方法論記事

小型節足動物から血リンパを採取するための正確で定量可能な方法

DOI：

10.3791/65250

⸱

2023年4月28日

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1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2CAS Center for Excellence in Biotic Interactions, University of Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

この記事について

サマリー

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我々は、その後の解析のために、小型節足動物から定量可能な血リンパを効率的に採取する方法について述べる。

要約

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節足動物は、ウイルス感染に不可欠な血リンパを介して、医学的および農業的に重要なさまざまなウイルスを感染させることが知られています。血リンパ採取は、ウイルスとベクターの相互作用を研究するための基盤技術です。本稿では,イネストライプウイルス(RSV)の主ベクターである Laodelphax striatellus (小型トビイロウンカ,SBPH)を研究モデルとして,小型節足動物から血リンパを定量的に採取する新規かつ簡便な方法について述べる.このプロトコルでは、このプロセスは、凍った節足動物の片方の足を細いピンセットでそっとつまみ、血リンパを傷口から押し出すことから始まります。次に、毛細血管とピペットバルブからなる単純なマイクロピペットを使用して、毛細管力の原理に従って創傷から浸出性血リンパを収集します。最後に、採取した血リンパは、さらなる研究のために特定の緩衝液に溶解することができる。小型節足動物から血リンパを採取するこの新しい方法は、アルボウイルスとベクター-ウイルス相互作用のさらなる研究のための有用で効率的なツールです。

概要

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動物ウイルスと植物ウイルスの両方が節足動物によって伝染する可能性があり、これらのウイルスは人間の健康に深刻な脅威をもたらし、農業に多大な経済的損失をもたらします1,2,3。重要なことに、節足動物の循環系および免疫系の重要な要素として機能する節足動物の血リンパは、アルボウイルス感染の調節に重要な役割を果たしています。節足動物の腸を介して獲得されたウイルスは、有害な血リンパ環境から首尾よく脱出した後にのみ他の組織に輸送されます4,5,6,7。節足動物血リンパにおけるウイルスのライフサイクルは、流体血漿中のウイルスの生存、血球への侵入、および他の組織への輸送を含み、血リンパでは様々なウイルス-ベクター相互作用メカニズムが起こります8,9,10,11,12。<....

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プロトコル

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1.昆虫の飼育

  1. 本実験で用いたSBPHをイネ苗(オリザ・サティバ cv.ニッポンバレー)で育てる。インキュベーター(65 mm x 200 mm)に20本のイネ苗を植え、16時間の明期/ 8時間の暗期の下で25°Cで成長します。

2.血リンパ採取のためのSBPHの解剖

  1. SBPHを遠沈管に入れ、氷浴に10〜30分間入れます。
    注意: SBPHを氷浴に10分未満置かないでください、または昆虫が復活する可能性があります。
  2. 凍結したSBPHを、腹部を上に向けて実体顕微鏡(材料表を参照)の下のスライドガラス(材料表を参照)に置きます。昆虫の6本の足の焦点を調整します。
  3. 超極細の先端を備えた2つの高精度ピンセット( 材料表を参照)を準備します。一方のピンセットを使用して昆虫の体を押し下げて所定の位置に保ち、もう一方のピンセットを使用して片方の足を昆虫から慎重に引き抜きます。
    注:硬い殻を持つ昆虫の場合、眼科用メスを使用して片方の脚を切り取ることができます。
  4. ピンセットで昆虫の胸をそっと押して、血リンパを傷口から流出させます。
    注:血リンパは、目に見える白い凝集のない透明な液滴....

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結果

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マイクロピペットモデルと血リンパ採取
キャピラリーチューブの毛細管力に基づいて作用するシンプルなマイクロピペットを開発しました。マイクロピペットは、キャピラリーチューブとピペットバルブで構成されています(図1A)。キャピラリーチューブは、1μLから20μLの範囲のさまざまな容量サイズで入手可能であり、キャピラリーチューブの容量は要件に応じて選択されます。小容量のチューブの非常に微細な開口部は血リンパなどの液体を吸収しにくくなる可能性があるため、容量の小さいキャピラリーチューブは推奨されません。ピペットバルブの上部には、血リンパ採取中に塞ぐことができない穴があります。このピペットバルブは、液体収集中にマイクロピペットを保持するのに便利であり(図1B)、収集された液体をキャピラリーチューブから収集バッファーに移すのにも役立ちます。

本研究では、血リンパを採取しやすくするために、まずSBPHを氷または冷蔵庫で凍結させた。次に、これ.......

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ディスカッション

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血リンパは節足動物の循環系の媒体であり、アルボウイルスは敵対的な血リンパ環境を生き残ることができる場合にのみ他の節足動物組織に侵入することができます。血リンパの高品質のサンプルを収集することは、血リンパで発生するベクターとウイルスの相互作用を研究するための最初のステップです。昆虫の血リンパは、前脚の傷、頭部の小さな切開、腹部の裂傷など、昆虫の体のいくつかの部位から得られることが報告されています26,27,28,29。特定の取得では、さまざまな収集方法が機能する場合があります。頭頸部関節に小さな切開を施す方法は、ミツバチ26などの大型昆虫からの血リンパ採取により適している。SBPHの頭部に創傷を作ることは、他の臓器に損傷を与え、他の組織からの汚染をもたらす可能性があるため、困難です。腹部に涙傷を負わせた後、昆虫を緩衝液に浸し、緩衝液を遠心.......

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開示事項

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著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

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この研究は、中国の国家重点研究開発プログラム(No.2022YFD1401700)および中国国家科学財団(No.32090013およびNo.32072385)によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10% SDS-PAGE タンパク質ゲルバイオ・ラッド4561035タンパク質の分離と検出
4% パラホルムアルデヒドSolarbioP1110細胞または組織の固定用 
ブラッドフォード染料試薬バイオ・ラッド5000205タンパク質濃度検出
キャピラリー・ヒルシュマン9000101血リンパ採取用
細胞計数室ACMECAYA0810血球計数
ガラススライドギトグラス10127105A昆虫保持用
シランコーティングガラススライドSigmaS4651-72EA顕微鏡サンプルの保持用
DAPI付き金色あせ防止試薬InvitrogenP36935核染色
顕微鏡カバーガラスギトグラス10212424C顕微鏡観察用
ピペットバルブヒルシュマン9000101血リンパ採取用
プリズム8.0ソフトウェアGraphPadソフトウェア/統計解析
実体顕微鏡 MoticSMZ-168昆虫解剖用
ピンセットTianldP5622昆虫解剖用
Zeiss倒立顕微鏡ZeissObserver Z1血球観察

参考文献

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  1. Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  2. Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. ....

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