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方法論記事

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

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DOI：

10.3791/65272

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2023年8月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

この記事について

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サマリー

好中球細胞外トラップ(NET)はさまざまな疾患と関連しており、その可視化には免疫蛍光法がよく用いられます。しかし、染色プロトコルは様々であり、多くの場合、1種類の組織しか検査されません。ここでは、マウスおよびヒト組織におけるNETsの染色に一般的に適用可能なプロトコルを確立します。

要約

好中球細胞外トラップ(NET)は、細菌感染または外傷性組織損傷に対する応答として好中球によって放出されますが、自己免疫疾患および不妊性炎症にも関与します。これらは、二本鎖DNAフィラメント、ヒストン、および抗菌タンパク質で構成される網状の構造です。いったん放出されると、NETは血液や組織中の細胞外病原体を捕捉して死滅させることができます。さらに、NETは血小板の接着と凝固を刺激することにより、恒常性調節に関与します。しかし、NETの産生不全は、敗血症や自己免疫疾患などのさまざまな疾患とも関連しており、治療的介入の有望な標的となっています。電子顕微鏡法とは別に、免疫蛍光イメージングを用いたNETの可視化は、現在、組織におけるNET相互作用を実証する唯一の既知の方法の1つです。そのため、NETを可視化するための様々な染色法が利用されています。文献には、さまざまな染色プロトコルが記載されており、プロトコル間で大きなばらつきを示す4つの主要コンポーネントを特定しました:(1)使用する抗体の種類、(2)自家蛍光低減剤の使用、(3)抗原賦活化法、および(4)透過化。したがって、in vitro 免疫蛍光染色プロトコルは、異なる種(マウス、ヒト)および組織(皮膚、腸、肺、肝臓、心臓、脊椎椎間板)に適用できるように、この作業で体系的に適応および改善されました。固定とパラフィン包埋の後、厚さ3μmの切片をスライドに取り付けました。これらのサンプルは、修正された染色プロトコルに従って、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、シトルリン化ヒストンH3(H3cit)、および好中球エラスターゼ(NE)の一次抗体で染色しました。スライドを二次抗体で染色し、広視野蛍光顕微鏡で調べました。その結果を評価シートに従って分析し、その差を半定量的に記録した。

ここでは、さまざまな組織に適した最適化されたNET染色プロトコルを紹介します。新規一次抗体を用いてH3citを染色し、自家蛍光低減剤で非特異的染色を低減しました。さらに、NET染色には、一定の高温とサンプルの慎重な取り扱いが必要であることを実証しました。

概要

好中球細胞外トラップ(NET)は、2004年にBrinkmannらによって、アポトーシスや壊死とは異なる細胞死の経路として初めて可視化されました1。この経路では、好中球は脱凝縮したクロマチンを細胞外空間に放出し、以前は顆粒または細胞質に保存されていた抗菌タンパク質で覆われた大きなウェブ状の構造を形成します。これらの抗菌タンパク質には、好中球エラスターゼ(NE)、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、およびシトルリン化ヒストンH3(H3cit)が含まれ、これらはNETの間接免疫蛍光検出に一般的に使用されます2。この方法は、これらのタンパク質の定量的存在を特定するだけではありません。実際、NET に似た構造を具体的に検出できるという利点があります。NETでは、上記のタンパク質は細胞外DNAと共局在しており、染色された各タンパク質と細胞外DNAの蛍光シグナルの重なりによって検出できます。NETでは細胞外DNAとタンパク質の共局在によるシグナルの重複とは対照的に、無傷の好中球は共局在を示しません。ここで、NET成分は、通常、顆粒、核、および細胞質3に別々に貯蔵される。

最初の発見以来、NETは多くの疾患、特に炎症を伴う疾患において中心的な役割を果たしていることが示されています。NETは、血液や組織中の細胞外病原体を捕捉して死滅させることで、感染時に抗菌機能を示します4,5。しかし、NETは、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、アレルギー性喘息などの自己免疫疾患や高炎症反応にも関連しています6,7,8。NETは、アテローム性動脈硬化症、血小板癒着における血管閉塞と炎症を促進し、転移性癌に関与していると推測されています9,10,11。それにもかかわらず、それらは炎症性サイトカインレベルを低下させることにより抗炎症作用を有すると考えられている12。NETはより広い研究分野で関心を集めていますが、堅牢なNET検出方法は将来の研究の基本です。

免疫蛍光イメージングを用いた異なる組織におけるNETの可視化は複雑でカスタマイズが必要ですが、電子顕微鏡法は別として、現在、NETと細胞間の相互作用を可視化するための最も有名な方法の1つであり、主にホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPE)で使用されています13,14。.しかし、異なるラボが独自にカスタマイズしたプロトコルを使用しているため、NETイメージングの比較は困難です。これらのプロトコルは、抗体、抗原賦活化、または透過処理法の使用が異なり、多くの場合、特定のタイプの組織に最適化されています3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 、27。

BrinkmannらがFFPE組織におけるNETの免疫蛍光可視化を用いた最初の方法論的研究を発表した後、我々はこのプロトコルをより多様な組織および種に最適化したいと考えた15。さらに、広く適用可能な免疫蛍光プロトコルを確立するために、FFPE組織で免疫蛍光法を使用してNETを検出した研究とは異なる修正プロトコルをテストしました3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25、26,27。さらに、より特異的な細胞外染色のために新しいH3cit抗体を試した28。現在の染色プロトコルをさまざまな種や組織に体系的に適応させることにより、in vitroイメージングが改善され、好中球とNETの間の相互作用を局所的および全身的により適切に表現できるという仮説を立てています。

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プロトコル

この研究には、ドイツ、ハンブルクのハンブルク州動物研究局(Behörde für Justiz und Verbraucherschutz)によって承認された実験に由来するマウス組織が含まれていました(73/17、100/17、94/16、109/2018、63/16)。使用した組織は、敗血症モデルからのマウスの肺と結腸、および火傷した皮膚でした。8週齢の雄と雌のマウスを使用しました。科学目的で使用される動物の保護に関する欧州指令2010/63 / EUは、すべての実験で従いました。匿名化されたヒトサンプルには、新生児腸炎、火傷した皮膚、胆道閉鎖症、脊椎椎間板炎、および心筋の組織が含まれていました。ハンブルクの医学研究倫理委員会によると、サンプルはインフォームドコンセントを必要としませんでしたが、研究は委員会によって承認されました(WF-026 / 21)。

1. サンプル固定

  1. サンプルの固定、脱水、パラフィン包埋、切片化、およびマウントには、Abu AbedおよびBrinkmannに由来する次のプロトコルを使用します3,15。
    1. 40 gのパラホルムアルデヒド(PFA)を800 mLのトリス緩衝生理食塩水(pH 7.4(TBS))に溶解して、4%ホルムアルデヒド溶液を調製します。
    2. PFAが溶解するまで、ドラフト下で60°Cで混合物を撹拌します。溶液を室温(RT)に戻し、TBSで容量を1,000 mLに調整します。
    3. pHを7.4に調整します。4°Cで2〜3週間、または-20°Cで最大1年間保管してください。
  2. サンプルを固定するには、新鮮な組織をTBSバッファーに入れ、20 mm x 30 mm x 3 mm未満の断片に解剖します。組織切片を4%パラホルムアルデヒド溶液に12〜24時間浸します。
    注:元のプロトコルでは、2% PFA溶液を使用し、固定時間は8〜20時間でした。この方法では、20時間後に一部の組織切片が完全に固定されなかったため、PFA濃度を4%PFAに増加させました。
  3. サンプルを標識された組織処理カセットに移します。ラベルには耐溶剤性のマーカーまたは鉛筆を使用してください。
  4. 次にカセットを70%エタノールに1時間浸漬して、サンプルの脱水を開始します。次に、80%エタノール、90%エタノール、96%エタノール、および100%エタノールに2回浸し、各ステップを1時間持続させます。
  5. 100%キシレン(ジメチルベンゼン)に2回浸漬し、次に60°Cパラフィンに2回1時間浸漬します。
  6. 取り付けには埋め込み型を使用し、型を取り外す前にパラフィンを固めてください。
  7. 厚さ3μmの組織切片の切断にはミクロトームを使用します。
  8. ピンセットを使用して切断切片を37°Cの水浴に置き、表面に浮かせて組織の切断部を伸ばします。
  9. 切片を粘着スライドガラス(材料表)に置き、40°Cの加熱チャンバーで一晩乾燥させます。

2. サンプルの水分補給

  1. 脱パラフィンの場合は、スライドをスライドラックに積み重ね、キシレン置換培地リモネン(材料表)にそれぞれ5分間、1:1のリモネン/エタノール混合物に5分間浸します。
    注意: リモネンは50°Cで可燃性であり、アレルギー反応を引き起こす可能性があります。ドラフトの下で、目の保護具と手袋を着用して使用してください。直火に近づかないでください。
  2. スライドラックを100%エタノールに2回、96%エタノール、90%エタノール、80%エタノール、70%エタノールに1回ずつ5分間浸して、サンプルをエタノール系列に再水和します。
  3. スライドラックを脱イオン水(脱イオン水)に5分間浸し、残っているエタノールを洗い流します。

3. 自家蛍光遮断と抗原賦活化

  1. データシートに従って、pH 6のクエン酸ターゲット賦活化溶液(TRS)(材料表)を調製します。このTRSを10倍に濃縮します。したがって、脱イオン水で1:10に希釈します。プラスチック製の染色ジャーで96°Cに予熱します。
    注:TRSは、サンプル固定中に形成されたメチレン架橋を切断し、抗原エピトープを露出させます。これにより、一次抗体が標的抗原に結合することができます。濃縮TRSを2〜8°Cで8ヶ月間保管します。常に新しいTRSを準備してください。
  2. スライドラックからスライドを取り出し、ウェットチャンバーに入れます。各サンプルに自家蛍光低減剤(材料表)を1〜2滴ピペットで移します。5分間インキュベートします。
    注:自家蛍光低減剤は、内因性蛍光色素および固定剤によって引き起こされる固有の組織自家蛍光をブロックします。自家蛍光低減剤は室温で最長1年間保管してください。
    注:サンプルの乾燥やインキュベーション時間の超過を避けるために、組織の小さな部分のみで作業してください。
  3. スライドをスライドラックに戻し、60%エタノールで上下に1分間、未使用の自家蛍光低減試薬をすべて洗い流します。
  4. スライドラックを脱イオン水に5分間浸します。
  5. 抗原賦活化のために、スライドを予熱したTRSで染色ジャーに移します。ウォーターバス中で96°Cで10分間インキュベートします。
    注:TRSを96°Cに予熱し、96°Cで10分間のインキュベーション時間を確保できれば、96°Cのウォーターバスを電子レンジまたはスチームクッカーで代用できます。
  6. 染色ジャーを取り出し、ゆっくりと冷まして約60〜90分間RTします。
    注:プロトコルはここで最大4時間一時停止し、スライドをTRSに残すことができます。
  7. TRSを取り外しますが、スライドは瓶に入れたままにします。0.05% Tween(TBST、pH 7.4)のトリス緩衝生理食塩水でそれぞれ3分間2回すすぎ、残ったTRS残留物を洗い流します。
  8. 透過処理には、0.2% Triton をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)で調製し、染色ジャーに充填してサンプルを 10 分間透過処理します。
    注:透過処理により、固定サンプル中の細胞内標的タンパク質と一次抗体の結合が促進されます。
  9. スライドをTBSTで2回、毎回3分間すすぎます。
  10. ウェットチャンバーを準備し、スライドを置きます。スライドの余分な水分をペーパーティッシュで拭き取ります。すべてのサンプルを疎水性バリアペンで囲み、抗体溶液が流出しないようにします。
    注:サンプルを乾燥させないでください。小さなセクションで作業するのが最善です。

4. 非特異的抗体結合の阻害

  1. すぐに使用できるブロッキング溶液とロバ血清(材料表)を採取し、各サンプルに1滴ピペットで移します。室温で30分間インキュベートします。
    注:このブロッキングステップにより、サンプル上の非特異的結合部位への二次抗体の結合が最小限に抑えられます。これらの非特異的エピトープをブロックし、一次抗体を塗布した後、二次抗体は一次抗体に結合し、組織の表面と相互作用しません。このすぐに使用できるブロッキング試薬は、2〜8°Cで6か月間保存されます。
  2. スライドの端を硬い表面に軽くたたいて、スライドから余分なブロッキング溶液を取り除きます。洗い流さないでください。

5. 一次抗体

  1. 一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈します(材料表)。各サンプルに約 100 μL の最終溶液を使用します。NEおよびH3cit(R8)抗体およびアイソコントロールの場合は、5 μg/mLの濃度に希釈します。MPO および対応するアイソコントロールには、10 μg/mL を使用します。一次抗体ごとに1本のチューブを調製し、アイソコントロール抗体ごとに1本のチューブを用意します。
    注:H3cit(R8)/MPOまたはNE/MPOおよびそれらのアイソコントロールを組み合わせてNET染色を行うことができます。H3cit(R8)/MPOの組み合わせの場合、H3cit(R8)は5 μg/mL、MPOは10 μg/mLの最終濃度に希釈し、サンプルあたりの最終容量は100 μLになります。NE/MPO の場合、NE の場合は 5 μg/mL、MPO の場合は 10 μg/mL の最終濃度に希釈し、サンプルあたりの最終容量は 100 μL になります。アイソコントロールには、対応する各抗体と同じ濃度を使用してください。使用する抗体ごとに、必ず新しいピペットチップを使用してください。一次抗体は、4°Cで1〜2週間、-20°Cまたは-80°Cで最大1年間保存できます。
  2. 1枚のスライドに2つのサンプルを載せ、1つはアイソコントロール抗体に、もう1つはMPO/H3citまたはMPO/NE抗体の希釈に使用します。各サンプルに約100μLを使用し、抗体溶液を均一に広げます。
    注:サンプルを乾燥させないでください。アイソコントロール抗体と一次抗体を混同しないように注意してください。
  3. 湿式チャンバーで4°Cで一晩保存します。
  4. 翌日、スライドから余分な一次抗体溶液を取り除き、スライドをキュベットに積み重ねます。TBSTで毎回5分間3回すすぎ、残りの一次抗体溶液を洗い流します。

6. 二次抗体

  1. 二次抗体溶液を調製します。MPOにはdonkey-anti-goat、H3cit染色にはdonkey-anti-rabbitの2種類の蛍光二次抗体を使用します。それぞれを抗体希釈バッファーで7.5 μg/mLの濃度に希釈します(材料表)。
    注:二重染色には、励起領域が異なり、スペクトルの重複が最小限に抑えられた2つの蛍光抗体を使用してください。両方の二次抗体を混合し、各抗体の最終濃度が7.5 μg/mLになるまで希釈し、サンプルあたりの最終容量が100 μLになるようにします。抗体を光から保護します。二次抗体は、2〜8°Cで6〜8週間、または-80°Cで最大1年間保存できます。
  2. スライドをウェットチャンバーに保管し、各サンプルに100 μLの二次抗体溶液を加えます。室温で30分間インキュベートし、光から保護します。
  3. 余分な二次抗体溶液を軽くたたき取り、スライドをスライドラックに積み重ねます。PBSで満たされた染色ジャーにそれぞれ5分間ずつ3回浸漬し、残っている未結合の抗体を洗い流します。
  4. DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール)溶液(材料表)を調製し、脱イオン水で1μg/mLの濃度に希釈します。スライドラックをDAPI溶液の入った染色ジャーに浸し、室温で暗所で5分間インキュベートします。
    注:DAPIは、二本鎖DNAの蛍光染色剤として使用されます。調製したDAPI溶液は、複数回使用することができます。準備したDAPI溶液をRTに保存します。DAPI濃縮液は、-20°Cで最長1年間保存できます。
  5. スライドラックをPBSの入った染色ジャーに5分間浸し、余分なDAPI溶液を洗い流します。

7.サンプルの取り付けと保管、顕微鏡分析

  1. カバーガラスと封入剤(材料表)でサンプルをマウントします。
    注意: 少量の封入剤のみを使用し、余分な培地はウェットティッシュで拭き取ってください。手袋を着用し、カバーガラスやスライドから誤って媒体を拭き取らないようにしてください。気泡の形成を避け、綿棒を使用してカバーガラスをそっと押して、スライドから気泡を取り除きます。
  2. イメージングには、広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用します。
    注意: 最初にアイソコントロールのイメージを撮ります。蛍光フィルター(DAPIの青色フィルターを除く)の露光時間を、シグナルがほとんど検出されなくなるまで下げます。次に、この設定を使用して、対応するサンプルを調べます。蛍光チャンネルを使用して、個々のサンプルで蛍光シグナルを検出できる領域を探します。領域の画像を撮影した後、プログラムはすべてのチャンネルの複合画像を生成し、異なる蛍光シグナルを異なる色の重なりとして表示します。その後、ImageJなどのイメージングソフトウェアとの共局在化のために、画像をさらに分析することができます。
  3. スライドは4°Cで最大6ヶ月間保存できます。

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結果

プロトコールの最適化を開始する前に、NETの免疫染色にFFPE組織を使用した研究をPubMedで検索し、それらのプロトコルを比較することで、染色を成功させるための重要なステップを特定しました。最も有望なプロトコルの違いは、プロトコル最適化の主要なステップとして特定されましたが、互いにほぼ対応するステップは変更されませんでした(表1)。

表1:NETのFFPE免疫染色に関するPubMedの研究。 この表は、調査した研究における免疫染色プロトコルの変数を示しています。使用したプロトコルは、重要なステップに分けられ、互いに比較されました。次に、最も有望な違いのあるステップを最適化の重要なステップとして採用し、プロトコルに適合させました。一次抗体のインキュベーション時間(一晩、4°C)など、ほぼ一致するステップは変更されませんでした。

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ディスカッション

この研究では、NETをイメージングするための既存のプロトコルを、実際の染色プロセスから始めて、より多くの組織タイプに適応させ、最適化することを目指しました。この方法の最初の重要なステップは、最適な抗体の選択です。NEについては、ヒト組織上のマウス宿主由来のNE抗体を試しましたが、ウサギ宿主由来のNEと比較して信頼性の高い染色は示されませんでした。さらに、Thålinらは、細胞外染色のより特異的な抗体としてH3cit(R8)を提案しました。この抗体を広く使用されているtriH3cit(R2、R8、R17)と比較しました。私たちの研究は、H3cit(R8)抗体が使用濃度の細胞外シグナルについてのみ染色され、スライド上のNETの認識を容易にすることを示しました。この発見は、H3cit(R8)クローンが非シトルリン化ヒストンに対するオフターゲット交差反応性を減少させ、良好なNETシグナルを提供できるというThålinらの主張を支持する28。また、MPO染色では、ヒト組織とマウス組織に対するMPO抗体を比較しました。その結果、マウス/ヒト MPO 抗体はより信頼性の高い染色を示し、ヒトとマウスのサン...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、ドイツ研究協会(BO5534)によって設立されました。サンプルを提供してくださったAntonia Kiwitt氏、Moritz Lenz氏、Johanna Hagens氏、Annika Heuer博士、PDのIngo Königs博士に感謝します。さらに、著者らは、免疫蛍光顕微鏡法のサポートについて、UKE Microscopy Imaging Facility(中核施設、UKE Medical School)のチームに感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
      <強い>希釈
抗好中球エラスターゼ抗体100µgabcamAb 68672 1:100
抗ヒストンH3(シトルリンR2 + R8 + R17)抗体  100µgabcamAb 51031:50
抗ミエロペルオキシダーゼ抗体 [2C7] 抗ヒト 100 µgabcamAb 259891:50
抗ミエロペルオキシダーゼ抗体 [2D4] 抗マウス 50 & マイクロ;gabcamAb 908101:50
Axiovision顕微鏡ソフトウェア ツァイス4.8.2.
ロバ血清(READY TO USE)50mlGeneTex 
カバーガラスマリエンフェルド0101202
ダコ ターゲット検索溶液 クエン酸 pH6 (x10)ダコS2369
DAPI 25 mgロス6335.11:25000
DCS 抗体希釈 500 mLDCS 診断DCS AL120R500
ロバアリ ヤギ Cy3JacksonImmunoResearch705-165-1471:200
ロバ抗ウサギ AF647JacksonImmunoResearch711-605-1521:200
ロバ抗ウサギ Cy3JacksonImmunoResearch711-165-1521:200
フルオロマウント-G 実装培地Invitrogen00-4958-02
スライドガラスラックRothH552.1
ヒト/マウスMPO抗体R&DシステムズAF 3667 1:20
疎水性ペンKISKERMKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mgabcamAb 374151:2000 and 1:250
MaxBlock 自家蛍光還元試薬キット (RUO) 100 mlMaxvisionMB-L
顕微鏡カメラZeissAxioCamHR3
マイクロ波BoschHMT84M421
Mouse IgG1ネガティブコントロールDakoX0931 Aglient1:50 および 1:5
Normal Goat IgG ControlR&DシステムズAB-108-C 1:100
PBSリン酸緩衝生理食塩水(10x)Sigma-AldrichP-3813
PMP染色ジャーRoth2292.2
換え抗ヒストンH3(シトルリンR8)抗体100µgabcamAb 2194061:100
組換えウサギIgG、モノクローナル [EPR25A] - アイソタイプコントロール 200µgabcamAb 1727301:300
ROTI HistolRoth 6640
SuperFrost Plus スライドR. Langenbrinck03-0060
TBS トリス緩衝生理食塩水 (x10)Sigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP9416
ウォーターバスMemmert830476
ウォーターバス炊飯器reishungerRCP-30
ウェットチャンバーWeckert Labortechnik600016
Zeiss Widefield microscopeZeissAxiovert 200M
のブロッキング溶液GTX30972組

参考文献

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Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 9/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

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ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング
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