ブタ心血管系の機能的有効性評価のための運動試験

Summary

本プロトコルは、前臨床設定における新しい治療法の効率を評価するための心血管系の機能的能力を評価するための大型動物運動試験モデルを記載する。これは、臨床運動テストに匹敵します。

Abstract

治療の進歩にもかかわらず、心血管疾患は依然として世界中の死亡率と罹患率の最大の原因の1つです。遺伝子治療ベースの治療的血管新生は、最適な薬理学的療法および侵襲的処置にもかかわらず、重大な症状を有する患者を治療するための有望なアプローチである。しかし、多くの有望な心血管遺伝子治療技術は、臨床試験で期待を達成できませんでした。1つの説明は、有効性を測定するために使用される前臨床エンドポイントと臨床エンドポイントの不一致です。動物モデルでは、通常、組織学的切片から計算された毛細血管の数や面積など、簡単に定量化できるエンドポイントに重点が置かれてきました。死亡率と罹患率とは別に、臨床試験のエンドポイントは、運動耐容能や生活の質などの主観的なものです。ただし、前臨床エンドポイントと臨床エンドポイントは、適用された治療のさまざまな側面を測定する可能性があります。それにもかかわらず、両方のタイプのエンドポイントは、成功した治療アプローチを開発するために必要です。診療所では、主な目標は常に患者の症状を緩和し、予後と生活の質を改善することです。前臨床試験からより良い予測データを得るには、エンドポイント測定値を臨床試験の測定値とよりよく一致させる必要があります。ここでは、ブタにおける臨床的に関連するトレッドミル運動テストのプロトコルを紹介します。この研究は、(1)遺伝子治療やその他の新しい治療法の安全性と機能的有効性を評価するために使用できる豚の信頼性の高い運動テストを提供することを目的としています、および(2)前臨床試験と臨床試験の間のエンドポイントをよりよく一致させます。

Introduction

慢性心血管疾患は、世界中の死亡率と罹患率の重要な原因です^1,2。現在の治療法は大多数の患者に効果的ですが、多くの患者は、例えばびまん性慢性疾患や併存疾患のために、現在の治療法の恩恵を受けることができません。また、一部の患者では、利用可能な治療法によって心臓症状が緩和されず、最適な内科的治療にもかかわらず心血管疾患が進行します³。したがって、重篤な心血管疾患に対する新しい治療選択肢を開発する必要があることは明らかです。

過去数年間で、新しい分子経路とこれらの標的を操作する方法が発見され、遺伝子治療、細胞治療、およびその他の新しい治療法が重篤な心血管疾患を治療するための現実的な選択肢となっています⁴。しかし、有望な前臨床結果の後、多くの心血管アプリケーションは臨床試験での期待に応えることができませんでした。臨床試験の有効性が低いにもかかわらず、いくつかの試験では、新規治療法の良好な安全性プロファイルが確立されています⁵、^6、7、^8、9。したがって、新しい心血管療法を患者に提供するには、臨床効果を予測できる前臨床試験における改善されたアプローチと、より良い前臨床モデル、研究設定、および前臨床試験のエンドポイントが必要になります。

動物モデルでは、通常、組織学的切片から計算された毛細血管の数と面積、または安静時および薬理学的ストレス下での左心室イメージングからのパラメーターなど、簡単に定量化できるエンドポイントに重点が置かれてきました。臨床試験では、運動耐容能や症状の緩和など、多くのエンドポイントがより主観的でした⁴。したがって、前臨床試験および臨床試験のエンドポイントは、適用された治療のさまざまな側面を測定する可能性があります。たとえば、血管量の増加は、灌流、心機能、または運動耐容能の向上と必ずしも相関するわけではありません。それにもかかわらず、両方のタイプのエンドポイントは、成功した治療アプローチを開発するために必要です¹⁰。それでも、主な目標は常に症状を緩和し、患者の予後と生活の質を改善することです。これを達成するには、エンドポイント測定値を前臨床試験と臨床試験の間でよりよく一致させる必要があります⁴。

心肺フィットネスは、持続的な身体活動中に酸素を供給する循環器系および呼吸器系の能力を反映しているため、個人の機能的能力を定量化します。機能的能力は、心血管および全死因死亡のリスクに対する強力な独立した予測因子であるため、重要な予後マーカーです¹¹。心肺フィットネスの改善は、死亡リスクの低下と関連しています¹²。運動テストは、心血管疾患における有酸素運動能力と治療反応を評価するのに適しています。可用性に応じて、テストは自転車エルゴメーターまたはトレッドミルで実行されます。通常、1 分あたりのワークロードの段階的な増加が使用され、急激な増加は回避されます。これは線形生理学的反応をもたらす。運動テストで最も重要な変数には、総運動時間、達成された代謝当量(MET)、心拍数、およびQRS複合体(Q、R、およびS波)とT波(STセグメント)の間の心電図(ECG)ラインの変化が含まれます。臨床ストレステストは低コストで簡単にアクセスできます¹³.これらの理由から、6分間の歩行テストなどのストレステストは診療所で広く使用されており、新しい治療法の前臨床評価にも使用する必要があります。

私たちの知る限り、遺伝子治療やその他の新しい治療法の機能的有効性を評価するための十分に記述された大型動物モデルはありません。したがって、臨床的に関連する運動テストは、前臨床設定におけるこれらの新しい治療法の有効性を評価するための優れた視点を提供します。

Protocol

すべての実験は、東フィンランド大学の動物実験委員会によって承認されています。このプロトコルは、心臓病の新しい治療法の安全性と有効性を評価するための豚の臨床的に関連するトレッドミル運動テストについて説明しています。本研究では、体重25〜80 kgの雌豚を使用しました。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。

1.ランニングトラックのセットアップ

1. 動物が一方向にしか移動できないようにランニングトラックを設定します。ゲートとハッチを使用して、動物が戻らないようにします。ランニングトラックの平面図を図 1に示し、ランニングトラックの例を 図2に示します。
2. トレッドミル( 材料表を参照)に傾斜を変更できる十分なスペースがあることを確認してください。
3. ランニング中に動物が回転しないように、トレッドミルの幅が調整可能であることを確認してください。
4. 透明なプラスチックを使用して、トレッドミルの前壁を作ります。これにより、動物がトレッドミルから逃げるのを防ぎますが、それでも動物は壁を通して見ることができます。
   注:私たちの経験では、壁の反対側に仲間の豚がいるのを見ると、豚は走る意欲が高まることが示唆されているため、動物が正面の壁を通して見ることができることが不可欠です。
5. トレッドミルの隣にECGモニターと除細動器( 材料表を参照)を置きます。
   注:致命的な不整脈は、特にブタが心筋虚血を患っている場合、ストレステスト中に発生する可能性があります14,15,16。
6. ランニングトラックに、動物がランニング後に飲んだり涼んだりできる給水ポイントが含まれていることを確認してください。

2.試験前のブタの馴化期間

1. 実験を開始する前に、動物を2週間収容します。
2. 順応の最初の週に、動物がランニングトラックを除いて、ハンドラーと新しい住居環境に慣れていることを確認してください。
3. 順応期間の第2週の間に、動物がランニングトラックに慣れていることを確認してください。
4. 動物がランニングトラックに慣れるように慣れ始めます。まず、動物がトラック上を自由に歩き、環境を探索できるように、すべてのゲートを開いたままにします。
5. 動物がトラックに慣れたら、トレッドミルをオンにして、動物を一度に7分などの短時間走らせます。実行時間の長さは毎日延長する必要があります。
   注:順応期間中に動物に報酬を与えることを忘れないでください。たとえば、豚には無塩ポップコーンが与えられました。

3.運動テスト

注:豚は、運動テストの少なくとも2時間前に絶食するか、実行前にごく一部の食物のみを与える必要があります。

1. トレッドミルの電源を入れ、傾斜を5%〜10%に設定します。
2. 動物がトレッドミルに乗ったらすぐに、時速2kmの開始速度でトレッドミルを始動します。
3. 5 km/h に達するまで、60 秒ごとに速度を 0.5 km/h ずつ上げます。総実行時間は15分です。
4. 動物が最高速度でずっと走ることができない場合は、以下の手順を実行してください。
   1. 豚が選択した速度ほど速く走っていない場合は、速度を落とさずに速く走る必要があるという感覚を動物に与える可能性があるため、後ろからそっと押します。
   2. 動物を最大3回そっと押してみてください。その後、豚が速度を処理できるようになるまで、一度に0.5 km / h速度を落とします。時速2km未満まで減速しないでください。
   3. 動物が低速でも走ることを拒否した場合は、トレッドミルの電源を切り、テストを中止してください。

4.運動テスト中のECGモニタリング

1. ECG電極( 材料表を参照)を、肩甲骨や胸部など、ランニング中の動きが最小限の解剖学的場所に配置します。
   注意: 運動テスト用に設計されたECG電極を使用して、皮膚への接着性を向上させます。ECG電極が配置される領域から髪を剃ることを忘れないでください。
2. ランニング中の心拍数の変化を記録します。
   注:私たちの経験では、STセグメント分析は、動きやその他のアーチファクトのために複雑になることがよくあります。リズムモニタリングは、埋め込み型ループレコーダーまたはペースメーカーを使用して行うこともできます。

5. データ収集

1. 速度が変更されるたびに、走行距離、合計時間、速度を記録します。
   注意: 最新のトレッドミルは他の多くのデータを収集する可能性があるため、機器の可能性を最大限に活用するには、トレッドミルのマニュアルをよく理解することが不可欠です。
2. 足を引きずるなど、動物の行動に起こりうる変化に注意してください。
   注:必要に応じて、獣医師に連絡して、動物が必要な鎮痛を受けていることを確認してください。完全に回復するまで、将来の運動から動物を取り除きます。

6.手続き後のケア

1. 動物が給水ポイントにアクセスできることを確認してください。
2. たとえば、おやつやおもちゃで動物に報酬を与えます。
3. 可能性のある悪影響について、実行後30分間動物を監視します。

Results

このプロトコルで成功するには、大型動物を使った経験が必要です。研究者は、動物が倦怠感ややる気の欠如のために走るのをやめるかどうかを評価できる必要があります。速度と距離を記録することは、通常、モチベーションのない動物が完全に走るのをやめるのに対し、疲れた動物は速度を落とした後も走り続けるので、これを評価するのに役立つかもしれません(図3)。必要に応じて、結果が信頼できないと思われる場合は、翌日にプロトコルを繰り返すことができます。

アデノ随伴ウイルス(AAV)処理動物の代表的なタイムラインを 図4に示します。タイムラインは、特に犠牲の時点に関して、研究の設定によって異なる場合があります。実験を計画するときは、順応期間に注意してください。

結果は、心臓エコーなどの他の臓器構造および機能測定値と比較して、運動耐容能がこれらの他の測定値とどのように関連しているかを確認できます。例えば、走行距離の変化は駆出率の変化と相...

Discussion

この大型動物運動試験は、診療所で使用される試験を模倣し、前臨床試験と臨床試験の間のエンドポイントのギャップを縮小します。閉塞性動脈硬化症、心不全、虚血性心疾患などの重篤な循環器疾患に対する新規治療法の有効性評価に応用できます。このプロトコルで適用される時点は、テストされた治療によって異なる場合があります。このプロトコルは、大型動物での長年の経験に基づいて標準化されており、心血管遺伝子治療やその他の新しい治療アプローチの安全性と有効性を評価するために使用できます。

豚の心臓と心血管系は、人間の生理学、解剖学、および機能に似ています。したがって、ブタは、心血管疾患のメカニズムおよび治療手順をモデル化するためにしばしば使用されてきた¹⁷。私たちのブタ研究の追跡期間は最大12か月^でした18;しかし、動物が長い追跡期間中に成長するにつれて、動物の取り扱いはますます困難になります。

この方法は、テストの成功に不可欠であり、後で修正することは不可...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
除細動器	Zoll Mシリーズ	TO9K116790	すべての携帯用除細動器は動作します
除細動器パッド	フィリップス	M3713A	パッドが除細動器と互換性がある限り、すべてのパッドが機能します
ECG電極	いくつかのプロバイダー		運動テスト用に設計されたECG電極を好む
ループレコーダー	アボットオイ	DM3500	オプションリズムモニタリング用
患者モニター	シラー・アーガス LCM Plus	7,80,05,935	すべてのポータブル心電図モニターが機能します
豚	エモランディア・オイ
トレッドミル	ノルディックトラック		傾斜と速度を調整できるすべてのトレッドミルは、運動テストに適しています。 トレッドミルはできるだけ長くて幅が広い必要があります。
超音波システム	フィリップス EPIQ 7 超音波
様々な建築材料	いくつかのプロバイダー		図1および図2に従ってフェンス、スロープ、ゲート
動物