小型節足動物から血リンパを採取するための正確で定量可能な方法

動物ウイルスと植物ウイルスの両方が節足動物によって伝染する可能性があり、これらのウイルスは人間の健康に深刻な脅威をもたらし、農業に多大な経済的損失をもたらします^1,2,3。重要なことに、節足動物の循環系および免疫系の重要な要素として機能する節足動物の血リンパは、アルボウイルス感染の調節に重要な役割を果たしています。節足動物の腸を介して獲得されたウイルスは、有害な血リンパ環境から首尾よく脱出した後にのみ他の組織に輸送されます^4,5,6,7。節足動物血リンパにおけるウイルスのライフサイクルは、流体血漿中のウイルスの生存、血球への侵入、および他の組織への輸送を含み、血リンパでは様々なウイルス-ベクター相互作用メカニズムが起こります8,9,10,11,12。例えば、SBPHによるRSVの垂直伝達は、SBPHビテロゲニンタンパク質とRSV(イネストライプウイルス)キャプシドタンパク質との間の分子相互作用に依存する^13、14。一部のウイルスは、特定のベクター因子¹⁵、^16、17、¹⁸に結合することにより^、血リンパの免疫応答を逃れる可能性があります。したがって、節足動物の血リンパにおけるベクターとウイルスの相互作用を調べることは、アルボウイルス伝播の理解を深めるために重要です。

ウンカ、ヨコバイ、一部の蚊などの一部の小さな昆虫の血リンパは、そのサイズのために収集が困難です。この問題に対処するために、昆虫の体内に注射針を直接挿入して微量の血リンパを抽出する方法、先端の細いピンセットで創傷部位から滲出液を採取する方法、直接遠心分離する方法などが開発されています。これらの方法により、血リンパ内の相対的な遺伝子発現レベルとウイルス力価の測定が可能になりました^19、20、21。しかし、これらの小型昆虫に対しては、血球計数、タンパク質定量、酵素活性解析に必要な血リンパ量の定量に有効な方法は現在のところありません。

SBPH(小さな茶色のウンカ)は、体長が約2〜4 mmの小さな昆虫ベクターの一種です。SBPHは、RSV、トウモロコシラフドワーフウイルス、イネブラックストリークドワーフウイルスなど、さまざまな植物ウイルスを感染させることができます²²、^23、24。SBPHとRSVの相互作用は、過去10年間にわたって詳細に研究されてきました。SBPHの取り扱いを容易にするために、血リンパを採取する斬新で簡単な方法を開発しました。毛細管力の原理に基づくこの方法は、目盛りの付いた毛細血管を使用して、昆虫の血リンパを正確かつ定量化可能な方法で取得します。これにより、小型昆虫から特定量の血リンパを効率的に採取し、小型ベクターの血リンパ環境をより詳細に調べることができます。

1.昆虫の飼育

1. 本実験で用いたSBPHをイネ苗(オリザ・サティバ cv.ニッポンバレー)で育てる。インキュベーター(65 mm x 200 mm)に20本のイネ苗を植え、16時間の明期/ 8時間の暗期の下で25°Cで成長します。

2.血リンパ採取のためのSBPHの解剖

1. SBPHを遠沈管に入れ、氷浴に10〜30分間入れます。
   注意: SBPHを氷浴に10分未満置かないでください、または昆虫が復活する可能性があります。
2. 凍結したSBPHを、腹部を上に向けて実体顕微鏡(材料表を参照)の下のスライドガラス(材料表を参照)に置きます。昆虫の6本の足の焦点を調整します。
3. 超極細の先端を備えた2つの高精度ピンセット( 材料表を参照)を準備します。一方のピンセットを使用して昆虫の体を押し下げて所定の位置に保ち、もう一方のピンセットを使用して片方の足を昆虫から慎重に引き抜きます。
   注:硬い殻を持つ昆虫の場合、眼科用メスを使用して片方の脚を切り取ることができます。
4. ピンセットで昆虫の胸をそっと押して、血リンパを傷口から流出させます。
   注:血リンパは、目に見える白い凝集のない透明な液滴として現れます。脂肪体の汚染を表す白い凝集がある場合は、脂質を廃棄します。

3.マイクロピペットによる血リンパ採取

1. マイクロピペットを準備します。容量1 μLのキャピラリーチューブ(材料表を参照)をピペットバルブに入れます(材料表を参照)。正確な測定を行うには、スケールラインが表示されていることを確認してください。
   注意: ピペットバルブの上部に小さな穴が必要です。
2. 血リンパを採取するときは、マイクロピペットのピペットバルブを持ち、毛細管を虫の傷の近くに置きます。毛細血管の先端を血リンパに触れるだけで傷口から滲み出る血リンパを採取します。
3. ピペットバルブ上部の小さな穴を指で少し塞いで、キャピラリーチューブ内の液体が目的のスケールラインに達したときに吸収プロセスを停止します。
   注:脂質汚染やチューブの詰まりを避けるために、1μLの血リンパのサンプルを絶え間なく迅速に収集してください。
4. ピペットバルブを押して、採取した血リンパを100 μLのPBSバッファー(137 ミリモル/L NaCI、2.7 ミリモル/L KCI、4.3ミリモル/L Na 2 HPO 4、1.4ミリモル/L KH 2 PO 4、pH 7.2-7.4)に排出します。
   注:キャピラリーチューブはPBSバッファーに挿入されます。
5. 血リンパの別の1μLサンプルを収集するときは、新しい毛細管に変更してください。

4.クーマシーブルー染色

1. ステップ3に記載されているプロトコルに従って、第3段階の幼虫から同じ容量(1μL)の血リンパサンプルを3つ収集し、収集した血リンパをPBSバッファーに排出して、総容量を100μLにします。
2. 25 μLの5xタンパク質ローディングバッファー(250 mmol/L Tris-HCI [pH 6.8]、10% W/V SDS、0.05% W/V ブロモフェノールブルー、50% W/V グリセロール、5% W/V β-メルカプトエタノール)を100 μLの希釈血リンパサンプルに加え、加熱してタンパク質を変性させます。
3. 20 μLの煮沸サンプルを10%SDS-PAGEタンパク質ゲル( 材料表を参照)にロードして、タンパク質を分離します。
4. ゲルをクマシーブルー溶液(1 gのクマシーブリリアントブルーR-250を250 mLのイソプロパノール、100 mLの氷酢酸、および650 mLの_ddH2Oと混合し、ろ紙を使用して粒子をろ過する)で室温で1時間染色し、次に脱色溶液(100 mLの酢酸、 400mLのメタノール、500mLのddH₂O)。

5. タンパク質濃度測定

1. 10 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) を PBS バッファーで 5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、および 0.3125 mg/mL に希釈し、2 倍希釈法を使用します。
2. ステップ5.1で5 μLのPBSバッファーと各濃度のBSA溶液を吸引し、1 mLの1x Bradford色素試薬( 材料表を参照)を加え、室温で5分間インキュベートします。対照としてブラッドフォード色素試薬中のPBSバッファーを使用し、OD = 595 nmでゼロにします。残りの各タンパク質濃度の吸光度値を測定し、検量線を作成します。
3. 幼虫、雌、雄のSBPH由来の血リンパ1 μLをPBSバッファー100 μLに加え、サンプルを1,000 x g で4°Cで10分間遠心分離して血球を除去します。
4. 90 μLの上清を新しい遠沈管に吸引し、ステップ5.2の指示に従って上清の吸光度値を測定します。
5. 検量線の回帰式に従って血リンパサンプルのタンパク質濃度を計算します。実験には、3つの生物学的複製と3つの技術的複製を含めます。

6. 顕微鏡検出

1. マイクロピペットを使用して、さまざまな発達段階にある10〜15個のSBPHから血リンパを収集します。採取した血リンパを4%パラホルムアルデヒド溶液20μLの入ったチューブに加えます( 材料表参照)。混合物を室温で30分間インキュベートして血リンパを固定します。
2. 20 μLの固定血球をシランでコーティングしたスライドの中央にピペットで固定します( 材料表を参照)。
3. スライド乾燥ラックで液滴を乾燥させます。
   注意: 過度の乾燥は避けてください。
4. サンプルを金退色防止試薬4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で覆い(材料表を参照)、倒立顕微鏡でスライドを検査します(材料表を参照)。

7. 細胞の定量

1. マイクロピペットでSBPHから1 μLの血リンパを採取し、20 μLのPBSバッファーに溶解します。
2. 血リンパサンプルをPBSバッファーで5倍に希釈します。
3. 20 μLの血リンパ溶液を細胞計数チャンバーの中央にピペットで入れます( 材料の表を参照)。液滴をカバーガラスで覆います( 材料表を参照)。
4. 倒立顕微鏡下で、細胞計数チャンバー(補足図1)の5つの正方形の細胞を数えます( 材料表を参照)。各実験に3つの技術的複製を含む3つの生物学的複製を含める。
   細胞/μL = 5つの中央の正方形の合計数 × 5 ×希釈係数 × 10⁴

8. 統計解析

1. 対応するソフトウェアを使用して統計分析を実行します( 材料表を参照)。新しいファイルを作成し、列を選択してデータをインポートし、棒付きの散布図を生成します。
2. 列の統計量を使用してデータの各グループの平均と SD を計算し、一元配置分散分析ツールを使用してグループ間の差の有意性を評価します。3つの独立した実験で3つの生物学的反復から平均とSDを決定します。

マイクロピペットモデルと血リンパ採取
キャピラリーチューブの毛細管力に基づいて作用するシンプルなマイクロピペットを開発しました。マイクロピペットは、キャピラリーチューブとピペットバルブで構成されています(図1A)。キャピラリーチューブは、1μLから20μLの範囲のさまざまな容量サイズで入手可能であり、キャピラリーチューブの容量は要件に応じて選択されます。小容量のチューブの非常に微細な開口部は血リンパなどの液体を吸収しにくくなる可能性があるため、容量の小さいキャピラリーチューブは推奨されません。ピペットバルブの上部には、血リンパ採取中に塞ぐことができない穴があります。このピペットバルブは、液体収集中にマイクロピペットを保持するのに便利であり(図1B)、収集された液体をキャピラリーチューブから収集バッファーに移すのにも役立ちます。

本研究では、血リンパを採取しやすくするために、まずSBPHを氷または冷蔵庫で凍結させた。次に、これらの凍結SBPHを実体顕微鏡下でスライド上に局在させ、各SBPHの脚の1本を細いピンセットで引き抜きました(図1C)。大きな傷と最適な血リンパ採取を確実にするために、根元で脚を引き抜くのが最善です(図1Ca、 b)。脂肪体による汚染のリスクを最小限に抑えるために、白い凝集のない透明な液滴のみが収集されました(図1Cc)。マイクロピペットを使用して、所望の量の血リンパを吸収しました(図1Cd)。1μLの血リンパを採取するには、約30〜40匹の幼虫SBPHまたは8〜15匹の成虫SPBHを解剖する必要がありました。

採取した血リンパの分析
採取した血リンパの量を評価する方法としてマイクロピペットの精度を評価するために、異なるサンプルのタンパク質濃度を試験した。幼虫の血リンパを毛細管容量1 μLのマイクロピペットを用いて採取し、3つのタンパク質サンプルを別々に採取し、SDS-PAGEゲルを実行して試験した。結果は、3つのレーンのタンパク質量がほぼ等しいことを示した(図2A)。幼虫の場合、総タンパク質含有量は3.707 mg / mL±1.382 mg / mLでした。また、成人の女性と男性のSBPHから同量の血リンパを採取したところ、タンパク質濃度はそれぞれ3.515 mg/mL±1.400 mg/mLおよび3.621 mg/mL±0.860 mg/mLでした(表1)。3つのサンプル間でタンパク質に有意差はありませんでした(図2B)。

また、採取した幼虫の血リンパ内部の血球を観察し、血リンパ検体の質と純度を評価しました。血球のサイズは2〜20 nmの間で変化し、脂肪体は検出されませんでした(図2C)。同定された細胞の大部分は形質細胞であり、直径5〜15nmの範囲であり、しばしば凝集体25に現れた。次に、幼虫、成体雌、成体雄の血リンパの細胞濃度を数え、同定された細胞濃度はそれぞれ1.794 x 10 5/μL ± 0.614 x 10 5/μL、1.256 x 10 5/μL ± 0.603 x 10 5/μL、1.553 x 10 5/μL±0.474 x 10 5/μLでした(表2)。幼虫、成体雌、成体雄の血球細胞数は有意差を示さなかった(図2D)。これらの結果は、マイクロピペット採取法がSBPHから血リンパを採取するための確実かつ正確な方法であることを示しています。

図1:マイクロピペットモデルと血リンパ採取の概略図。 (a)マイクロピペット組成物。マイクロピペットは、キャピラリーとピペットバルブで構成されています。毛細管容積は1〜20μLの範囲である。ピペットバルブの上部と下部に小さな穴があります。毛細管が底の穴に挿入され、スケールが見えます。(B)マイクロピペットによる血リンパ採取の概要図。昆虫の腹部を上向きに保ち、脚を離し、血リンパの流出を誘発し、実体顕微鏡下で血リンパをピペットに採取します。(c)マイクロピペットによる血リンパ採取のプロセス。片方の足を先端の細いピンセットで根元で引き抜き(a)、昆虫の体を押して血リンパを流出させます(b、c)。創傷からの血リンパは毛細血管に集められる(d)。スケールバー = 500 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:SBPH血リンパの分析 。 (A)採取した幼虫血リンパの3回の反復を示すクマシーブルー染色。裾は血リンパを示します。(B)幼虫、雌、雄のSBPHの血リンパの総タンパク質濃度。 (C)SBPHの血リンパに存在する細胞をそれぞれ20倍と60倍の倍率で示す顕微鏡画像。核をDAPI(青色)で染色した。スケールバー = 50 μm。 (D)幼虫、雌、雄のSBPHの血球密度。平均およびSDは、3つの独立した実験から計算した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:異なるSBPHからの血リンパのタンパク質濃度。 データは3つの生物学的反復から得られた。

表2:異なるSBPHからの血リンパ中の血球の総濃度。 データは3つの生物学的反復から得られた。

補足図1:セル数の決定。 4つの角の正方形(1、2、3、および4)と中央の正方形(5)は、セルカウントチャンバーでカウントされます。境界線セルの場合、2 つの境界 (上と左) のみがカウントされます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は、利益相反がないことを宣言します。