エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

Summary

このプロトコルは生体 外で 組み立てられ、electroporationによって渡されるCas9-sgRNAのribonucleoproteinの複合体を使用してマウス骨髄得られたマクロファージのゲノム編集のためのプロシージャを記述する。

Abstract

マウス由来の骨髄由来マクロファージ(BMDM)は、組織マクロファージの複雑な生物学を研究するための重要なツールです。初代細胞として、不死化マクロファージ細胞株よりもin vivo でのマクロファージの生理機能を忠実にモデル化し、すでに定義された遺伝的変化を持つマウスに由来することができます。しかし、BMDMの遺伝子機能を破壊することは、依然として技術的に困難である。ここでは、遺伝子機能を破壊するフレームシフト変異をもたらす小さな挿入および欠失(インデル)の導入を可能にする、BMDMにおける効率的なCRISPR/Cas9ゲノム編集のプロトコルを提供します。プロトコルは単一ガイドRNA (sgRNA-Cas9)を総合し、electroporationによって渡すことができる浄化されたsgRNA-Cas9のribonucleoproteinの複合体(RNPs)を形作る方法を記述する。また、ルーチンのサンガーシーケンシングと無料で入手できるオンライン分析プログラムを使用して、編集効率を監視するための効率的な方法も提供します。プロトコルは1週間以内に実施でき、プラスミド構築は必要ありません。通常、85%から95%の編集効率が得られます。

Introduction

マクロファージは、組織の修復と免疫に重要な役割を果たす自然免疫細胞です^1,2。マウスRAW 264.7細胞やヒトTHP-1細胞などの不死化マクロファージ細胞株は、RNA干渉またはCRISPR/Cas9 ^3,4用のベクターを送達することによる、堅牢な増殖や遺伝子破壊の容易さなど、いくつかの有益な特性を持っています。しかし、発がん性形質転換はそれらの生理機能を劇的に変化させ、その結果、いくつかの経路の異常な活性化と他の経路の応答の抑制が生じます^5,6。初代骨髄由来マクロファージ(BMDM)は、in vivoマクロファージの生理機能をより厳密に再現しているが、これらの初代免疫細胞におけるプラスミドトランスフェクションとウイルス形質導入の両方の効率が低いため、遺伝子操作は依然として困難である^7,8。したがって、遺伝子機能を破壊するためのより効率的な方法が必要です。

CRISPR/Cas9ゲノム編集は、哺乳類細胞を含むさまざまな生物学的システムにわたる遺伝子操作のための強力なツールである^9,10,11,12。化膿連鎖球菌Cas9タンパク質は、配列特異的なガイドRNAと複合体を形成すると、二本鎖DNAを効率的かつ特異的に切断します。切断されたDNAの非相同末端結合(NHEJ)によるDNA修復は、フレームシフト変異を引き起こす小さな挿入または欠失(インデル)をもたらします。初期の研究では、Cas9とsgRNAはプラスミドまたはレンチウイルスベクターを介して送達され、これらは多くの細胞株に効果的な送達方法である^9,10。しかし、初代細胞、特に初代免疫細胞は、トランスフェクションまたは形質導入によるベクター送達の効率が低いため、これらの方法に抵抗性を示すことがよくあります。その後、in vitroでsgRNA-Cas9複合体を作製し、エレクトロポレーションを介して送達する方法が開発され、これらの方法はさまざまな細胞タイプで高効率を達成しています^13,14。この結果は、このアプローチを用いて初代マクロファージのゲノム編集を行う可能性を示唆しています。

ここでは、sgRNA-Cas9リボ核タンパク質複合体(RNP)を使用して一次BMDMでゲノム編集を行うためのプロトコルを提供します。これには、初代免疫細胞に存在する免疫センサーの活性化を緩和する手順が含まれており、最小限の毒性で標的遺伝子座で最大95%の編集が可能です。このプロトコルには、ルーチンのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびサンガーシーケンシングを使用して編集効率を評価するワークフローも含まれており、その後、十分に検証されたオンラインソフトウェアツールである分解によるインデルの追跡(TIDE)¹⁵によるin silico分析が行われます。

Protocol

1. sgRNAの設計

注:このステップでは、標的配列の選択とsgRNAの設計について説明します。最初の大きなコードエクソンにあるガイドを設計することは、翻訳されたタンパク質がオープンリーディングフレームの早い段階で破壊されるようにするのに役立ちます。また、同じエクソン内にあるターゲット配列を選択することで、編集効率の解析が効率化されます(ステップ6)。このプロトコルで提供されるゲノム編集の例では、 Src 遺伝子と Cblb遺伝子 の最初のエクソン、およびマウスゲノムの非コード Rosa26 遺伝子座を標的とするsgRNAを使用しました。

1. いくつかの無料のオンライン設計ツールの1つを使用して、標的とする20のヌクレオチドゲノム配列を同定します(表1)。Cas9活性は選択した特定のガイドによって異なり、高活性ガイドの 先験的 予測は不可能であるため、各遺伝子内で重複しない4〜5つのガイドを選択します。
   注:ターゲット遺伝子座の配列に対するガイドの適切な向きを確保することが重要です。設計ツールは通常、どの染色体鎖を標的とするかに関係なく、5'から3'の配向でガイド配列を提供します。鎖の配向を確認するには、標的ゲノム配列の3'のすぐそばに 化膿菌 Cas9(nGG)のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列があることを確認します。sgRNA配列にはPAMは含まれていません。

2. sgRNA合成

注:このステップでは、PCR を使用して sgRNA を合成し、 in vitro 転写(IVT)用のテンプレートを生成し、スピンカラムを使用して sgRNA を精製する方法について説明します(図 1A)。カスタム合成sgRNAは、PCR/IVTの代替としていくつかのベンダーから市販されています。

1. PCRを実施して、T7 RNAポリメラーゼのIVTテンプレートを作製します。PCR反応では、遺伝子特異的ガイド配列を持つ短い個々のプライマーに加えて、T7 RNAポリメラーゼプロモーターとトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)配列(表2)を含むユニバーサルプライマーを使用します。
   1. これは、非増幅オーバーラップ拡張ステップです。PCR バッファーを 1 倍に希釈し、さらに 1 mM MgCl₂ を添加します。次に、0.25 μL のハイフィデリティ DNA ポリメラーゼ、0.5 mM デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)、0.02 mM ガイド特異的プライマー、0.02 mM T7 リバースロングユニバーサルプライマー(表 2)を添加して、総容量 46 μL にします。次に、チューブをサーモサイクラーに入れ、95°Cで15秒、37°Cで15秒、72°Cで15秒の2サイクルを実行します。反応を氷上で冷却します。
   2. これがPCR増幅ステップです。各反応液に、25 mMの前方増幅プライマー2 μLと25 mMの逆増幅プライマー2 μLを添加します。最終反応容量は50μLです。 95°Cで30秒間変性します。 次に、95°Cで15秒、65°Cで20秒、72°Cで15秒の35サイクルを実行します。72°Cで2分間、さらに伸長を行います。
   3. 2%アガロースゲルでPCR反応産物を確認します。オーバーラップ伸長PCRにより、遺伝子特異的20ヌクレオチドガイドの上流にT7プロモーター、すぐ下流にtracrRNAを持つ127 bpのdsDNA分子が得られます(図1B)。
2. IVTテンプレートの精製:これに適したプロトコルやキットは数多くあります。このプロトコルは、固相可逆固定化(SPRI)ビーズを使用します。50 μLのPCR産物と90 μLのビーズを混合し、メーカーの指示に従ってください。40 μLのバッファー(5 mM Tris、0.1 mM エチレンジアミン四酢酸[EDTA])を添加し、65 °Cで5分間加熱してDNAを溶出します。
3. 波長260nmの吸収を用いてIVTテンプレートのDNA濃度を測定します。IVTには少なくとも50 ng/μLのDNA濃度が必要です。IVTテンプレートは-20°Cで保存できます。
4. IVT反応
   1. 高収率のIVTを製造するように設計された市販キットを使用してください( 材料表を参照)。メーカーの推奨に従って、IVT反応を実行します。20 μLの反応液に250 ngのIVTテンプレートを使用して、37°Cで4〜16時間インキュベートします。
   2. 2% アガロースゲル上で 1 μL の反応液を流して、IVT sgRNA 産物を確認します。70 bp dsDNA と同様に、明るい RNA バンドが観察されます(図 1C)。必須ではありませんが、シャープで分離されたバンドを得るには、尿素を含むRNAサンプルバッファーを使用し、ロード前にサンプルを65°Cで5分間変性させます。
      注:一部のガイドRNAでは、RNAの二次構造の違いにより、かすかな高分子量バンドとわずかな移動の違いが見られる場合があります。
5. sgRNA IVT産物を脱リン酸化して、RIG-I(外来RNAセンサー)の活性化とエレクトロポレーション後のその後の細胞死を最小限に抑えます。20 μL の IVT 反応ごとに、69 μL の分子グレードの水と 15 U のウシ腸ホスファターゼ(CIP)を 1x CIP バッファーに加えます。37°Cで2時間インキュベートします。
6. IVTテンプレートを分解して、エレクトロポレーション後の細胞死を引き起こす細胞DNAセンサーの活性化を最小限に抑えます。各IVT反応に、2 UのRNaseフリーDNaseを添加します。37°Cで15分間インキュベートします。 IVT製品は、-20°Cで1日、または-80°Cで数ヶ月間保存できます。
7. スピンカラムを用いてIVT産物を精製します。このステップでは、SPRIビーズ精製キットは劣ります。
   1. 220 μL の結合バッファーを IVT 産物に添加し、続いて 100% 分子生物学グレードのエタノール 1 mL を添加して、RNA をカラムに結合させます。よく混合し、カラムをロードします。その後、製造元の指示に従ってください。sgRNAの汚染を避けるために、層流バイオセーフティキャビネットで最終洗浄を行います。
   2. 汚染を避けるために、層流フードで溶出を行ってください。30 μL の滅菌済み 10 mM Tris バッファー(pH 8.0)を使用して RNA を溶出します。
8. 波長260nmの吸光度を測定してsgRNAの濃度を測定します。
   注:一般的な sgRNA 収量は 100 μg 以上です。
9. sgRNAを-80°Cで保存します。 3回以上の凍結融解サイクルを避けるためにアリコートを作ります。

3. エレクトロポレーションの準備

注意: 汚染を避けるために、すべてのステップは層流フードで実行する必要があります。このプロトコルでは、10 μLチップの市販のエレクトロポレーションシステム( 材料表を参照)を使用します。

1. 使用前にBMDMを48〜72時間解凍し、非組織培養(TC)処理プレートで展開します。
   注:反応ごとに、4 x 10⁵ セルが必要です。
2. 反応アセンブリ用のPCRチューブを滅菌します。1回の反応につき1本のPCRチューブを調製し、サーモサイクラーで98°Cで10分間加熱します。 チューブをバッチで準備し、閉じて保管します。使用する準備ができたら、滅菌したPCRチューブを氷上に置きます。
3. ピペットステーションを70%エタノールで洗浄し、層流フードに入れます。パラメータを 1,900 V、20 ms、1 パルスに設定します。
4. トランスフェクションチューブを無菌状態に保つように注意してパッケージから取り出し、3 mLの「E」バッファーを充填します。エレクトロポレーションの前に、Eバッファーが室温にあることを確認してください。チューブをステーションに挿入し、カチッと音がするまで押し下げます。
5. 各反応について、2.5 μL の sgRNA を 1,100 ng/μL の濃度で分注します。 sgRNA を 0.9 mM CaCl₂ および 0.5 mM MgCl₂ (PBS + Ca/Mg)で冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈します。氷の上に置いておきます。
6. 細胞用の12ウェルコーティングされていないプレートと、培地を保持するための追加の24ウェルプレートの2つのプレートを準備します。反応ごとに1.5 mLの抗生物質を含まない培地を24ウェルプレートのウェルに分注します。
7. Cas9タンパク質を調製します。無菌精製Cas9タンパク質の商業的および学術的なサプライヤーがいくつかあります。Cas9 を冷 PBS + Ca/Mg で最終濃度 20 μM に希釈します。各エレクトロポレーション反応について、1 μL の 20 μM Cas9 を滅菌 PCR チューブに分注します。氷の上に置いておきます。
8. エレクトロポレーション用の細胞を準備します。
   1. 増殖培地を取り除きます。CaCl₂ および MgCl₂ を含まない PBS (PBS-Ca/Mg) を使用して細胞を洗浄し、接着を促進する血清と二価の陽イオンを除去します。次に、PBS + 1 mM EDTAを添加し、細胞が剥離し始めるまで室温で約5分間インキュベートします。
   2. ピペットでゆっくりと上下に動かし、細胞を剥がします。細胞をタンパク質吸着性の低い15 mLチューブに移します。細胞を500 x g で5分間ペレット化します。
      注:マクロファージはプラスチック製品に付着します。低タンパク質吸着遠心チューブを使用すると、細胞収量が大幅に向上します。
   3. PBS + EDTAでの細胞の長時間のインキュベーションを避けるために迅速に作業します。上清の大部分を取り除き、チューブ内に約1 mLの上清を残します。残りの上清に細胞を再懸濁し、タンパク質吸着性の低い1.5 mLマイクロチューブに移します。
   4. 数える細胞の小さなアリコートを取り除きます。室温で500 x g で5分間遠心分離することにより、残りの細胞をペレット化します。
   5. 遠心分離中は、細胞をカウントし、Cas9チューブとsgRNAチューブを室温まで温めます。
   6. 細胞ペレットから上清をすべて取り除きます。細胞をPBS + Ca/Mgに4 x 10⁷ cells/mL(反応10 μLあたり4 x 10⁵ 細胞)の濃度で再懸濁します。
      注:各キットには、限られた量のエレクトロポレーションバッファー(バッファーR、バッファーT)が付属しています。しかし、PBS + Ca/Mgを用いたエレクトロポレーション効率は、独自の緩衝液と同等であることがわかりました。
   7. 異なる遺伝子のsgRNAをエレクトロポレーションする場合は、sgRNA間のクロスコンタミネーションを避けるために、遺伝子ごとに異なる低タンパク質結合チューブに細胞を分注します。エレクトロポレーションの準備が整うまで、細胞を室温で保ちます。

4. RNPアセンブリ

1. 沈殿を防ぐために、sgRNAとCas9を室温に保ってください。滅菌したPCRチューブで希釈したCas9 1 μLに2.5 μLのsgRNAを加えます。沈殿を防ぐために、sgRNAを15秒かけてゆっくりと分注し、混合します。
2. 室温で5分間インキュベートし、RNP複合体を形成します。

5. エレクトロポレーションによるRNP導入

1. エレクトロポレーションチップ(キュベット)を準備します。プランジャーを押し下げてステムを伸ばします。茎を先端に挿入します。
   注意: チップがしっかり固定され、プランジャーがスムーズにスライドし、チップシースを超えて伸びていることを確認してください。先端の位置が適切でないと、先端に気泡が入り込み、先端が故障する恐れがあります。
2. ピペッティングで上下させて細胞を再懸濁し、エレクトロポレーションチップに細胞をロードします。気泡を避けながら、チップの容量10 μLをすべて引き出します。
3. ネガティブコントロールのsgRNAから始めて、エレクトロポレーションチップ内の細胞10 μLを、ステップ4のRNP3.5 μLを含むサンプルチューブに移します。ピペットで上下に3回動かしてよく混ぜます。10 μLの混合物をチップに戻し、気泡がないことを確認します。
4. チップをエレクトロポレーションステーションに入れ、バッファーに下げます。無菌性を維持するために、プラスチック表面に先端が接触しないようにしてください。タッチスクリーンディスプレイの[ スタート ]を押します。
5. 完了すると、ディスプレイにパルスが成功したことが示されます。デバイスからピペットを取り出し、ラベル付けされたコーティングされていない12ウェルプレートのドライウェルに細胞を入れます。
6. 15 mL の PBS + Ca/mg で 2 回ピペッティングしてチップをすすぎます。先端が何にも触れず、無菌状態を保っていることを確認してください。
   注:多くの実験では、不活性ネガティブコントロールsgRNAサンプルの後や、遺伝子ごとに4〜5個のsgRNAを検査し、編集効率のみを読み出すガイド活性の初期評価中など、複数のサンプルにチップを再利用することが可能です。ただし、編集した細胞の機能解析では、少量のsgRNAや細胞のキャリーオーバーが実験結果に影響を与える可能性があるため、遺伝子ごとに新しいチップが推奨されます。
7. 直ちに1 mLの抗生物質を含まない培地(ステップ3.6で分注)を細胞に加え、プレートを静かに振とうして混合します。
8. 残りの反応について、手順5.2〜5.6を繰り返します。
9. 細胞をインキュベーターに戻します。
10. エレクトロポレーションの1〜2時間後に細胞の生存率を確認します。細胞は>90%接着している必要があります。オプション:エレクトロポレーションの1〜2時間後にゲンタマイシン(5 μg/mL)を細胞に添加し、下流の実験に支障をきたさない場合は、コンタミネーションを防ぎます。

6. 編集効率の評価

注:ほとんどの編集は48時間後に完了します。

1. エレクトロポレーション後48時間で細胞単分子膜を確認します。セルのコンフルエントが50%を超える場合は、さらに進みます。細胞が<50%コンフルエントの場合は、さらに1〜2日待ちます。編集効率を決定するためのゲノムDNA解析には、下流の実験に必要な細胞に加えて、1 x 10⁵ 細胞が必要です。
2. ゲノムDNA(gDNA)を調製します。
   1. 細胞をPBS(-Ca/Mg)で洗浄します。1 mL の PBS + 1 mM EDTA を加えます。細胞がプレートから剥離し始めるまで、室温で約5分間インキュベートします。
   2. ピペッティングで細胞を剥離します。タンパク質結合性の低いマイクロチューブに移します。
   3. セルをカウントし、1 x 10⁵ セルのアリコートを取り除きます。残りの細胞は、さらなる実験で使用するために再播種することができます。一般に、実験はエレクトロポレーションの5日後に行われ、タンパク質の崩壊を可能にします。
   4. gDNA分析用の細胞をマイクロチューブ内で最高速度で15秒間ペレット化します。
   5. ペレットを50 μLの溶解緩衝液に再懸濁します。ボルテックスしてチューブの壁に付着した細胞を剥離し、98°Cで10分間加熱して細胞を溶解し、内因性DNaseを不活性化します。
   6. チューブを氷の上に置きます。
   7. 1 μL のプロテイナーゼ K (20 mg/mL) を加えます。37°Cで少なくとも1時間インキュベートします。便宜上、一晩置いておくことができます。
   8. 98°Cで10分間加熱し、プロテイナーゼKを不活性化します。
   9. 室温で5分間、最高速度で遠心分離します。DNAを含む上清を取り除きます。それ以上の精製を伴わないこの粗製製剤は、ほとんどのPCR反応でうまく機能します。
3. サンガーシーケンシングで編集効率を評価します。
   1. PCRプライマーは、ほとんどの5'ガイド部位の200-300 bp上流、およびほとんどの3'ガイド部位の200-300 bp下流で設計します。標準的なアンプリコンサイズは~500 bpです。ネストされたシーケンシングプライマーは、最も近いガイド部位から少なくとも125 bp離して設計します(図2A)。
   2. 2 μL の gDNA を使用して PCR を実行します。
4. シーケンシングのためにPCR産物を準備します。このプロトコルは、エキソヌクレアーゼI /エビアルカリホスファターゼ(ExoI / SAP)処理を使用します。市販のDNA精製キットも機能しますが、より多くのハンズオン時間が必要です。
   1. 15 μLのPCR産物を調製します。水 7.5 μL、10x ExoI バッファー 1 μL、ExoI 10 U、SAP 1 U を加えて、サンガーシーケンシングを妨げる dNTP およびプライマーを分解します。
   2. 37°Cで30分間インキュベートし、続いて85°Cで20分間インキュベートして酵素を失活させます。
5. Exo/SAP処理PCR産物のサンガーシーケンシングを実施します。既知量のDNAサイズマーカーを使用して、サンプル中に存在するPCR産物のサイズを推定します。TIDEソフトウェアは、編集効率を正確に推定するために高品質のシーケンスクロマトグラムを必要とするため、シーケンシング反応には最適化が必要な場合があります。未編集の遺伝子座のシーケンスクロマトグラムは、バックグラウンドが最小限に抑えられた明瞭なピークが得られます(図 2B、C)。
6. 編集効率を推定するには、TIDE を使用して、編集した gDNA と未編集のコントロール gDNA を使用してサンガーシーケンシングクロマトグラムファイルを解析します。(表1、 図2)。サンガーシーケンシングファイルをアップロードし、デフォルト設定でソフトウェアを実行します。

Results

IVT テンプレートは 127 bp の PCR 産物です(図 1B)。完全長IVT産物は98 nt RNAで、70 bpの二本鎖DNA断片と同様に遊走します(図1C)。

エレクトロポレーション後、細胞は>90%生存可能であり、総細胞数は開始細胞数の>70%である必要があります。結果として生じる変異細胞のプールは、Cas9切断部位の近くから始まる多様なインデルのセットを持つはずです。PCRおよびサンガーシーケンシングによる標的遺伝子の解析により、Cas9切断部位の下流の各位置に複数のヌクレオチドが見られるはずです(図2)。

Discussion

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いたゲノム編集は、BMDMの遺伝子機能を効果的に破壊することを可能にします。編集効率は、標的配列や遺伝子によって異なります。典型的には、4〜5個のsgRNAをスクリーニングして、活性の高いものを同定する。一部の遺伝子座は編集効率が低く、おそらくクロマチン構造が原因です。このような場合は、編集効率を高めるためにいくつかの変更を加えることができます。2つの活性型sgRNAを同じエクソンに共送することで、一部の遺伝子の編集が改善されます。ただし、2つのガイドを同時トランスフェクションすると、TIDEの精度が低下する可能性があることが観察されています。そのため、ウェスタンブロッティングなどの編集を評価するための代替技術が必要になる場合があります。さらに、市販のNHEJエンハンサーを含めると、編集効率が~20%向上することがよくあります(図3)。

このアプローチにはいくつかの利点があります。sgRNA-Cas9を細胞に直接送達するには、BMDMを形質導入するためのプラスミド構築やレ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ラッセル・バンスからの	3T3-MCSF細胞株	なし
Alt-R Cas9 エレクトロポレーション・エンハンサー	IDT	1075915
Ampure XP 試薬ビーズ	ベックマン・コールター	A63880
子牛腸内アルカリホスファターゼ	NEB	M0525S
DNase	NEB	M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mMCaCl2 および 0.5mM MgCl2)	Thermo Fisher	14040-133
DPBS -Ca/Mg	Thermo Fisher	14190-144
ExoI	NEB	M0293S
Fetal Calf Serum (FCS)	Corning	35-015-CV
Herculase DNA ポリメラーゼ & バッファー	Agilent	600677
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2040S
LoBindコニカルチューブ 15 mL	Eppendorf	30122216
LoBind Eppendorf チューブ 2 mL	Eppendorf	22431102
NEBuffer r2.1	NEB	B6002S
ネオントランスフェクションシステム	サーモフィッシャー	MPK5000、MPP100、MPS100
ネオントランスフェクションシステム 10 uL チップ	サーモフィッシャー	MPK1025またはMPK1096
PBS + 1mM EDTA	ロンザ	BE02017F
プロテイナーゼ K	サーモフィッシャー	EO0491
rCutSmart バッファー ExoI	NEB	B6004S
リボロック	サーモフィッシャー	EO0384
RNA ローディング色素	NEB	B0363S
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
S.pyogenes Cas9-NLS	カリフォルニア大学マクロラボ		UC以外の研究者は、以下の方法で入手可能です。https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation	IDT	1081059
SAP	NEB	M0371S