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方法論記事

エクスビボ 加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング

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DOI:

10.3791/65240

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2023年5月26日

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1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Alabama at Birmingham Heersink School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Zurich, 3Vitreous Retina Macula Consultants of New York, 4Department of Ophthalmology, New York University Grossman School of Medicine, 5Advancing Sight Network, 6Department of Ophthalmology, University Hospital Bonn

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ラボアッセイでは、加齢黄斑変性症(AMD)の縦断的光干渉断層撮影(OCT)ベースのマルチモーダルイメージングから得られた予後値を活用できます。AMDの有無にかかわらず、ヒトドナーの眼は、組織切片作成の前に、OCT、カラー、近赤外反射率スキャンレーザー検眼鏡、および2つの励起波長での自家蛍光を使用して画像化されます。

要約

光干渉断層撮影(OCT)ベースのマルチモーダル(MMI)臨床画像から学んだ加齢黄斑変性症(AMD)の進行シーケンスは、検査所見に予後価値を追加する可能性があります。この研究では、網膜組織切片化の前に、ex vivo OCTとMMIをヒトドナーの目に適用しました。眼は80歳≥の非糖尿病白人ドナーから回収され、死亡から保存までの時間(DtoP)は≤6時間でした。グローブを現場で回収し、角膜の除去を容易にするために18 mmのトレフィンでスコアを付け、緩衝した4%パラホルムアルデヒドに浸しました。前眼部摘出後,解剖スコープと一眼レフカメラを用いてトランス照明,エピ照明,フラッシュ照明を3倍率で撮影した。グローブは、60ジオプターレンズを備えたカスタム設計のチャンバー内のバッファーに配置されました。スペクトルドメインOCT(30°黄斑立方体、30 μm間隔、平均= 25)、近赤外反射率、488 nmの自家蛍光、および787 nmの自家蛍光で画像化しました。AMDの目は、網膜色素上皮(RPE)の変化を示し、ドルーゼンまたは網膜下ドルセノイド沈着物(SDD)、新生血管形成の有無にかかわらず、および他の原因の証拠はありませんでした。2016年6月から2017年9月の間に、右眼94個、左眼90個が回復した(DtoP:3.9±1.0時間)。184眼のうち、40.2%がAMDを有し、初期中期(22.8%)、萎縮性(7.6%)、血管新生(9.8%)AMDを含み、39.7%が目立たない黄斑を有していた。ドルーゼン、SDD、過反射性病巣、萎縮、および線維血管瘢痕はOCTを使用して特定されました。 アーティファクトには、組織の混濁、剥離(細菌、網膜、RPE、脈絡膜)、中心窩嚢胞性変化、起伏のあるRPE、および機械的損傷が含まれていました。凍結切片をガイドするために、OCTボリュームを使用して、中心窩と視神経乳頭のランドマークと特定の病状を見つけました。ex vivoボリュームは、アイトラッキングのための参照機能を選択することによって、in vivoボリュームに登録されました。インビボで見られる病状の生体外での可視性は、保存品質に依存します。16か月以内に、AMDのすべての段階で75の迅速なDtoPドナーの眼が回復し、臨床MMI法を使用して病期分類されました。

概要

光干渉断層撮影(OCT)の指導の下で抗VEGF療法で血管新生加齢黄斑変性症(AMD)を管理してきた15年間は、視力喪失のこの一般的な原因の進行シーケンスとマイクロアーキテクチャに新しい洞察を提供しました。重要な認識は、AMDが神経感覚網膜、網膜色素上皮(RPE)、および脈絡膜を含む三次元疾患であるということです。治験患者や治療を受けた臨床患者の仲間の目のOCTイメージングの結果、何十年にもわたって臨床標準であったカラー眼底写真で見られる以上の病理の特徴が認識されるようになりました。これらには、網膜内血管新生(3型黄斑新生血管1、以前は血管腫性増殖)、網膜下ドルセノイド沈着物(SDD、網様偽ドルーゼンとも呼ばれる)2、RPE運命の複数の経路3,4、および萎縮における激しい神経膠生物ミュラー細胞5,6が含まれます。

黄斑(細胞と動物)を欠くモデルシステムは、この複雑な病気のいくつかのスライスを再現します7,8,9。AMDの負担を改善するさらなる成功は、人間の目の原発病理の発見と探索、黄斑のユニークな細胞組成の理解、それに続くモデルシステムへの翻訳からもたらされる可能性があります。このレポートは、学術研究所とアイバンクの30年間のコラボレーションを描いています。本明細書に記載の組織特性評価法の目標は、1)顕微鏡で眼底の外観と画像化シグナル源の基礎を実証することにより、進化する診断技術に情報を提供すること、2)AMD標本を標的(免疫組織化学)および非標的分子探索技術(イメージング質量分析、IMS、および空間トランスクリプトミクス)のために分類することであり、錐体のみの中心窩と桿状に富む傍中心窩および中心窩を保存します。このような研究は、アイトラッキングを通じて進行シーケンスと縦断的フォローアップが可能な臨床OCTへの翻訳を加速する可能性があります。治療効果を監視するように設計されたこの技術は、網膜血管を使用して、あるクリニック訪問から次のクリニック訪問へのスキャンを登録します。眼球追跡OCTを破壊的技術で得られた検査結果にリンクさせることは、分子所見に新しいレベルの予後価値を提供する可能性があります。

1993年、研究所は死後の眼底のカラー写真をフィルム10に撮影しました。この取り組みは、Foosらによるヒト末梢網膜の優れた顕微鏡検査と組織学11,12,13と、Sarksらによる広範なAMD臨床病理学的相関に触発されました14,15。2009年から、スペクトルドメインOCTに固定されたex vivoマルチモーダルイメージング(MMI)が採用されました。この移行は、他の人の同様の努力16,17、特にサークスによって記述された超微細構造の多くが、時間の経過とともにクリニックで3次元で利用可能であるという認識に触発されました18,19。目標は、網膜、RPE、および脈絡膜における細胞レベルの表現型の十分な検出力のある研究のために、妥当な時間枠で黄斑が付着した目を取得することでした。その意図は、「目ごと」の統計を超えて、心血管疾患の「脆弱なプラーク」の概念の影響を受けた基準である「病変タイプごと」に移行することでした20,21。

このレポートのプロトコルは、いくつかのストリームでアクセッションされた約400組のドナーアイの経験を反映しています。2011年から2014年にかけて、AMD組織病理学のプロジェクトMACULAウェブサイトが作成され、142のアーカイブされた標本からの層の厚さと注釈が含まれています。これらの眼は、高分解能エポキシ樹脂組織学および電子顕微鏡観察のために、1996年から2012年までグルタルアルデヒド-パラホルムアルデヒド固定剤で保存されました。すべてのファンディは、受け取ったときにカラーで撮影され、組織学の直前にOCTによって再画像化されました。もともと視神経研究用に設計されたアイホルダー22を使用して、中心窩を中心とした直径8mmの全層組織パンチを収容しました。中心窩の中心と2 mm上の部位を通るOCT Bスキャンは、同じレベルの組織学に対応し、カラー眼底写真をウェブサイトにアップロードしました。OCT平面の選択は、中心窩23の下のAMD病理の卓越性と、中心窩24,25よりも優れた桿体が豊富な領域でのSDDの卓越性によって決定されました。

2013年以降、生涯にOCTアンカーMMIで画像化された目は、直接的な臨床病理学的相関のために利用可能になりました。ほとんど(10人のドナーのうち7人)は、研究目的で死後に眼を提供することに関心のある患者に高度な指令レジストリを提供する網膜紹介診療所(著者:KBF)の患者に関係していました。眼は地元のアイバンクによって回収・保存され、研究所に移され、プロジェクトMACULAの目と同じ方法で準備されました。死前の臨床OCTボリュームは実験室でシームレスに読み取られ、したがって、人生の間に見られる病理学的特徴を顕微鏡下で見られる特徴と一致させた26。

2014年以降、前向き眼球採集は、病歴のないドナー眼でAMDのスクリーニングから始まりましたが、定義された制限時間(6時間)の間保存されました。この目的のために、アイホルダーは地球全体を収容するように変更されました。これにより、以前に使用されていた8 mmパンチのカットエッジの周りで剥離する可能性が減少しました。眼は免疫組織化学のために4%緩衝パラホルムアルデヒドで保存され、長期保存のために翌日1%に移されました。2016年から2017年(パンデミック前)に、90人のドナーから184の目が回復しました。このレポートの統計情報と画像は、このシリーズから生成されます。パンデミックの時代(2020年の封鎖と余波)の間、トランスクリプトミクスとIMSコラボレーションの将来の収集は、基本的に2014年の方法を使用して、ペースを下げて継続しました。

ドナーの目の評価のための他の方法が利用可能です。ミネソタグレーディングシステム(MGS)27,28は、カラー眼底写真用のAREDS臨床システムに基づいています29。この方法の限界には、萎縮性AMDと新生血管性AMDを「後期AMD」の1つの段階に組み合わせることが含まれます。さらに、MGSは、RPE脈絡膜の写真記録の前に神経感覚網膜の除去を伴う。このステップは、SDDをさまざまな程度30,31に取り除き、外側網膜とそのサポートシステムの空間的対応を取り除きます。したがって、網膜からの代謝要求とシグナル伝達をRPE脈絡膜の病理に結び付ける努力が妨げられる可能性があります。ユタシステムは、ex vivoカラー写真とOCTを使用してMMIを実装し、解剖される予定の目をRNAおよびタンパク質抽出用の領域に分類しました32。アイカップ全体の抜歯よりも好ましいが、AMD進行33,34のリスクが最も高い直径3mmの領域は、直径6mmの中心窩中心のパンチの25%に過ぎない。したがって、免疫組織化学のための連続切片化など、中心窩を参照して所見を局在化できる技術が有利である。

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プロトコル

アラバマ大学バーミンガム校の治験審査委員会は、適正試験所基準およびバイオセーフティレベル2/2+に準拠した実験室研究を承認しました。すべての米国のアイバンクは、2006年の統一解剖学的贈与法および米国食品医薬品局に準拠しています。アドバンシングサイトネットワークを含むほとんどの米国のアイバンクは、米国アイバンク協会の医療基準に準拠しています。

材料表には、消耗品と機器がリストされています。補足資料1では、解剖、カラー眼底撮影、OCTベースのMMIの概要を説明します。補足資料 2 では、OCT ベースの MMI の詳細について説明します。

1.組織採取の基準

  1. 文書化されていないドナーの画面でAMDの眼の収量を最大化するには、受け入れ可能なドナーに対して次の基準を設定します:年齢≥80歳、白人、非糖尿病、および≤6時間の死から保存まで(DtoP)。
    注:DtoPは、病院または実験室のいずれかで、死亡してから提供された防腐剤に目が置かれるまでの時間として定義されます。

2.保存培地およびその他の調製物(実験室)

  1. 20%の在庫(購入済み)から4%のリン酸緩衝パラホルムアルデヒドを作ります。200 mLの20%パラホルムアルデヒド(希釈係数5)を800 mLの0.1 Mソレンソンリン酸緩衝液に加えて1 Lを調製します。必要に応じて、pHが7.2になるようにテストおよび調整します。4°Cで保存してください。
  2. 30 mLの4%リン酸緩衝パラホルムアルデヒドを40 mLのジャーに分注します。
  3. ストックは、いつでもいつでも組織を回収できるように、アイバンクで防腐剤の40 mL容器にラベルを付けました。
  4. 保存された目の保存のために、4%溶液から1%パラホルムアルデヒドを作ります。250 mLの4%パラホルムアルデヒド(希釈係数4)を750 mLの0.1 Mソレンソンリン酸緩衝液に加えて1 Lを調製します。必要に応じてpHをテストして調整します。4°Cで保存してください。
    1. 500 mLの蒸留水と500 mLのソレンソン緩衝液を組み合わせて、ソレンソンリン酸緩衝液の0.2 M溶液(pH 7.2)から1 Lの0.1 M溶液を調製します。
    2. 1 N塩酸または1 N水酸化ナトリウムを使用して、pHの低下を滴下して調整します。4°Cで保存してください。
  5. 解剖中に目を安定させるためのホルダーを作成します。液体になるまで加熱した歯科用ワックスをペトリ皿に入れます。少し冷えたら、大きなボールベアリングで半球印象を作り、ボールベアリングの取り外しを容易にするために皿を凍らせます。

3.アイバンクの方法

  1. 研究組織の迅速な回復を確実にするために、移植を目的としたものを含むすべての組織を迅速に回復します。
  2. 法律で義務付けられているように、死亡後1時間以内に死亡紹介を受け取り、組織に続く紹介シーケンス番号で各ドナーを追跡します。
  3. 臨床文書の可能性がある症例を見つけるには、研究ドナーリスク評価インタビューでAMDおよび眼疾患固有の質問をしてください。
  4. 移動時間を最小限に抑えるには、コンパクトなエリア(つまり、都市と隣接する郊外の郡)内の地球全体(移植用の角膜のみとは異なる)を回復します。
  5. 組織回復のために、防腐剤(緩衝された4%パラホルムアルデヒド)の2つの瓶を故人の病室に持参します(遺体が遺体安置所に移されるのを待つのではなく)。
  6. 回復前および回復中に、調査員と連絡を取り、出産とタイミングを確認します。
  7. 病院で現場でグローブを回収し、一貫した取り扱い方法でグローブを開き、開いた目を防腐剤に浸します(図1)。
    1. 止血剤で安定化されたガーゼの鞘を使用して、切除したドナーの目を所定の位置に保持します。
    2. 幅2 mmの強膜の縁で角膜の除去を容易にするために、直径18 mmのトレフィンを使用して地球にスコアを付けます。
    3. 付随する強膜の縁で角膜を解放するには、止血クリップガーゼで地球を安定させながら、湾曲した先端を持つバネ仕掛けのはさみを使用して、刻まれた円に沿ってカットします。
    4. 角膜を強膜から持ち上げ、虹彩と毛様体を露出させます。
    5. 硝子体腔への防腐剤の浸透を容易にするために、瞳孔縁に垂直な虹彩に2 mmの長さのスリットを作ります。4°Cで30 mLの防腐剤を入れた標本瓶に目を置き、湿った氷の上で実験室に移します。
  8. 匿名化されたドナー情報をアイバンクから研究室のデータベースに電子的に送信します。
    注:データベースには、紹介番号、アイバンク組織番号、追跡用の検査室ID番号、およびその他の関連情報が保持されます。

4. 生体外カラー眼底撮影のための組織準備

  1. 解剖用とカラー眼底撮影用の2つの実体顕微鏡を使用します。
    注:色素の変化を視覚化するための透過照明には、暗視野顕微鏡用のベースを使用してください。
  2. 前眼部の残骸(虹彩と水晶体)を取り除きます。解剖中に目を安定させるために、ワックスで満たされたペトリ皿に入れます(補足資料1、スライド7-8)。毛様体および付着した網膜が硝子体腔内に崩壊するのを防ぐために、毛様体に付着した厚い硝子体の輪(硝子体基部)の摂動を最小限に抑える。
  3. 方向付けのために上極に印を付けます。グローブの前側を下にして皿に入れます。上直筋と上斜筋の挿入腱を見つけます。木製のアプリケーターを使用して、マーキングインクを前後方向に10 mmの線で控えめに塗布します(つまり、上直筋の腱挿入に垂直)。
  4. 写真撮影の前に、眼底を冷たいソレンセンのリン酸緩衝液で満たしてください。
  5. 1mmのルビービーズを内部スケールバーとして眼底に挿入し、各画像27に現れる。
  6. リングフラッシュを装着した実体顕微鏡に一眼レフカメラでカラー画像を取得します。トランス照明、エピ照明、フラッシュ照明を3つの標準倍率のそれぞれで使用して、特定の領域を強調することを目的とした画像をキャプチャします(補足資料1、スライド11):1)赤道への眼底、2)後極(血管アーケード、視神経乳頭、中心窩)、および3)黄斑内の中心窩(黄色の斑点)。

5. 生体外カラー眼底撮影の準備

  1. カメラとモニターの電源を入れます。リモートシャッターを接続し、高解像度マルチメディアインターフェイス(HDMI)カメラ/テレビ(TV)モニターとディスプレイケーブルのアクチュエーターを解放します。
  2. カメラの設定を手動ISO機能とミラーロックアップ位置(振動を減らすために所定の位置にロック)に設定します。
    注意: 使用するカメラの設定については、製造元のユーザーマニュアルを参照してください。カメラ表示から、ヒストグラムと露出の読み取り値に対する露出オーバー/アンダー設定を学びます。
  3. 顕微鏡ステージ上の4つの基本方向の照明のために、それぞれが互いに垂直に配置された2つの柔軟なライトガイドを備えた2つの光源を配置します(補足資料1、10ページ)。
  4. 落射照明光源をフルパワーにします。
    注:写真家の光/フラッシュの散乱を制限するために、ステージの周りに黒いフェルトシュラウドを配置することは便利ですが、必須ではありません。
  5. 解剖顕微鏡で、鉗子を使用して、バッファーで満たされた30 mLの石英るつぼに後極を挿入します。ティッシュを底に沈めます。ティッシュスポンジなどのブレースを目とるつぼの壁の間に挿入して、動きを防ぎます。1mmのルビービーズを後極に挿入します。
    注:ビーズが視神経カップに落ちる可能性があります。
  6. るつぼ内の地球儀を実体顕微鏡ステージに慎重に置き、顕微鏡の接眼レンズを通して眼底内部を観察します。最低倍率を使用して、12時の位置にある組織マーク、視神経乳頭(ONH)、およびONHの5°下の中心窩を識別することにより、目の向きを合わせます。中心窩がONHを通る線より5°下になるように目を回転させます。
    注:右目の場合、ONHは顕微鏡の接眼レンズを通して見られるように、中心窩の右側にあります。左目の場合、ONHは中心窩の左側にあります。
  7. カメラから見るリモートモニターの電源を入れます。顕微鏡のビームスプリッタースライダーが、接眼レンズのポートではなく、フォトポートを通して観察するように設定されていることを確認します。光とミラーの経路に応じて、適切な向きになるようにステージ上で組織を180°回転させる準備をしてください。

6. 生体外カラー眼底写真を用いた画像取得

  1. 落射照明をオンにした状態で、18 mmのトレフィン切開全体が視野全体を占めるように倍率を設定します。中心窩の底に焦点を合わせることができるように倍率を上げます。倍率を前の設定に下げます。
  2. ISO設定を1,600〜3,000の範囲で調整して、露出時間がカメラのメーターの中心範囲に収まるようにします。
  3. リモートシャッタートリガーを押します。ミラーが上の位置にロックされるのを聞きます。露出のためにもう一度トリガーを押します。
  4. 赤、緑、青(RGB)を示すプリセットメタデータと、正しい露出のためのカラーヒストグラムを使用して、モニター上の画像を観察します。露出が許容できる場合は、続行します。そうでない場合は、パラメータを削除し、再評価して、イメージを再作成します。
  5. 落射照明用のグースネックランプをオフにしてドルーゼンを強調し、露出1/4秒、カメラのシャッタースピード1/250秒、ISO100〜320でフラッシュをオンにします。フラッシュ速度をデフォルトに設定するか、カメラの初期設定時に変更します。画像を取得し、ヒストグラムが適切に露出しているかどうかを確認します。
  6. フラッシュをオフにし、トランスイルミネーション光源をオンにします。ISOを5,000以上にリセットし、写真システムの潜在的な振動により露光時間が1/30秒を下回らないようにします。画像を取得し、ヒストグラムが適切に露出しているかどうかを確認します。
  7. 倍率を上げて、ONHと中心窩の両方を視野に入れます。落射照明ランプをオンにします。ISO範囲を1,600〜3,000に設定します。露出時間がカメラの中心範囲にあることを確認してください。
  8. 落射照明ランプを消し、フラッシュをオンにして、露出を1/4秒、カメラのシャッタースピードを1/250秒、ISOを400〜800に設定します。画像を取得し、ヒストグラムが適切に露出しているかどうかを確認します。
  9. フラッシュをオフにし、暗視野ベースを使用してトランスイルミネーションをオンにします。ISOを5,000以上にリセットします。写真システムの潜在的な振動により、露光時間が1/30秒より遅くならないことを確認してください。画像を取り込み、適切なヒストグラムを確認します。
  10. 透過照明をオフにし、落射照明ランプを再度オンにします。
  11. 手順6.7で使用した倍率に倍率を上げます。必要に応じて焦点を合わせ直します。
  12. ISOを3,000〜6,000の範囲で上げ、カメラの適切な露出範囲内になるように露出時間を調整します。画像を取得します。
    注意: ルビービーズが視野に表示されなくなる場合があります。その場合は、参照用にこの倍率でビーズの個別の画像をキャプチャします。
  13. 落射照明ランプをオフにします。露出1/4秒、カメラのシャッタースピードを1/250秒にしてフラッシュをオンにします。フラッシュ速度をデフォルトに設定するか、カメラの初期設定時に変更し、ISOを500〜1,000に設定します。画像を取得します。ヒストグラムが適切に露出しているかどうかを確認します。
  14. フラッシュをオフにし、トランスイルミネーションランプをオンにします。ISOを8,000以上にリセットして、より感度の高いイメージセンサーで露出時間を短縮します。写真システムの潜在的な振動により、露光時間が1/30秒を下回らないようにしてください。画像を取得します。
  15. カメラからパソコンに画像を書き出します。顕微鏡ステージから標本を取り出す前に、再度撮影する必要がある場合に備えて、画像を確認してください。

7. ex vivo OCTおよび走査型レーザー検眼鏡(SLO)の画像取得の概要

  1. スペクトルドメインOCTの場合、60ジオプターレンズ35を有するチャンバーを有するカスタムアイホルダー内のリン酸緩衝液中にグローブを配置する。アイホルダーを臨床用OCTイメージングデバイスのブラケットに取り付け、患者が額を休める場所に取り付けます。OCT デバイスは、各画像に縮尺記号を自動的に挿入します。
  2. 同時に、同じデバイスを使用し、目を保持したまま、近赤外線反射率(NIR、留置ソフトウェアによってロケーター画像として使用される)、488 nmの励起眼底自家蛍光(FAF)、および赤色フリー(RF)反射率を使用して、走査型レーザー検眼鏡(SLO)で地球儀を画像化します。
    注:このデバイスの787nm励起FAFは、ビームスプリッターがSLOへの光透過率を低下させるため、たまにしか適していません。このため、787 nm FAF画像用の2番目のデバイス(次のポイントを参照)が使用されます。
  3. 別に、しかし眼をアイホルダーにまだ置いた状態で、このモダリティを良好に表示する別個の装置を用いてRPE外乱36を検出するための787nm FAFで地球儀を画像化する。

8. ex vivo OCT/SLOのための画像取得プロトコル(補足資料2のスライドを参照)

  1. 組織マーキング染料で上直筋を示します。レーザーをオンにします(青い矢印、 補足資料2、1ページ)。
  2. 補足資料2の2ページを参照して、ユニット全体をベースに対して2軸に動かし(緑色の矢印)、次にジョイスティックを時計回り/反時計回りに回転させて高さ(y)を上げてOCTヘッドを配置します(cw / ccw、青い矢印)。黒いレバーをRの位置(*)にして、ノブ(オレンジ色の矢印)を回して画像の焦点を合わせます。つまみネジ(紫色の矢印)を固定してユニットをロックします。
  3. ホルダーに目を挿入し、スペーサーで後方から安定させます(補足資料1、13ページ)。強膜のへこみを避けるために、できるだけ少ない圧力をかけます。上直筋の組織マークを上に向けて向きを変えます。
    注意: アイホルダーの前面からOCTデバイスまでのおおよその距離は25mmです。
  4. OCTデバイス用の独自の視覚化および分析ソフトウェアを開きます。患者リストが左側の列に表示されます。内部コード番号で索引付けされた眼科ドナーは「患者」です。製造元のユーザーマニュアルを参照してください。
  5. [新しい患者] アイコンを選択します。必要に応じて、患者データ情報を入力します。OK を選択します。個々の目には、YYYYNNNL,R_agesex などの論理的に順序付けられた番号付けシステムを使用します。たとえば、これは2017016R_97Fである可能性があります。
  6. 次のウィンドウでデータ入力を続行した後、 OKを押します。ドロップダウンメニューから測定者と試験を選択します。
    注: 入力した情報は、エクスポート可能なメタデータに表示されます。
  7. 空白の画面を表示した後、黄色のボタンをタッチして画像取得を開始します。
  8. IR + OCT (近赤外線反射率 + OCT) を押します。レーザーが眼底とOCT B-スキャンのライブSLO画像を取得できるようにします。
    1. ONHと中心窩に基づいて正しい解剖学的位置を確定し、木製のアプリケーターを使用してホルダーの目の位置を調整します。コントロールパネルで、黒い丸いボタンを回して強度を調整します。
    2. 同じボタンを押して平均9〜100フレームにします(赤い矢印;9で十分、100はクリーミーに見えます)。ユニットの向きが正しい場合は、眼底に焦点が合っており、OCT B-スキャンがディスプレイの上部3分の1に表示されます(補足資料2、9ページ、二重赤矢印)。
    3. 眼底画像上で、カーソルを使用して青い線を移動し、中心窩の中心にします(補足資料2、9ページ、白い矢印)。 [取得]を押します。
      メモ: その他のデフォルトのボタンは、 網膜、 EDI (オフ)、および ラインスキャンです。
  9. RF + OCTを押して、次の取り込みを行います。位置を再確認して、画像が移動または劣化していないことを確認します。黒いボタンを押して平均化します。[取得]を押します。
  10. 自家蛍光イメージング用の内部キューブを488 nmおよび787 nmの励起波長に切り替えます(補足資料2、10ページ)。
    メモ: スイッチ後の立方体の位置が表示されます。
  11. 自家蛍光モードを選択します。位置合わせを再確認してください。[取得]を押します。
  12. RPE破壊および萎縮の疑いのある症例については、787 nmの自家蛍光に対して ICGA (インドシアニングリーン血管造影)を選択してください。目の位置を再確認し、[ 取得]を押します。
    注:眼底画像は、内部キューブがビームを減衰させるため、このモダリティでは表示されないことがよくあります。
  13. 内部キューブを R に戻してIRを、赤のフリーイメージングでボリュームを取得します。
    注意: 切り替え後の立方体の位置は、 補足資料13の2ページに示されています。
  14. OCT ボリュームを取得するには、[ IR ] とボリューム設定を選択します。 補足資料14 の2ページのすべての設定を、コントロールモジュールの適切なボタンに切り替えて一致させます(30°黄斑立方体、30μm間隔、実験要件に応じて平均化)。
  15. 近赤外反射眼底図が青色のB-スキャン線で覆われていることに注意してください。右側のウィンドウの上3分の1にあるOCTの位置を再確認します。コントロールモジュールのAcquire(取得)を押し、ボリュームスキャンが完了するまで5分間待ちます。イメージングの取得が完了したら、[EXIT]を選択します。画像が保存されます(赤い矢印)。
    注意: 青い線は、前のビューで示されていた距離をマイクロメートル単位で区切ります。スキャンは下(下)から番号付けを開始し、上に進みます。赤い線の進行に注意してください。
  16. 取得した画像をコンピューターに処理させ、画面に表示します(補足資料2、16ページ)。
  17. 1人のドナーの仲間の目を画像化するときは、目の間の取り付けブラケットの位置を変更しないでください。左目が最初に画像化されると、結果はOD(右目)列に表示されます。右クリックしてすべてのイメージを選択し、[ OS/OD の交換] を選択します。画像がOS列に移動します。
  18. [データベース>ウィンドウ>選択]を押します。画面はデフォルトでパネル6になり、右側の列に画像化されたドナーの目が追加されます(補足資料2、18ページ)。ドロップダウンメニューで患者を右クリックし、[バッチ]を選択して、E2Eファイルをエクスポートします。
  19. ファイル転送用にデスクトップに作成された事前に決定されたフォルダーを参照します。 OK を選択します。このフォルダには、外付けハードドライブにコピーしてアーカイブするE2Eファイルが含まれています。
  20. ホルダー内の目を、主に787nmの自家蛍光に使用される走査型レーザー検眼鏡に持って行きます。
    注意: 画像の取得とアーカイブについては、製造元のユーザーガイドを参照してください。
  21. コンピューターとレーザーの電源を入れます。
  22. [新しい患者] アイコンを選択します。必要に応じて患者データを入力します。
  23. 目のデータシートを同じに保つには、[ OK]を押します。Cカーブは同じままなので、[ 続行]を押します。
  24. 学習モードを選択し、必要に応じてパスワードを入力します。C カーブを 7.7 mm に保ち、[OK] を押します。
  25. [続行]を選択して、Cカーブを確認します。黄色のインジケーターを選択してカメラを起動します。
  26. R 位置を選択します。地球を整列させ、方向を設定します。上記のように焦点を合わせ、向きを変えるIRモードを選択します。
  27. ユニット全体をベースに対して2つの軸に動かし(補足資料2、28ページ、緑の矢印)、次にユニットの高さ(y)を上げて(青い矢印)、カメラヘッドの向きを合わせます。ノブ(オレンジ色の矢印)を回して画像の焦点を合わせます。黒いレバーの位置はR(*)にあります。このヘッドが所定の位置になったら、つまみネジ(紫色の矢印)を回してユニットをロックダウンします。
  28. なお、補足資料2の29ページのような画面が表示されます。
  29. セレクターノブを R から Aに動かします。 ICGA (787 nmの自家蛍光を達成)を青色、100%の強度、30°の視野、および単相イメージングで選択します。
    注:色素インドシアニングリーンと同様に、メラニンは787nmの波長光によって励起されます。
  30. なお、補足資料2の31ページのような画面が表示されます。黒いディスクを押して平均化し、[取得]を選択します。
  31. [ウィンドウ] > [データベース] を選択します。[SLO デバイスから E2E ファイルをインポートする] を選択します。これらのファイルは外付けハードドライブに保存され、デスクトップにアップロードされます。
  32. [ 開く] を選択します。マークが既定であることを確認し、[ OK] を選択します。
  33. 患者には、SLOから取得した画像(青い矢印)を示すタブと、OCTデバイスから取得した画像を示すタブ(赤い矢印)の2つのタブがあります(補足資料2、34ページ)。
  34. 786 nm(ICGA)画像を右クリックし、デスクトップ上のSLO 786というラベルの付いたファイルに画像をエクスポートします。
  35. 786 nmの自家蛍光SLO画像を保存するには、患者を選択し、右クリックして画像をRAWファイル(.volファイルの場合)としてデスクトップ上のフォルダーにエクスポートします。
  36. OCT デバイスからイメージをエクスポートしてアーカイブ コンピュータに転送するには、 RAWEXPORT から RAW というラベルの付いたフォルダにコピーして貼り付けます。

9.イメージングレビュー

  1. 画像(カラー、.volファイル、SLO画像)を各ドナーのフォルダーに組み立て、各目のサブフォルダーを作成し、ラボIDでフォルダーを連続してインデックス化します。
  2. 組織の印象(品質、病理)をデータベースに記録して、標準化されたレポートを作成します。
  3. エクスポートされた OCT ボリュームを社内の ImageJ プラグインで確認します。
    1. 中心窩の中心、外側の網膜バンドの内側への上昇、または最も薄い点によって認識できる中心窩を見つけます。ほとんどの場合、これらは中心窩の保存、個体差、および病状の存在に依存するため、常に一致しますが、常にではありません。
    2. 上中心窩で標準スキャンを見つけます(上方向に2 mm/67 Bスキャン、つまりスキャン数を増やします)。
    3. ボリューム全体の.tifスタックを保存して、後ですばやく参照できるようにします。
    4. OCT ボリューム全体をスキャン 1 (下位) からスクロールし、特徴が認識されるスキャン番号を記録します。
    5. 黄斑に加えて乳頭周囲領域を確認してください。
      注:高齢眼の乳頭周囲脈絡網膜萎縮症には、特徴的な基底層状沈着物と新生血管が含まれます。これは、近視眼および緑内障、ならびに老化およびAMD37における色素変化の一般的な領域である。
  4. カラー写真を調べ、可能であれば、調査結果をOCTで見たものとリンクさせます。
    注 : 一般に、ほとんどの調査結果は最初に OCT で確認する方が簡単です。カラー写真は、SLO上の領域の外側の領域、母斑を含む脈絡膜色素沈着、ヘムと硬い滲出液の存在、および血管新生AMDの黒色色素の大きなビューを提供します。中心窩の暗い色素は、前部からの緩いメラノソームを表している可能性があるため、ピペットを使用してバッファーで穏やかに洗い流す必要があります。
  5. SLO イメージを調べ、可能であれば、結果を OCT で見た結果にリンクします。
  6. 中心窩と中心窩での標準的なBスキャン、注目すべき病理やその他の特徴を持つ追加のBスキャン、および病理レポートにSLO画像を保存します。
  7. 目を次のように分類します:目立たない、疑わしい、初期中期AMD、萎縮性AMD、血管新生AMD、その他、不明、等級付け可能、記録されていません。「疑わしい」は、変更が別の分類に十分深刻であるかどうかが明確でない場合に使用されます。「採点不可」は、網膜がひどく剥離している目など、有用なOCTスキャンがない目のために予約されています。「未記録」は、写真なしで受領後すぐに処理される目のために予約されています。
  8. AMDには、ドルーゼンまたは網膜下ドルセノイド沈着物のいずれかによる重度のRPE変化、体液や線維症などの新生血管形成の兆候の有無、および他の原因の証拠がない(SDDに対応するためにCurcio et al.10から更新)という基準を使用してください。
    注:最終診断は組織学的分析によって確認されます。

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結果

表1は、2016年から2017年の間に、94人の白人の非糖尿病ドナー>80歳からの184の眼が回復したことを示しています。平均死亡から保存までの時間は3.9時間(範囲:2.0〜6.4時間)であった。レビューされた184の目のうち、75(40.2%)が特定のAMDを持っていました。次のカテゴリーが特定されました:目立たない(39.7%)、疑わしい(11.4%)、早期中期AMD(22.8%)、萎縮性(7.6%)、血管新生(9.8%)、その他(8.7%)、および不明/記録されていない/評価できない(<1%)。図2、図3、図4、および図5は、このシリーズの非常によく保存された目のマルチスケール、マルチモーダルex vivoイメージングを示しています。眼は網膜疾患専門の眼科医(J.A.K.)と共同でレビューした。一部の目は他の目よりも個々の特徴をよ...

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ディスカッション

COVID以前の16か月間に集団ベースのスクリーニングアプローチを使用して、AMDで75人のドナーの目を調達することができました。すべて短いDtoPで回収し、OCTアンカーMMIを使用してステージングしました。年齢基準(>80歳)は、移植可能な角膜を対象とした組織回復の典型的な年齢範囲外です。高齢にもかかわらず、私たちの基準はAMDのすべての段階で目をもたらしました。多くのRPE表現型はすべてのAMDステージに共通しており、一部は血管新生AMD 3,46に排他的です。ex vivoイメージングとin vivoイメージングの直接比較(図7)により、トップレベルの診断分類に十分な網膜のex vivo画像を作成する上で、専門家の取り扱い(図1)とともに短いDtoPが重要な要素であり、これらのサンプルのいくつかはイメージングと組織学の直接的な相関関係に適して...

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開示事項

C.A.C.はハイデルベルクエンジニアリングから研究支援を受け、アペリス、アステラス、ベーリンガーインゲルハイム、キャラクターバイオサイエンス、オザンニのコンサルティングを行っています。T.A.はノバルティスから研究支援を受け、ロシュ、ノバルティス、バイエル、ニデック、アペリスのコンサルティングを行っています。K.B.F.は、ジェネンテック、ツァイス、ハイデルベルクエンジニアリング、アラガン、バイエル、ノバルティスのコンサルタントです。

謝辞

オリジナルのアイホルダーの計装と設計を提供してくれたハイデルベルクエンジニアリング、OCTベースのマルチモーダルイメージングの紹介をしてくれたRichard F. Spaide MD、臨床画像デバイスへのアクセスを容易にしてくれたChristopher Girkin MD、 図 1を提供してくれたDavid Fisherに感謝します。研究のための人間のドナーの目の回復は、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01EY06019(C.A.C.)、P30 EY003039(ピットラー)、R01EY015520(スミス)、R01EY027948(C.A.C.、T.A.)によってサポートされました。R01EY030192(Li)、R01EY031209(スタンボリアン)、U54EY032442(スプラギンズ)、IZKFヴュルツブルク(N-304、T.A)、アラバマ州アイサイト財団、国際網膜研究財団(C.A.C.)、アーノルドとメイベルベックマン黄斑研究イニシアチブ(C.A.C.)、および失明防止AMDカタリスト(シャイ)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ビーカー、250 mLフィッシャー#02-540K
ボトル、1リットル、パイレックス Fisher# 10-462-719保存料
ブンゼンバーナーまたは熱源Eisco# 17-12-818ワックスを溶かすには
カメラ、デジタルNikon D7200D7200
コンピュータとストレージAppleiMac Pro; 14 TB 外付けハードドライブ画像保存
コンテナ、断熱Fisher# 02-591-45濡れた氷用
容器、ドナーあたり2個、40 mLFisherSameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86防腐剤用
るつぼ、石英 30 mLFisher# 08-072D写真撮影用地球儀
シリンダー、卒業生、250 mLFisher# 08-549G
消毒剤洗浄用品  レンズ
と取り付けブラケットの接触J.メッシンジャーjeffreymessinger@uabmc.eduハイデルベルクエンジニアリングオリジナルデザインの
フェイスプロテクションマスクの#19-910-667
鉗子、ハーモンフィックスRoboz #RS-8247
鉗子、マイクロAdsonRoboz #RS-5232
鉗子・ティッシュロボズ# RS-5172
ガラスシャーレ・キマックスフィッシャー#23064
グローブ ダイヤグリップフィッシャー#MF-300
ガウン ジェンプロフィッシャー#19-166-116
画像編集ソフトAdobePhotoshop 2021・Creative Suite
キムワイプフィッシャー#06-666
、3つのグースネックSchott Imaging#A20800
顕微鏡、解剖用NikonSMZ 1000
、ステレオオリンパス SZX9色眼底写真
パラホルムアルデヒド、20% EMS#15713-S防腐剤用、希釈して保存
用pHメーターフィッシャー #01-913-806
リン酸緩衝液、ソレンソンs、0.2 M pH 7.2 EMS#11600-10
リングフラッシュB&HフォトビデオSigma EM-140 DG 
ルビービーズ、直径1mmメラーオプティクス#MRB10MD
安全メガネ、3Mフィッシャー#19-070-940
走査型レーザー検眼鏡、ハイデルベルクエンジニアリング、HRA2
はさみ、湾曲スプリング、ロボズ#RS-5681
、シャープスコンテナ、フィッシャー#1482763
シャッターコード、リモートニコンMC-DC2
スペクトルドメインOCTデバイスハイデルベルクエンジニアリングSpectralis HRA&OCThttps://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
ステンレス鋼ボールベアリング、直径25.4 mmMcMaster-Carr#9529K31
組織マーキング染料、黒色 Cancer Diagnostics Inc# 0727-1
組織スライサーブレードThomas Scientific#6767C18
Trephine、18mm径Stratis Healthcare#6718L
テレビモニター(HDMI)とデジタルカメラ用コードB&HフォトビデオBH#COHD18G6PROBライブビューイングとリモートカメラディスプレイ機能
、ピンクの歯科用EMS #72670
木製アプリケーターピューリタン#807-12
の保管 カスタム変更 https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html アイホルダーフィッシャーランプステレオ顕微鏡、、、ワックス

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