生きたラットからの神経幹細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞の単離のための「脳搾乳」法

組織特異的幹細胞は、それぞれの組織を構成するすべての細胞集団を生じさせることができる部分的にコミットされた細胞です。多能性であることは別として、それらは自己複製細胞であり、組織の恒常性と再生能力を維持するために重要です¹。腸幹細胞や造血幹細胞など、一部の組織特異的幹細胞は活発で強い増殖状態にとどまります。また、脳幹細胞などは、大部分が静止状態または休^眠状態のままです2。成人の脳では、神経幹細胞(NSC)は、しばしばニッチと呼ばれる特殊な領域に見られます。そのような2つのよく記述された領域は、側脳室の上衣下ゾーン(SEZ)と海馬の歯状回に存在します。SEZニッチは、嗅球に向かって移動し、局所的な介在ニューロン集団に寄与する神経芽細胞を中心に、最も多くの細胞を生成します。対照的に、生成された乏突起芽細胞は隣接する脳梁(CC)³に移動する。オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)は、中枢神経系全体に広く分布する有糸分裂活性細胞であり、i)オリゴデンドログリア系統に関与し、ii)脱髄部位に遊走でき、iii)有髄化オリゴデンドロサイトに分化することができます。OPCは、自己複製の可能性と^{静止状態4}も示します。

これまで、神経幹細胞とOPCの単離と研究には、解剖した脳と脊髄組織の死後解離が必要でした。この実験上の制約を回避するため、生きた動物から脳のNSCやOPCを単離できる手法を世界で初めて確立しました。この方法を「搾乳」と呼ぶのは、プールが枯渇しないため、複数の細胞の収集が可能になるからです。このプロトコルは、脳のサイズが大きいラットで開発され、主に経済特区またはCCを標的とし、2つの主要なステップが含まれています。まず、神経幹細胞またはOPCは、心室壁の剥離を誘導する毒素であるノイラミニダーゼ、インテグリン-β1阻害抗体、および線維芽細胞増殖因子2(FGF2)を含む「放出カクテル」のi.c.v.注射 によって 組織から「除去」されます。カクテルは、側脳室内に両側で定位的に注射されます。使用目的が神経幹細胞の単離である場合、側脳室の吻側領域が標的となります。OPCをより純粋に分離することが目的である場合、カクテルは海馬線維の領域に尾側に注入されます。第2の「採取」ステップでは、脳脊髄液(CSF)のリキッドバイオプシーが、切開を必要とせずに麻酔ラットの槽マグナから行われます。リキッドバイオプシーはNSC培養培地と混合され、プレーティングまで4°Cに保つことができます。

動物の飼育、維持、実験は、内務省の認可を受けた1986年英国動物(科学的手順)法、およびギリシャ共和国の大統領令56/2013に従って実施され、ケンブリッジ大学とパトラス大学の動物福祉および倫理審査機関によって精査され、地元の県動物管理委員会(プロトコル番号: 5675/39/18-01-2021)。 Sprague-Dawley、Wistar、Long-Evansラットの雄と雌のラットを使用し、月齢は2〜4か月で、体重は150g〜250gでした。プロトコルを 図1にグラフでまとめます。

1.カクテルの準備を解放します

注意: 施術当日に新鮮なものを準備し、氷の上に保管してください。量は、各側脳室に i.c.v を注入する 2 μL あたりに与えられます。目的の注入ごとに追加の 1 μL を調製します。

1. クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium welchii)由来の500 mUノイラミニダーゼ0.5 μLを調製します。
   注:-20°Cの滅菌水で希釈した1 U/μLストックとして保管してください。 他のタイプのノイラミニダーゼはテストされていません。.
2. インテグリン-β1ブロッキング抗体1 μgを含む1 μLを調製します。
   注意: 4°Cで保管してください。
3. 塩基性線維芽細胞増殖因子(組換えヒトFGF-塩基性)0.5μgを含む0.5μLを調製する。
   注:-20°Cの滅菌水で希釈した1 μg/μLのストックとして保存してください。

2.リリースカクテルの注入

注:プロセス全体は20分以内に実行できます。無菌状態で手術を行うように注意してください。すべての表面を消毒剤(3%または6%の過酸化水素など)で清掃します。オートクレーブ滅菌または滅菌しやすい道具、手袋、ガウン、ドレープを使用してください。

1. イソフルラン吸入により実験動物に麻酔をかける(誘導に2.5%、維持に2%)。角膜反射、刺激に対する反応(後肢・尾挟みテスト)、呼吸様式などを確認し、麻酔の深さを確認します。
   注:外科的処置は、腹腔内注射麻酔によって誘発される全身麻酔下で実行できます(例:.、ケタミン[40 mg / kg]およびキシラジン[10 mg / kg])。深部麻酔は、角膜反射、刺激に対する反応(後肢・尾挟みテスト)、呼吸様式を確認した。
2. 麻酔導入時に鎮痛剤を皮下投与します(例:.、0.3 mg / mLブプレノルフィン)。.
3. ラットを脳定位固定装置フレームに取り付けます。
4. カミソリで頭の毛皮を剃り、10%ポビドンヨード溶液とアルコールなどの消毒剤で皮膚をきれいにします。滅菌綿棒を使用して消毒剤を3回塗布します。毎回3〜5秒間円を描くようにこすります。乾燥を防ぐために眼軟膏を塗ります。
5. 滅菌メスを使用して、中央線に沿って頭の皮膚を2cm切開します。
6. 滅菌綿棒と滅菌生理食塩水を使用して頭蓋骨を細心の注意を払って取り除きます。
7. 脳定位固定装置に装着された10μLのハミルトンシリンジの針の端を使用してブレグマを特定します。ブレグマを「点0,0」として設定します。
   注:ブレグマは、矢状縫合糸と冠状縫合糸の交点として識別されます。詳細については、PaxinosとWatson⁵のラット脳アトラスを参照してください。
8. デバイスを前後 (AP) = 0.3 mm、横方向 (L) = +1.2 mm (SEZ をターゲットにする場合)、または AP = 1.5 mm、L = +2.0 mm (CC をターゲットにする場合) の座標に移動します。
9. 歯科用ドリルを使用して1mmのバリ穴を開けます。
   注意: 手で穴を開ける場合は、皮質表面を傷つけないように注意してください。出血は大したものではないと予想されます。生理食塩水で血液を取り除き、圧力をかけて出血を止めます。
10. 10 μLのハミルトンシリンジに4 μLのリリースカクテルをロードします。
11. 硬膜に接触させるために、ハミルトンシリンジの針(できれば鈍いまたは円錐形のエッジ)を下げます。
12. 針を希望の深さ(D = 3.5 mm)に挿入します。
    注意: 硬膜の表面に生理食塩水を注ぎ、組織の水分を保ちます。
13. 2 μL のリリースカクテルを 1 μL/分の速度で注入します。
14. リリースカクテルの浮上を避けるために、ゆっくりと回収する前に、針をさらに2分間そのままにしておきます。
15. もう一方の半球の座標 AP = 0.3 mm、L = -1.2 mm(SEZ をターゲットにする場合)、または AP = 1.5 mm、L = -2.0 mm (CC をターゲットにする場合)で、手順 2.8 から 2.14 を繰り返します。
16. 切開部を5-0ナイロン(直径0.1mm)で縫合し、縫合部を消毒剤で洗浄します。
17. 麻酔薬を供給しているマスクを外し、動物を手術後の監視エリアに移します。
    注意: 麻酔からの回復と横臥の維持は5〜10分以内に発生し、25分以内に完全に回復(通常の動作)する必要があります。
    1. 気道を塞ぐ可能性のある小粒子の寝具のない、十分に加熱された(24〜25°C)静かな空間で、回復(鮮やかで途切れることのない動き、水への頻繁なアクセス)を注意深く監視します。動物は、完全に回復したことを確認した後にのみ、ケージメイトの会社に戻してください(新しい動物には戻らない)。
    2. 手術後少なくとも48時間は、メンテナンス施設で動物を監視します。鎮痛剤を投与することにより、痛みの兆候(頭の隠蔽、頭または体の異常な姿勢、過敏症、および取り扱いに対する過興奮性)に対処します(例:.、0.3 mg / mLブプレノルフィン、皮下)。.毛皮が変色したり、直立したりしている動物は、担当の獣医に紹介してください。

3.脳脊髄液(CSF)リキッドバイオプシー

注:プロセス全体は10分以内に実行できます。ここで説明するリキッドバイオプシーは、放出カクテルの注射の3日後に実施されますが、必要に応じていつでもまったく同じ方法で実施できます。無菌状態で手術を行うように注意してください。消毒剤(3%または6%の過酸化水素など)ですべての表面を清掃します。オートクレーブ滅菌または滅菌しやすい道具、手袋、ガウン、ドレープを使用してください。

1. イソフルラン吸入により動物を麻酔する(誘導に2.5%、維持に2%)。角膜をチェックして麻酔の深さを確認する
   反射、刺激に対する反応(後肢と尾のつまみテスト)、および呼吸様式。
   注:外科的処置は、腹腔内注射麻酔によって誘発される全身麻酔下で実行できます(例:ケタミン[40 mg / kg]およびキシラジン[10 mg / kg])。ただし、特に生検が連続して複数回行われる場合は、手順が短いため、これはお勧めできません。
2. 麻酔導入時に鎮痛剤を皮下投与します(例:.、0.3 mg / mLブプレノルフィン)。.
3. 実験動物を脳定位固定装置フレームに装着します。イヤーバーを使用して、前後への回転運動を妨げずにヘッドを固定します。
4. 首の後ろをうまく伸ばせるように、頭を下向きに40°の角度で安定させます。
   注意: これを行う1つの方法は、デバイス⁶のマウスバーを使用することです。
5. カミソリを使用して首の部分の毛を剃り、10%ポビドンヨード溶液とアルコールなどの消毒剤で皮膚をきれいにします。滅菌綿棒を使用して消毒剤を3回塗布します。毎回3〜5秒間円を描くようにこすります。
6. 指先で、後頭隆起とアトラス⁶の脊椎の間にある菱形の陥没領域を見つけます。
7. ポイントマークを描画します(マーカーを使用するなど)。
8. 1 mLまたは0.5 mLのシリンジを脳定位固定フレームに固定します。
   注意: 取り外し不可能な針付きのシリンジは、吸引力が高く、デッドボリュームが少ないため、使用することをお勧めします。
9. ポイントマークの皮膚との接触点に針を持ってきます。
10. 一対の鉗子を使用して、シリンジを皮膚層から下げながら皮膚を持ち上げます。
11. プランジャーを少し回収して、シリンジ内に負圧を発生させます。
12. 液体(CSF)がシリンジに現れるまで、針を非常にゆっくりと浸すために再開します。
13. この位置に針を落ち着かせ、CSFのゆっくりとした流れを待ちます。
    注意: CSFの流れが非常に遅い場合は、針をわずかに下げたり上げたりすることができます。
14. 120 μLまでゆっくりと(40 μL/分刻みで)CSFの除去を開始します。
15. シリンジをゆっくりと取り出します。
16. 1 mL の正常血清を腹腔内に投与して、実験動物の水分補給をサポートします。
17. リキッドバイオプシー(CSF)を400 μLのNSC培地と混合し、さらに使用するまで微量遠心チューブを4°Cに保ちます。
    注:リキッドバイオプシーは、凍結しない場合、3時間以内に処理する必要があります。
18. 麻酔薬を供給するマスクを外し、動物を術後の監視エリアに移します。
    注意: 麻酔からの回復と横臥の維持は5〜10分以内に発生し、25分以内に完全に回復(通常の動作)する必要があります。
    1. 気道を塞ぐ可能性のある小粒子の寝具のない、十分に加熱された(24〜25°C)静かな空間で、回復(鮮やかで途切れることのない動き、水への頻繁なアクセス)を注意深く監視します。動物は、完全に回復したことが確認された後にのみ、ケージメイトの会社に戻してください(新しい動物には戻らない)。
    2. 手術後少なくとも48時間は、メンテナンス施設で動物を監視します。痛みの兆候(頭の隠蔽、頭または体の異常な姿勢、過敏症、取り扱いに対する過興奮性)が観察された場合は、鎮痛剤を投与します(例:.、0.3 mg / mLブプレノルフィン皮下)。.毛皮が変色したり、直立したりしている動物は、担当の獣医に紹介してください。

4. 免疫蛍光法のための組織の処理

1. 20 mLの氷冷生理食塩水の心臓内注入、続いて50 mLの氷冷4%パラホルムアルデヒド(PFA;pH = 7.4のリン酸緩衝生理食塩水[PBS]中)によって動物を安楽死させます。.
2. 脳組織を解剖します。
   1. ハサミを使って頭と体を分離し、頸部に切り込みを入れます。はさみを使って皮膚を取り除き、脳組織を傷つけないように、はさみの先端が上を向くように、矢状正中線に沿って頭蓋骨を切断します。冠状正中線を通過して、できるだけ切断を続けることを目指します。
   2. 鉗子を使用して、後頭上骨と頭頂骨から始めて骨を取り除き、最後に前頭骨を取り除きます。
   3. 脳組織が明らかになったら、鉗子またはスパチュラを使用して頭蓋骨から持ち上げます。これを容易にするために、脳の基部の神経と嗅球を切断します。
3. 組織を2%PFAで4°Cで一晩後固定します。
4. 組織が底に沈むまで、30%スクロース(PBS中)で4°Cで少なくとも48時間凍結保護します。
5. 組織を-80°Cで凍結します。
6. クライオスタットで脳組織を厚さ14μmの冠状切片に切断します。
7. 標準プロトコルを用いた免疫蛍光染色の実施 ^3,7
   1. 切片をブロッキングバッファー(3%ウシ血清アルブミン[BSA]、0.1% Triton X-100、PBS溶液)で室温で2時間インキュベートします。
   2. 抗原賦活化を行います(ガラス瓶を使用して、10 mMクエン酸緩衝液、pH = 6.0で15分間煮沸します)。
      注:この手順はオプションですが、核抗原には必要です。
   3. 室温に戻して、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、ダブルコルチン(Dcx)、S100β、β-カテニン( 材料表を参照)に対する一次抗体とともに、ブロッキングバッファー中で4°Cで一晩インキュベートします。
   4. 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含むPBS中の二次抗体と2時間インキュベートし、室温で核対比染色を行います( 材料表を参照)。
   5. カバーガラスを取り付けます。

5. 単離細胞の免疫蛍光法の処理

1. ポリ-D-リジン(100 μg/mL)でコーティングされた顕微鏡検査に適した96ウェルプレートに細胞を播種します。
2. 細胞を氷冷した2%PFAで10分間固定し、PBSで3回洗浄します。
3. PDGFRα、GFAP、Dcx、SOX2、およびID3の標準手順^3,7を使用して免疫蛍光法を実施します(材料表を参照)。
4. 細胞をPBS + NaN₃ (0.1%)中、暗所で4°Cに保ちます。

6. 顕微鏡検査と画像解析

1. 落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して画像を撮影し、セルカウンターなどの標準的な画像解析ソフトウェアツールを使用して細胞カウントを行います。

NSCの公開と収集
SEZのNSCは、上衣細胞の単層によってのみCSFから分離されていますが、それらはインターカレーション単繊毛プロセスを介して心室内容物と直接接触したままです8,9。ノイラミニダーゼは、シアル酸残基の切断を介して上衣細胞に特異的に作用し、心室壁の剥離を誘発する可能性があります。これは、心室の表面に神経芽細胞のクラスタリングをもたらす10,11。さらに、インテグリン-β1ブロッキング抗体のi.c.v.注射後のCSFでは、おそらく上衣間細胞接合部の緩みにより、神経芽細胞の流れが観察されている12。これらの観察は、側脳室壁の完全性の制御された妥協を介して脳の幹細胞と前駆細胞の分離を可能にするプロトコルの開発につながりました。最初のステップでは、実質からの放出とそれに続くCSF内のNSCまたはOPCの流れが、放出カクテルのi.c.v.注射によって誘導されます。カクテルは、側脳室に両側(注射あたり2μL)に1μL / minの速度で定位注射されます(SEZ NSCを標的とする座標:AP = 0.3 mm、L = ± 1.2 mm、D = 3.5 mm、CC OPCを標的とする座標:AP = 1.5 mm、L = ± 2 mm、D = 3.5 mm)。2番目の(「収集」)ステップには、システルナマグナからのCSFリキッドバイオプシーの実施が含まれます。ラットには麻酔が必要で、生検は1mLの注射器で行うことができます。脳定位固定装置を使用することで、切開を必要とせずに約100μLのCSFを回収することにほぼ完全に成功します。リキッドバイオプシーを氷培養培地に添加し、<3時間プレーティングするまで4°Cに保ちます(NSC培地には、ダルベッコ修飾イーグル培地[DMEM]、B27サプリメント[2%]、N2サプリメント[1%]、FGF2[20ng/mL]、および上皮成長因子[EGF;20ng/mL]が含まれています)。

放出カクテル注射後の脳室周囲領域の組織学的評価
最初の実験コホートでは、3 μLを超える液体を注入すると、非特異的な機械的損傷により心室が損傷する可能性があることが明らかになりました(図2B、C)。2 μLの放出カクテルをゆっくりと注入すると、心室表面にDcx免疫陽性神経芽細胞のクラスターが出現しました。.これらのクラスターは、注射後8か月でも目に見えるままでした(図2D)。この方法は、動物の長期追跡を目的とした縦断的研究を目的としていたため、放出カクテルによって引き起こされる組織損傷を評価しました。S100βやβ-カテニン13などの上衣細胞マーカーについて、厚さ14 μmのクライオスタット脳切片で免疫染色を行い、上衣層の全体的な完全性を評価しました。上衣層の剥離部位は、注射の吻尾部レベル付近にのみ存在し、SEZの後部および前方の領域で検出された上衣層の摂動の漸進的な減少(図2E、F)は、注射部位から±2mmの距離後には存在しなくなった。上記の結果は、放出カクテルのi.c.v.注射によって引き起こされる上衣層の部分的な剥離が焦点であり、注射部位の近くで抑制され、残りの脳室周囲上衣層をそのまま残すことを示しています。

収集した細胞のマーカープロファイルと in vitro 挙動
続いて、搾乳プロトコルで単離した細胞のin vitro挙動とマーカープロファイルを評価しました。各リキッドバイオプシーの平均細胞収量は、約300±45細胞(生検100μLあたり)です7。搾乳生検の結果、NSC培養は平均3.17±0.45継代であった。生理食塩水を注射したラットから単離された細胞は、平均1.92回±0.76回継代することができました。対照的に、搾乳によって分離されたものは、9継代(p = 0.038、t検定)に達しました(図3A)7。標準的な死後、SEZ由来のニューロスフェア培養の平均継代能力は、私たちの手にある12継代よりも高くなっています。in vivo細胞運命マッピング実験14によって明らかになったように、SEZ NSCのin vivo増殖能は限定的であることが示されているため、搾乳は、内因性NSCの挙動にはるかに近いものの、標準培養中の細胞のin vitro挙動とは有意に異なるin vitro挙動の細胞を産生する。 そこでは、接着性単層として成長し、まれにニューロスフェアとして成長しました(図3B)。星状膠細胞マーカーGFAPに対して免疫陽性であった新たに単離された細胞(注射後3日で採取し、プレーティング後24時間で固定)は、静止マーカーであるID3に対しても免疫陽性であり、NSCバイポーラ形態の特徴を有していました(図3C)。さらに、以前に報告されたように7、注射後3日(GFAP+アストロサイト、Dcx+神経芽細胞、PDGFRa+オリゴデンドロサイト前駆細胞、および神経系統のSOX2+細胞を探す)の生検由来細胞と死後由来細胞のより詳細な免疫細胞化学的比較により、収集された細胞のプロファイルは内因性SEZ細胞のプロファイルと類似していることが示されました(図3D)).特に、生検由来細胞と組織由来細胞を異なる条件(例えば、FGF2の併用と非併用の放出カクテルの注射)で比較したところ、成長因子は、SOX2+細胞の存在の同時かつ有意な増加をもたらし、両方のサンプルでDcx+神経芽細胞の存在の有意な減少をもたらすことがわかりました(図3D)).これらのデータにより、神経幹細胞の内因性集団のプロファイルに現れる変化は、搾乳で生成された細胞サンプルに反映されていることが確認されました。

図1:搾乳のグラフィカルな概要。 主要な解剖学的ランドマーク(側脳室、その上にある脳梁、および下の前交連[灰色の白質路]、および側壁の上衣下ゾーン[青色])を持つ1つの脳半球の冠状部分。放出カクテルは側脳室に注射され、組織の完全性が損なわれ、出生後の脳神経幹細胞が脳脊髄液中に放出され、そこからリキッドバイオプシー によって 採取されます。略語:SEZ =上衣下ゾーン;LV = 側脳室;CSF = 脳脊髄液;pbNSC = 出生後の脳神経幹細胞;β1-int = β1インテグリン。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:i.c.v.注射の効果の組織学的評価。 (A-D) Dcxの免疫染色後の側脳室背側半分の低倍率画像(赤、神経芽細胞を示すため)。(A)ハミルトンシリンジの単純なi.c.v.挿入はSEZの細胞構造を妨げませんが、10 mL(1 mL / minの注入速度)のi.c.v.注射は、その内容に関係なく心室壁の深刻な損傷につながります。.(B)生理食塩水と(C)放出カクテル。(D)2μLの放出カクテルの注射は、手術後8か月でも観察される心室壁の制御された妥協につながります。注入後7日および14日におけるSEZの壁の高倍率の詳細をそれぞれ(E)および(F)に示します。Dcx+神経芽細胞(緑色)は壁面に、ニッチの他の細胞(Sox2+、白色)はより深く位置しているという、まとまりのない構造があります。脳室周囲組織は、2か月の時点で注射の吻尾側レベル(G)で損傷を受けますが、同じ動物では、組織はより尾側レベル(H)で無傷です。.心室壁は、上衣マーカーS100βおよびβ-カテニンの免疫染色によって評価されます。壁の典型的な構造の詳細を(I)に示す。核染色はDAPI(青色で表示)を用いて行います。スケールバー = 300 μm (A-C、G、H、挿入図)、150 μm (D)、30 μm (E、F)、および 50 μm (I)。この図は、McClenahan et al.13 から修正したものです。略語:SEZ =上衣下ゾーン;i.c.v = 脳室内;Dcx = ダブルコルチン;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:搾乳 によって 単離された細胞の評価 。 (A)生理食塩水を注入した動物(灰色のバー、合計12サンプル)、または搾乳後(黒いバー、合計29サンプル、ノイラミニダーゼとインテグリン-β1ブロッキング抗体を含むリリースカクテル)から得られたリキッドバイオプシーサンプルあたりの最大継代数を示すグラフ。(B)搾乳 により 得られた初代細胞の代表的な共焦点顕微鏡画像、注射後3日目、GFAPおよびID3に対して免疫染色。(C、D)注入後3日で単離した細胞の明視野画像は、ポリ-D-リジンでコーティングされたウェルに播種し、NSC増殖培地中で7日間増殖させました。(E)同じ実験動物からSEZおよびSEZ神経細胞の内在集団の搾乳 によって 単離された細胞の細胞タイププロファイルを示すグラフ。SOX2+画分とDcx+画分は、FGF2の同時注入後にそれぞれ有意に増加および減少した。(マーカーごとの一元配置分散分析、その後の事後分析、n = 実験グループあたり4〜6匹)スケールバー = 100 μm (C,D) および 10 μm (B)。この図は、McClenahan et al.13 から修正したものです。略語:SEZ =上衣下ゾーン;DPI = 注入後日数。NSC = 神経幹細胞;Dcx = ダブルコルチン;GFAP = グリア線維性酸性タンパク質。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

著者は、競合する金銭的利益やその他の利益相反を宣言していません。