膵臓癌細胞のミトコンドリアの微細構造変化を可視化する3次元技術

Summary

このプロトコルは、ミトコンドリアクリステを再構築して、高精度、高解像度、および高スループットの3Dイメージングを実現する方法について説明します。

Abstract

未知の情報が豊富であるだけでなく、3次元(3D)の視点から洗練された細胞小器官の微細構造の動的特徴を理解することは、機構研究にとって重要です。電子顕微鏡(EM)は、優れたイメージング深度を提供し、高解像度の画像スタックの再構築を可能にして、ナノメートルスケールでも細胞小器官の微細構造形態を調査できます。したがって、3D再構築は、その比類のない利点のために重要性を増しています。走査型電子顕微鏡(SEM)は、連続したスライスの同じ関心領域から大きな構造を3Dで再構築できるハイスループット画像取得技術を提供します。したがって、細胞小器官の真の3D微細構造を復元するための大規模な3D再構成におけるSEMの適用はますます一般的になっています。このプロトコルでは、膵臓癌細胞のミトコンドリアクリステを研究するために、連続超薄切片と3D再構成技術の組み合わせを提案します。これらの技術がどのように実行されるかの詳細は、オスミウム-チオカルボヒドラジド-オスミウム(OTO)法、シリアル超薄切片イメージング、および視覚化表示を含む、このプロトコルで段階的に説明されています。

Introduction

ミトコンドリアは細胞内で最も重要な細胞小器官の1つです。それらは細胞の生体エネルギーと代謝の中心的なハブとして機能し^1,2、癌において重要な役割を果たします³。膵臓がん(PC)は、その急速な広がりと高い死亡率のために、治療が最も困難ながん^の1つです4。主にミトコンドリアの形態の変化によって引き起こされるミトコンドリア機能障害^3,5,6,7は、^PC8の根底にある疾患メカニズムに関連しています。ミトコンドリアも非常に動的であり、これはネットワーク接続とクリステ構造の頻繁かつ動的な変化に反映されています⁹。クリステ構造の再形成は、ミトコンドリア機能と細胞状態に直接影響を与える可能性があり^10,11、腫瘍細胞の成長、転移、および腫瘍微小環境の変化中に著しく変化します^12,13。

近年、科学者たちはEM観察14,15,16,17を用いてこの細胞小器官を研究しています。たとえば、研究者は3D再構成技術を使用してミトコンドリアのダイナミクスを分析しました⁶、^7、18、19。電子顕微鏡画像の3D再構成の一般的な概念と方法は、早くも1968²⁰に正式に確立され、電子顕微鏡、電子回折、およびコンピューター画像処理を組み合わせてT4ファージテールを再構築することが含まれていました。これまで、電子顕微鏡3Dイメージング技術は、画像解像度21、自動化度22、処理量²³の面で大きな進歩を遂げ、組織レベルからナノメートルスケールのオルガネラ微細構造レベル²⁴まで、生物学研究においてますます幅広い規模で使用されてきました。近年、電子顕微鏡3Dイメージングも幅広い用途の有望な技術となっています^25、26、27。

ミトコンドリアクリステへの注目の高まりは、特に微細構造体積イメージングの本質的な要件を示しています。透過型電子顕微鏡(TEM)は、銅グリッド(400メッシュ)²⁸に集められたサンプルを視覚化するために使用され、電子ビームはセクションを通過します。しかしながら、銅グリッドの範囲が限られているため、同じサンプル²⁹の連続スライスを完全に画像化することは不可能である。これは、TEMイメージング中の標的構造の研究を複雑にする。さらに、TEMは、複数のスライスの切断と収集、およびそれらを順次イメージングするなど、時間がかかり、エラーが発生しやすい手動タスクに依存しているため²¹、大量のサンプルの微細構造再構成には適していません²³。現在、TEMカメラアレイ(TEMCA)³⁰ や2台の第2世代TEMCAシステム(TEMCA2)³¹など、短時間でハイスループットなイメージングを自動化する専用装置を使用することで、大容量サンプルイメージングの高解像度再構成を実現しています。ただし、このタイプのイメージングには、カスタマイズされた機器が必要なため、入手が容易で普遍的であるという利点はありません。

TEMと比較して、^SEM32、³³に基づいて大面積の数千のシリアル体積画像を自動的に生成する方法は、シリアルイメージングの効率および信頼性を高め^、より高いz解像度を提供する³⁴。たとえば、シリアルブロック面走査電子顕微鏡(SBF-SEM)と集束イオンビーム走査電子顕微鏡(FIB-SEM)はどちらも、高速、効率、解像度で微細構造の3D再構成を実現することを可能にしました^35,36。ただし、SBF-SEMのダイヤモンドナイフまたはFIB-SEM^33,37の集束イオンビームによるフライス加工によって、ブロック表面が機械的に削り取られることは避けられません。試料に対する2つの方法の破壊性のために、さらなる分析のために同じ標的構造を再び再構築することは不可能である³⁸、^39、40。さらに、EMを使用して癌細胞の3Dオルガネラ微細構造を再構築し、病理学的変化を観察することを試みた研究はほとんどありません¹²。このような理由から、膵臓がん細胞などのがん細胞の病態メカニズムをさらに解明するために、ウルトラミクロトームと電界放出型走査電子顕微鏡(FE-SEM)を用いて、ミトコンドリアの微細構造をクリステレベルで解析する新しい断面像を3次元再構成する技術を提案する。この技術により、効率的でアクセスしやすい方法で高解像度のデータを取得できます。ウルトラミクロトームを使用して作られた連続超薄切片は、グリッドケースに半永久的に保管し、数年後でも複数回再イメージングすることができます⁴¹。FE-SEMは、高解像度のイメージング、高倍率、汎用性を提供できるため、さまざまな研究分野でツールとして高く評価されています⁴²。オルガネラの微細構造を3Dで表示するために、FE-SEM ^43,44によって生成された後方散乱電子を使用して有用な解像度でシリアル2D画像スタックを生成する技術を使用して、特別な装置なしでターゲット領域またはそれらに関連する構造のハイスループットおよびマルチスケールイメージングを達成することもできます⁴⁵.電荷アーチファクトの生成は、取得した画像の品質に直接影響するため、滞留時間を短くすることが特に重要です。

したがって、本研究では、ミトコンドリアクリステ⁴⁶の3D構造を再構築するためにこのSEM技術で採用された実験手順について詳しく説明します。具体的には、従来のOTO標本作製法^44,47を用いたスライスサンプルの作成、ウルトラミクロトームスライスによる切片採取の完了、FE-SEMによる逐次2Dデータの取得など、Amiraソフトウェアを用いたミトコンドリア領域の半自動セグメンテーションと3D再構成のデジタル化を実現するためのプロセスを紹介します。

Protocol

1.材料の準備

1. 12 mLのDMEM培地(10%ウシ胎児血清および100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン)で2 x 10⁶ Panc02細胞を培養し、5%二酸化炭素および95%空気の雰囲気下で37°Cおよび95%湿度で48時間維持します。
2. Panc02細胞を回収し、28 x g で2分間遠心分離した後、上清を廃棄します。サンプルが適切なサイズ(1 x 10⁷ セル)であることを確認してください、そうしないと、次の固定および脱水手順がうまく機能しません。
3. 固定液として1 mLの2.5%グルタルアルデヒドを添加し、新鮮なPanc02細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブに4°Cで一晩固定します。
   注意: サンプルは、次の各ステップ(ステップ1.3〜1.11)で1,006 x g で5分間遠心分離する必要があります。
4. 固定液を吸引し、サンプルを0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回すすぎ、次に室温で二重蒸留水(_ddH2O)でそれぞれ10分間2回すすぎます。
5. 1%四酸化オスミウム(OsO₄)と1.5%フェロシアン化カリウムを含む溶液50 μLを1:1の比率で4°Cで1時間加えます。その後、毎回0.1 M PBSで10分間2回すすぎ、さらにddH₂Oですすぎます。
6. 1 mLの1%チオカルボヒドラジド(TCH)を加え、室温で30分から1時間インキュベートした後、ddH₂Oで毎回10分間4回すすぎます。
7. 50μLの1%OsO₄を添加し、室温で1時間固定した後、ddH₂Oで毎回10分間4回すすぎます。
8. 1 mLの2%酢酸ウラニルを4°Cで一晩加え、ddH₂Oで4回、毎回10分間すすぎます。
9. 1 mLのウォルトン溶液(0.066 gの硝酸鉛を10 mLの0.03 mol/Lアスパラギン酸ストック溶液に溶解)を60°Cで加え、さらに1時間インキュベートします。
10. ddH₂Oで毎回10分間4回すすぎ、次に段階的なアルコールシリーズで毎回10分間脱水します:50%アルコール、70%アルコール、80%アルコール、90%アルコール1x、および100%アルコール2x。その後、100%アセトン中で毎回10分間2回脱水します。脱水には各溶液1 mLを使用します。.
11. 200 μLのアセトンをPon 812エポキシ樹脂と3:1、1:1、および1:3の比率で混合します。サンプルを室温でそれぞれ2時間、4時間、4時間樹脂に浸し、100%Pon 812エポキシ樹脂を一晩含浸させます。
    注:染色および樹脂包埋ステップを実行する場合、これらは有毒物質であるため、ドラフト内で操作することが重要です。さらに、実験中は白衣と耐溶剤手袋を着用する必要があります。
12. 試料を埋め込み型に入れ、60°Cのオーブンに48時間入れて重合させます。フラット埋め込み²⁹ を使用して、サンプルの周囲の樹脂の外観を減らします。これにより、試料の設置が簡素化され、その後の画像セグメンテーションに対する帯電アーチファクトの影響が軽減されます。
    注: 後で水平な切断面を生成するには、金型穴に少量の樹脂を追加し、過剰に充填しないように注意します。
13. シリコンウェーハを最初に洗浄し、次に濃縮H 2 SO₄ / H 2O₂溶液で30分間親水化することによってシリコンウェーハを準備します。ウルトラミクロトームを用いて親水化したシリコンウェーハ上に厚さ70nmのスライスストリップを連続的に回収し、60°Cのオーブンで10分間乾燥させます。
    注意: スライスがウェーハの表面に浮かぶときにスライスをゆっくりとキャプチャして、スライスの損失や変形を防ぎます。

2. 画像取得と3次元再構成

1. シリコンウェーハをステージに取り付ける前に、切片を蒸留水で3回洗浄し、風乾します。1 cm x 0.5 cmの大きさの導電性カーボンテープをカットし、シリコンウェーハとSEM試料ステージの間に貼り付けてサンプルのセットアップを完了します(図2E)。
2. FE-SEM加速電圧パラメータを2 kVに設定し、作動距離は4 mmです(図3B および 表1)。
   注意: 信号対雑音比を改善し、画像のノイズを減らすために、可能な限り低倍率で観察してください。倍数が増加すると、SEMのスキャン範囲が狭くなり、画像上の電荷蓄積が増加します。
3. 上部のメニューバーにある H / Lアイコン をクリックします。まず、低倍率で、ターゲットスライスストリップの最初のセクションの向きを変えてから、 H / L オプション(図3A)をもう一度クリックして高倍率モードに切り替えます。画像の明るさ、コントラスト、および倍率を調整して、目的の構造に適した画像を収集します。
4. [プロジェクトビュー]>[データを開く]を選択し、解析する画像ファイルをソフトウェアにインポートします。
5. [スライスの整列>編集]をクリックして画像を 整列 し(図4B)、画像の透明度を変更して左下のメニューバーの [強度範囲 ]の値を調整します。ここでは、半自動アライメント戦略を使用します。具体的には、自動位置合わせにより、画像を前の画像と重ね合わせてから、手動で微調整を行います。
   注:この作業では、位置合わせのプロセス中に、前の画像を参照として使用し、移動と回転の操作を使用して、2つの画像のターゲット構造を最大限に重ね合わせました。 [現在のスライスペア を整列]をクリックすると、画像を自動的に整列させることができますが、配置が間違っている可能性があります。
6. サブボリュームの抽出モジュールを選択し、スタック全体の重なり合う部分のサイズに合わせてアライメントされたデータセットをクリップします。
7. セグ メンテーションサブ セクション(図4C)で、 セグメンテーション>リサンプル>保存を選択します。 魔法の杖 のしきい値と ブラシ ツールのサイズを選択して、正しい範囲を選択します。ここでも、最初に 魔法の杖 を使用して適切な広い領域を自動的に選択し、次に ブラシ を使用して詳細を正確に記述することにより、半自動セグメンテーション方法を採用します。
   注: マジックワンド は、 マスキング 値を変更し、 描画制限線を使用することにより、対象の構造と周囲の構造の間に存在するピクセル強度の明らかな違いに基づいて画像をセグメント化するために適用できます。画像取得中に発生する帯電アーチファクトを区別することはできません。そのため、ターゲット リージョンのセグメンテーションが正しくなくなる可能性があります。 ブラシ ツールを使用して手動でセグメント化し、生物学的構造を正確に再構築できます。
8. [セグメンテーション>選択]で、[+]アイコンをクリックして、選択した領域を追加します(図4C)。
9. 上記の手順(2.8)を繰り返して、目的の微細構造を再構築するための選択が完了するまで、異なる画像で同じターゲット構造を選択します。
   注:ミトコンドリアのリモデリングプロセス中、ターゲットオブジェクトの選択は、連続した画像のグループの中央にある画像から実行する必要があります。最初または最後の画像から必要な領域が選択されている場合、再構築結果は完全な3Dビジュアライゼーションを表示できません。
10. 地域セグメンテーションが完了したら、オブジェクトのサイズと画像の解像度に最適な結果に従って画像ファイルを生成します。 [切り抜きエディタ]をクリックし、[ 仮想スライダー ]ボックスに番号6を入力します(図4C)。
11. 左側のドロップダウン メニューで、[ プロジェクト ]サブセクションの下にある灰色の領域を右クリックし、[ サーフェスを生成]>[作成>適用]を選択します。生成されたファイルで、 サーフェス ビュー モジュールを使用して、サーフェス構造と 3D 表現を作成します。

3. 定量化

1. [ 小さなスポットを削除]をクリックして適用> (図4D)。 [プロジェクト ]サブセクションで、灰色の領域を右クリックし、[ ラベル解析]>[適用 ]を選択します(図4D)。
2. 列の名前をカスタマイズし、メジャー グループを選択します。ネイティブ測定ボックスからボリューム3dと長さ3dを選択します。
3. 画面の左下隅にある[ 適用 ]ボタンをクリックします。データをコピーし、GraphPadなどの統計ソフトでグラフ化します。

Results

細胞培養(図1A)では、まず膵臓がん細胞を完全培養液で培養した対照群、(1S,3R)-RSL3⁴⁸(RSL3、フェロトーシス活性化因子、100nM)群、およびRSL3(100nM)プラスフェロスタチン-1⁴⁹(Fer-1、フェロトーシス阻害剤、100nM)群に分けました。以上の実験ステップにより、走査型電子顕微鏡により、対照群、RSL3群、阻害剤群(RSL3+Fer-1群)について、それぞれ38枚(補足図1)、43枚(補足図2)、44枚(補足図3)の連続画像を取得した。1,280×960画素の画像を8,000倍の倍率(解像度12.40nm/画素)で撮影しました。細胞領域のしわおよび汚染の両方が切片の上に観察されなかった。電子顕微鏡の写真は、細胞内のミトコンドリアや小胞体などの細胞小器官を明確に区別することができました(

Discussion

ここで紹介する方法は、連続した超薄膜切片から生成された2D断層画像の積層とセグメンテーションに電子顕微鏡と画像処理技術を適用することを含む3D再構成技術を適用するための有用なステップバイステップガイドです。このプロトコルは、高解像度レベルでの構造の強力な再現性とより高い精度の利点を持つオルガネラ微細構造の3D視覚化によって対処できる2D画像の限界を強調しています。さらに重要なことに、この3D視覚化を腫瘍細胞に適用して、病理学的メカニズムの研究をより簡単で信頼性の高いものにすることができます。本研究では、異なる条件下で3組の連続切片を比較することでミトコンドリアクリステの立体構造を可視化する手法を検討し、がん細胞で起こるRSL3誘導ミトコンドリアクリステ膜分解を検証した⁵⁶。これらの結果は、抗膵臓がん薬としてのRSL3の作用機序に関する洞察を提供します。

高解像度の2D画像の取得は、ミトコンドリアクリステの3D再構成⁵⁷のプロセスにおいて重要な役割を果たし、画質は再構成結果

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
アセトン	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging		2020.2
アスパラギン酸	MCE	HY-42068
ダルベッコ変性イーグル'中	ギブコ	11995115
エタノール	メルク	100983
フェロスタチン-1	MCE	HY-100579
ウシ胎児血清	ギブコ	10437010
電界放出形走査電子顕微鏡	日立	SU8010
グルタルアルデヒド	アルファ エーザー	A10500.22
リード硝酸塩	SANTA CRUZ	sc-211724
酸化オスミウム	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	認証細胞培養のヨーロッパコレクション
ペニシリン-ストレプトマイシン	バイオシャープ	BL505A
リン酸緩衝生理食塩水	バイオシャープ	BL302A
ポン 812 エポキシ樹脂	SPI CHEM	GS02660
フェロシアン化カリウム	マックリン	P816416
チオカルボヒドラジド	メルク	223220
ウルトラミクロトーム	ライカ	EMUC7
ウラニルアセテート	RHAWN	R032929