ここでは、非放射性化学発光検出を用いてテロメア長を定量するためのプロトコルについて、TAGGGテロメア長アッセイキットの様々な性能パラメータ(緩衝液量やプローブ濃度など)の最適化を中心に詳細に説明する。
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方法論記事
TAGGGテロメア長アッセイの性能パラメータの最適化
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
テロメアは染色体末端に存在する反復配列です。それらの短縮はヒト体細胞の特徴です。短縮は、末端複製の問題およびテロメア長の維持に関与するテロメラーゼ酵素の欠如のために起こる。興味深いことに、テロメアは、汚染物質、感染性病原体、栄養素、放射線などの細胞外因子によって影響を受ける可能性のある酸化ストレスや炎症などのさまざまな内部生理学的プロセスに応答して短くなります。したがって、テロメア長は、老化および様々な生理学的健康パラメータの優れたバイオマーカーとして役立つ。TAGGGテロメア長アッセイキットは、テロメア制限フラグメント(TRF)アッセイを使用して平均テロメア長を定量するために使用され、再現性が高いです。ただし、これは高価な方法であり、このため、サンプル数が多い場合は日常的に採用されていません。ここでは、サザンブロットまたはTRF分析と非放射性化学発光ベースの検出を使用して、テロメア長を最適化して費用対効果の高い測定を行うための詳細なプロトコルについて説明します。
概要
テロメアは、染色体の末端に存在する反復DNA配列です。それらはTTAGGGのタンデムリピートを持ち、染色体をほつれと末端複製の問題の両方から保護することによってゲノムの完全性を維持します、それは3'オーバーハングの一部がDNAポリメラーゼ1,2によって複製できないことを意味します。短いテロメアは細胞の染色体異常を引き起こし、そのため細胞は複製老化3と呼ばれる段階で永久に停止します。短いテロメアは、ミトコンドリア機能障害4,5や細胞機能障害など、他の多くの問題も引き起こします。
DNAテロメアの繰り返しは、細胞が分裂すると失われ、年間平均25〜200 bpの損失6、一定数の分裂後に細胞老化が生じます6。老化は併存疾患の頻度が高くなり、テロメアの長さが短くなるのが特徴です7。Menderによって記述されているように、テロメア制限フラグメント(TRF)分析は非常に高価な方法です8。このため、ほとんどの研究ではテロメ....
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プロトコル
注:以下のプロトコルで使用されるすべての試薬の詳細については、 材料の表 を参照してください。表 1 はラボ製の試薬と最適化された容量を記載し、 表2 は市販の試薬の使用濃度を示しています。
1. 細胞培養
- テロメア長を測定する細胞(ここでは卵巣腺癌細胞株であるA2780細胞を使用)を、10%ウシ胎児血清(FBS)、ストレプトマイシン、ペニシリン、およびアムホテリシンBを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)完全培地で6cmのペトリ皿に維持します。細胞が80%〜100%コンフルエントになるまで、5%の二酸化炭素を含む加湿および制御された環境で37°Cでインキュベートします。
- 培地を取り出し、5 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
- 細胞を1 mLのトリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)で処理し、37°Cで3〜5分間インキュベートして細胞を剥離します。
- 2 mLのDMEM完全培地を加えてトリプシンを不活性化し、遠心分離チューブに細胞を回収します。
- 細胞を2,348 × g で5分間ペレット化します。
- ペレットを1x PBSで洗浄し、2,348 × g で5分....
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結果
抽出したゲノムDNA(gDNA)を1%アガロースゲルで実行したところ、 図1Bに示すように良好な完全性を示し、サンプルをTRFのさらなるダウンストリーム処理に使用できることを示しています。次いで、TRFアッセイは、各工程で必要な溶液の量を改変することによって実施した(表 1 および 表2を参照されたい)。TRF信号ははっきりと見えました(図3)。したがって、溶液の量と濃度を変更することにより、結果に悪影響を与えることなくより多くのサンプルを処理でき、Telotool10などの無料で入手できるソフトウェアを使用してテロメアの長さを正常に決定できます。
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ディスカッション
サザンブロッティングを用いたテロメア長測定のための非放射性化学発光ベースの方法の詳細な手順について説明します。このプロトコルは、結果の品質を損なうことなく、いくつかの試薬を賢明に使用できるようにテストされています。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションバッファーは、最大5回まで再利用することができる。酵素濃度は、結果に影響を与えることなく、ゲノムDNA1.5〜2μgあたり10〜20Uの間で変化し得る。DIG標識分子量マーカーやハイブリダイゼーションプローブなどの他のいくつかのキットコンポーネントは、推奨よりも低い濃度で使用できます。最適化されたボリュームを 表 2 に示します。推奨量/濃度の半分でテストし、最適なパフォーマンスを見つけました。これらの手順に従うと、サンプルあたりのコストが大幅に削減されるため、研究者はこの方法を使用してテロメアの長さをより大規模に測定できます。
いくつかの公開されたTRFプロトコルがあります。市販のキットプロトコルを最適化して、費用対効果を高めました。このプロトコルは、放射能を使用しないため、公開さ.......
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開示事項
著者には利益相反はありません。
謝辞
プロトコルの最適化を最初に手伝ってくれたPrachi Shahさんに感謝します。A2780卵巣がん細胞株を提供してくださったManoj Garg博士に感謝します。EKは、バイオテクノロジー部門(No. BT/RLF/Re-entry/06/2015)、科学技術部門(ECR/2018/002117)、およびNMIMSシードグラント(IO 401405)からの研究助成金によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Cell Line | |||
| A2780 (卵巣腺癌細胞株) | ギフト | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (イメージングおよびUV架橋用) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | ||
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| エチレンジアミン四酢酸 | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| ナイロン膜 | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco,ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb はしご | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| ブロッキング溶液 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| 検出バッファー 10x | Telo TAGGG テロメア長アッセイキット | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG テロメア長アッセイキット | 12209136001 | |
| 消化バッファー | Telo TAGGG テロメア長アッセイキット | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG テロメア長アッセイキット | 12209136001 | |
| Hinf 1 (キットの代替品) | NEB | R0155T | |
| ローディング色素 | BIOLABS | N3231S | |
| マレイン酸バッファー 10x | Telo TAGGG テロメア長アッセイキット | 12209136001 | |
| 分子マーカー | Telo TAGGG テロメア長アッセイキット | 12209136001 | |
| プローブ | Telo TAGGG テロメア長アッセイキット | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG テロメア長アッセイキット | 12209136001 | |
| Rsa 1 (キットの代替品) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG テロメア長アッセイキット | 12209136001 ウォ | |
| ッシュバッファー | Telo TAGGG テロメア長アッセイキット | 12209136001 |
参考文献
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al.
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