカルシウム元素の存在が確認されました。しかし、細胞分化後のヤング率の有意な増加にもかかわらず、健康な骨組織よりも低いままでした。 In vivo 研究では、ラットの頭蓋骨に8週間移植した後、 脱細胞化リンゴ由来の足場内に細胞浸潤と細胞外マトリックスが沈着することが示されました。さらに、骨欠損部から足場を取り外すのに必要な力は、以前に報告された天然の頭蓋骨の骨折荷重と同様でした。全体として、この研究は、リンゴ由来のセルロースがBTEアプリケーションの有望な候補であることが確認されています。ただし、その機械的特性と健康な骨組織の機械的特性の相違により、低耐荷重シナリオへの適用が制限される可能性があります。耐荷重用途のリンゴ由来のセルロース足場の機械的特性を強化するために、追加の構造の再設計と最適化が必要になる場合があります。
概要
怪我や病気によって引き起こされる大きな骨欠損は、完全な再生のために生体材料移植片を必要とすることがよくあります1。骨組織の再生を改善するために設計された現在の技術では、自家移植片、同種移植片、異種移植片、または合成移植片が定期的に使用されています2。自家骨移植は、大きな骨欠損を修復するための「ゴールドスタンダード」移植方法と見なされており、患者から骨を抽出します。ただし、この移植手順には、サイズと形状の制限、組織の可用性、サンプリング部位の罹患率など、いくつかの欠点があります3。さらに、自家移植手術は、手術部位の感染、その後の骨折、サンプリング部位または再建部位での血腫形成、および術後の痛みの影響を受けやすい4。骨組織工学(BTE)は、従来の骨移植方法に代わる潜在的な方法を提供します5。構造的な生体材料と細胞を組み合わせて、新しい機能的な骨組織を構築します。BTE用の生体材料を設計する際には、マクロ多孔質構造、細胞接着を促進する表面化学、および天然の骨によく似た機械的特性を組み合わせることが重要です6。これまでの研究から、BTEに利用される生体材料の理想的な細孔径と弾性率は、グラフト部位にもよるが、そ....
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プロトコル
実験プロトコルは、オタワ大学動物管理委員会によってレビューされ、承認されました。
1.足場の準備
- マンドリンスライサーを使用して、マッキントッシュのりんご(カナダファンシー)を厚さ8mmのスライスに切ります。リンゴのスライスのヒパンチウム組織を5mmx5mmの正方形に切ります。
- 正方形のサンプルを0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に2日間入れます。
- 脱細胞化サンプルを脱イオン水で洗浄し、100 mM CaCl2中で室温(RT)で一晩インキュベートして、残りの界面活性剤を除去します。
- サンプル(足場など)を70%エタノールで30分間滅菌し、脱イオン水で洗浄し、細胞播種前に24ウェル培養プレートに入れます。
2. 細胞培養と足場播種
- MC3T3-E1サブクローン4細胞を直径10cmの細胞培養処理ディッシュに入れ、細胞培養条件(37°C、空気95%、CO25%5%の加湿雰囲気)で維持します。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したEagleの最低限の必須培地であるアルファ修飾(α-MEM)で作られた細胞培養培地を調製します。
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結果
細孔径測定、細胞分布、 in vitro での石灰化(図1 および 図2)
リンゴ組織足場の天然細胞成分の完全な除去は、SDSおよびCaCl2 で足場を処理した後に達成されました(図1A)。足場は多孔質構造を示し、共焦点顕微鏡で確認しました。画像の定量化により、平均細孔径は154μm±40μmであることが実証されました。細孔径分布は73μmから288μmの範囲であった。しかし、大部分の細孔は100μmから200μmの範囲でした(図1C)。
分化培地で4週間培養した後、細胞播種した足場は広範囲に白いミネラル堆積物を示しました(図1A)。細胞を含む足場は不透明な白色を呈し、空白の足場(播種された細胞のない足場)で.......
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ディスカッション
いくつかのin vitroおよびin vivo研究は、植物由来のセルロースの生体適合性と、組織工学におけるその潜在的な使用を実証しています14,15,16,18,19,20、より具体的には骨形成分化をホストするために20,21.本研究の目的は、BTEに対するリンゴ由来のセルロース足場の可能性をさらに調査し、これらの足場の機械的特性をin vitroおよびin vivoの両方で評価することでした。
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開示事項
利益相反に関する声明:M.L.L.、M.T.、R.J.H.、C.M.C.、I.C.およびA.P.は、BTE用途における植物由来セルロースの使用に関して、オタワ大学とSpiderwort Inc.が出願した特許出願の発明者です。M.L.L.、R.J.H.、C.M.C.、およびA.P.は、Spiderwort Inc.の金銭的利害関係を有しています。
謝辞
このプロジェクトの資金は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)(ディスカバリー助成金)と李嘉誠基金会から提供されました。MLLはオンタリオ州センターオブエクセレンスTalentEdgeプログラムから支援を受け、RJHはNSERC大学院奨学金とオンタリオ大学院奨学金(OGS)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインド | サーモフィッシャー | D1306 | DAPI |
| アリザリンレッド S | シグマ-アルドリッチ | A5533 | ARS |
| アスコルビン酸 | シグマ-アルドリッチ | A4403 | 細胞培養 |
| 塩化カルシウム | サーモフィッシャー | AA12316 | CaCl2 |
| Calcofluor ホワイト | シグマ-アルドリッチ | 18909 | |
| 歯科ドリル | 手術器具 | ||
| エタノール | サーモフィッシャー | 615095000 | |
| ウシ胎児血清 | ハイクロン研究所 | SH30396 | FBS |
| ホルマリン | シグマ-アルドリッチ | HT501128 | 10% ホルマリン |
| ゴールドナーのトリクローム染色 | シグマ-アルドリッチ | 1.00485 | GTC |
| ヘマトキシリンとエオシン染色フィ | ッシャーサイエンティフィック | NC1470670 | H&E |
| 高速共鳴共焦点レーザー走査型顕微鏡 | ニコン | Ti-E A1-R | |
| 塩酸 | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| ImageJ ソフトウェア | 国立衛生 | ||
| 灌漑生理食塩水 | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
| MC3T3-E1 サブクローン 4細胞 | ATCC | CRL-2593 | 骨芽細胞前 |
| マッキントッシュ リンゴ | カナダ 高級グレード | ||
| メタクリル酸メチル | Sigma-Aldrich | M55909 | 組織学的埋め込み |
| 最小必須培地 | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
| パラホルムアルデヒド | フィッシャーサイエンティフィック | O4042 | 4%;PFA |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
| 過ヨウ素酸 | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; Ca2+ および Mg2+ |
| Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
| スキャンなし電子顕微鏡 | 日本電子 | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
| スライドスキャナー顕微鏡 | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| ドデシル硫酸ナトリウム | ッシャーサイエンティフィック | BP166 | SDS |
| メタ重亜硫酸ナトリウム | シグマ・アルドリッチ | 31448 | |
| リン酸ナトリウム | サーモフィ | ッシャーBP329 | |
| スプレイグ・ドーリーラット | チャールズリバー研究所 | 400 | 男性 |
| 用縫合糸 | Ethicon | J494G | 4-0 |
| Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 直径 5mm |
| Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
| Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | 細胞培養 |
| Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
| ユニバーサル圧迫デバイス | CellScale | UniVert | |
| von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | 組織学 |
参考文献
- Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
- Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Bioma....
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