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HeLa細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量

DOI:

10.3791/65304

⸱

May 12th, 2023

 , 
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

In This Article

Summary

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この手法では、蛍光ベースのライブイメージングを使用して、HeLa細胞内のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを視覚化し、定量的に測定するための効果的なワークフローについて説明します。

Abstract

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ミトコンドリアは、ATP合成 を介して エネルギー産生を制御することにより、代謝恒常性に不可欠な動的オルガネラです。細胞の代謝をサポートするために、さまざまなミトコンドリアの品質管理メカニズムが連携して、健康なミトコンドリアネットワークを維持します。そのような経路の1つはマイトファジーであり、PTEN誘導キナーゼ1(PINK1)と損傷したミトコンドリアのパーキンホスホユビキチン化は、オートファゴソームの隔離とその後のリソソーム融合 による 細胞からの除去を促進します。マイトファジーは細胞の恒常性にとって重要であり、パーキンの変異はパーキンソン病(PD)に関連しています。これらの発見により、ミトコンドリアの品質管理の分子メカニズムとダイナミクスを理解するために、ミトコンドリアの損傷と代謝回転の研究に大きな重点が置かれてきました。ここでは、生細胞イメージングを使用してHeLa細胞のミトコンドリアネットワークを視覚化し、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)で処理した後のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを定量化しました。さらに、パーキン依存性マイトファジーを阻害するパーキンのPD結合変異(パーキンT240R)を発現させ、変異発現が野生型パーキンを発現する細胞と比較してミトコンドリアネットワークにどのように影響するかを決定しました。ここで概説するプロトコルは、ミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを効果的に定量するための蛍光ベースのアプローチを使用した簡単なワークフローを説明しています。

Introduction

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ミトコンドリアネットワークは、エネルギー生産1、自然免疫2,3、および細胞シグナル伝達4,5において重要な役割を果たす一連の相互接続された細胞小器官です。ミトコンドリアの調節不全は、パーキンソン病(PD)などの神経変性疾患と関連しています6,7。PDは、黒質のドーパミン作動性ニューロンに影響を与える進行性の神経変性疾患であり、世界中で約1,000万人が罹患しています8。PDは、損傷したミトコンドリアを選択的に除去する細胞の恒常性を維持するために必要なミトコンドリアの品質管理経路であるマイトファジーと遺伝的に関連しています9,10。研究により、1(FUNDC1)を介したマイトファジーを含むFUN14ドメイン、Bcl-2相互作用タンパク質3(BNIP3)促進マイトファジー、NIX依存性マイトファジー、および十分に特徴付けられたPTEN誘導キナーゼ1(PINK1....

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Protocol

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1. 生体試料の調製

注意: バイオセーフティキャビネットで滅菌技術を使用して、次の手順を実行します。キャビネットの表面とすべての材料に70%エタノールをスプレーします。

  1. HeLa細胞の培養とトランスフェクション
    1. 10%ウシ胎児血清および1%L-グルタミン溶液を添加した4.5 g/Lグルコースを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で30,000個のHeLa細胞を培養します(HeLa培地;材料表を参照)。2 mLの予熱したHeLa培地を含む35 mmガラス底イメージングディッシュ(材料のT缶を参照)に細胞をプレートします。HeLa培養物を5%CO2および37°C26,27に維持する。
    2. プレーティングの翌日、光学顕微鏡を使用して35 mmイメージングディッシュを検査し、細胞が~50%-60%コンフルエントであることを確認します。コンフルエントになったら、HeLa細胞を空の黄色蛍光タンパク質(YFP)ベクター、YFP-パーキンWT、またはYFP-パーキンT240R でトランスフェクトします(図1A<....

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Results

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このプロトコルでは、蛍光ベースの定量を使用して、CCCP処理後のミトコンドリアネットワークの膜電位とスーパーオキシドレベルを測定しました(図1)。このワークフローでは、子宮頸がん由来の不死化細胞株であるHeLa細胞を使用しました。HeLa細胞は、ミトコンドリア生物学の研究に日常的に使用されており、比較的平坦であるため、顕微鏡を使用してミトコンドリアネットワークを簡単に視覚化できます。ミトコンドリアネットワークの健康維持におけるパーキンの役割を調べるために、HeLa細胞に空のコントロールベクターであるパーキンWTまたはパーキンT240R (マイトファジーを破壊する変異体)を一時的にトランスフェクトしました21。HeLa細胞を35mmのガラス底イメージングディッシュに播種し、コンフルエントが~50%-60%に達したらトランスフェクトしました(図1A)。HeLa細胞は急速に分裂するため、これは通常、細胞をイメージングディッシュにプレー.......

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Discussion

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ここで概説するワークフローは、蛍光ベースのイメージングを用いて、ミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルを堅牢かつ再現性よく定量するために使用することができる30。これらの実験を設計する際に考慮すべき重要な技術的制限があります。HeLa細胞を、空のYFPベクター、YFP-パーキンWT、またはYFP-パーキンT240Rでトランスフェクトした。空のYFPベクターを対照として使用し、実験所見がパーキンに特異的であることを確認した。一過性トランスフェクションでは、DNAとトランスフェクション試薬の質量比を1:3と実験的に決定し、トランスフェクション率が最も高いようにし、各コンストラクトに2 μgのプラスミドDNAを使用しました28。蛍光タンパク質は生来の輝度が異なるため、すべてのコンストラクトでYFPタグを一定に保つことが重要でした31,32。複数の蛍光タンパク質タグを使用する必要が.......

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Disclosures

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著者には、宣言する競合する利益はありません。

Acknowledgements

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この原稿に対する思慮深いフィードバックを提供してくれたEvansラボのメンバーに感謝します。この研究は、デュークホワイトヘッド奨学生、デューク科学技術奨学生、およびハワードヒューズ医学研究所(HHMI)ハンナグレイフェローシップによってサポートされています。 図1A は BioRender.com を用いて作製した。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
化学品、ペプチド、および組換えタンパク質
CCCP(シアン化カルボニルm-クロロフェニルヒドラゾン) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucoseGibco11-965-084
DMSO, AnhydrousThermoFisher ScientificD12345
Fetal Bovine SerumHycloneSH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) ギブコ 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX 赤 サーモフィッシャーサイエンティフィM36008
MitoTracker ディープレッドサーモフィッシャーサイエンティフィックM7514
Opti-MEM (Redued Serum media)サーモフィッシャーサイエンティフィ31985070
テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩 (TMRE) サーモフィッシャーサイエンティフィックT669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty VectorN/AN/A
YFP-Parkin T240Rこの論文、YFP-Parkin
YFP-Parkin WT。PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (表計算ソフト)Microsoft Office 
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (統計)解析ソフト)GraphPad ソフトhttps://www.graphpad.com
<ストロング>その他<・ストロング>
35mmディッシュ No.1.5 カバースリップ ガラス径20mm ノンコートマットテックP35G-1.5-20-C
ケージインキュベーター(環境チャンバー)オコラボhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL 倒立顕微鏡ライカN/A
ライトニング デコンボリューションソフトウェアライカN/A
STELLARIS 8 共焦点顕微鏡ライカN/A
ック ック は Addgeneからの部位特異的突然変異誘発によって生成されましたhttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (....

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