骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

生細胞内の既知の電気刺激に応答してイオンチャネルの立体配座再配列を追跡する能力は、分子生理学にとって貴重な情報源です¹。電位依存性イオンチャネルは、膜貫通電圧の変化を感知する膜タンパク質であり、その機能は電圧変化によっても影響を受けます²。前世紀の電圧クランプ技術の開発により、生理学者は、膜の脱分極に応答して電位依存性イオンチャネルによって運ばれるイオン電流をリアルタイムで研究することができました³。電圧クランプ技術の使用は、ニューロンや筋肉などの興奮性細胞の電気的特性を理解する上で非常に重要です。1970年代には、電圧クランプの改良により、電位依存性カルシウム(Ca V)およびナトリウム(Na_V)チャネルのゲーティング電流(または電荷移動)の検出が可能になりました^4,5。ゲーティング電流は、細胞膜⁶を横切る電界の変化に応答した電圧センサの動きから生じる非線形容量性電流である。ゲーティング電流は、イオンチャネルの開口部に先行または付随する分子再^{配列の電気的}発現と見なされます7。これらの電流測定はチャネルの機能に関する貴重な情報を提供しますが、イオン電流とゲート電流はどちらも、電位依存性チャネルの分子間および分子内の立体配座再配列の間接的な読み出しです⁷。

機能部位特異的蛍光測定法(FSDF、電圧クランプ蛍光測定法、VCFとも呼ばれる)は、1990^年代初頭に開発され8、初めて局所的な立体構造の変化とチャネルタンパク質の機能をリアルタイムで直接観察する機能を提供しました。チャネル突然変異誘発、電気生理学、および異種発現システムの組み合わせを使用して、活性化刺激に応答して特定のチャネルまたは受容体の可動部分を蛍光的にタグ付けおよび追跡することができる^9、10。このアプローチは、電位依存性イオンチャネル8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19における電圧検出メカニズムの研究に広く用いられてきた。信頼できるレビューについては、10,20,21,22,23を参照してください。

電気信号の開始と伝播に重要なCa VチャネルとNa_Vチャネルは、中心細孔と4つの非同一電圧検出ドメイン²を有するメインα1サブユニットで構成されています。それらの別個の一次構造に加えて、_CaVおよび_NaVチャネルは、補助サブユニット²⁴を有するマルチサブユニット複合体として表される。電位依存性カリウムチャネル_(KV)は、_NaVまたは_CaV25の単一ドメインのように見える4つのサブユニットからなる。Ca、VおよびNa_Vチャネルの孔形成および電圧感知α1サブユニットは_、6つの固有の膜貫通セグメントの4つの個別のドメインをコードする単一のポリペプチドによって形成される(S1-S6;図1A)^24,26。S1〜S4膜貫通セグメントによって構成される領域は電圧検出ドメイン(VSD)を形成し、S5およびS6膜貫通セグメントは細孔ドメイン²⁶を形成する。各VSDでは、S4 αらせんには、膜脱分^極7に応答して移動する正に帯電したアルギニンまたはリジンが含まれています(図1A、B)。数十年の研究と非常に多様な実験的アプローチの結果は、S4セグメントが膜脱分極に応答して外側に移動し、ゲート電流を生成するという前提を支持しています⁶。

FSDFは、イオンチャネルまたは他のタンパク質上の特定のシステイン残基(すなわち、S4 αヘリックス)に結合したチオール反応性色素の蛍光変化を測定し、部位特異的突然変異誘発によって操作され、チャネルが膜脱分極または他の刺激に応答して機能するにつれて¹⁰。実際、FSDFはもともと、チャネルのメイン電圧センサーとして提案_{されているKV}チャネルのS4セグメントが、^{膜電位の変化}に応じてゲーティング電荷が移動するときに動くかどうかを調査するために開発されました^8,10。電位依存性イオンチャネルの場合、FSDFはチャネル機能測定と同時に、4つのVSDの独立したコンフォメーション再配列(任意の時点で1つのVSDを追跡)を分解できます。実際、このアプローチを使用して、個々のVSDがチャネルの活性化と不活性化の特定の側面に異なって関与しているように見えることが示されています¹²、²⁷、²⁸、^29、30。チャネルの機能に対する各VSDの寄与を特定することは関連性が高く、チャネル操作をさらに解明し、医薬品開発の新しいターゲットを特定するために使用できます。

異種発現システムにおけるFSDFの使用は、還元主義の観点からチャネル機能の理解を深めるのに非常に役立ちました^10,23。多くの還元主義的アプローチと同様に、それは利点を提示しますが、制限もあります。例えば、1つの大きな制限は、異種系におけるチャネルナノ環境の部分的な再構成である。多くの場合、イオンチャネルは、それらの機能を改変する多数の付属サブユニットおよび多数の他のタンパク質と相互作用する³¹。原則として、異なるチャネルおよびそれらの付属品サブユニットは、複数のタンパク質コードコンストラクトまたはポリシストロニックプラスミドを使用して異種系で発現させることができるが、それらの天然環境を完全に再構成することはできない^30,32。

私たちのグループは最近、筋線維の電気的脱分極が筋収縮の活性化に関連しているプロセスである興奮収縮結合(ECC)33,34の初期段階の研究のために、ネイティブの解離骨格筋線維におけるFSDFの変異体を発表しました^35,36。初めて、このアプローチは、成人分化筋線維の天然環境における電位依存性L型^Ca2+チャネル(Ca_V1.1、DHPRとしても知られる)からの個々のS4電圧センサの運動追跡を可能にした³⁷。これは、高速刺激による自己増殖脱分極を可能にする細胞の電気的活性、in vivoエレクトロポレーションによるcDNAプラスミドの発現能力、細胞内のチャネルの自然な高発現および区画組織化、高速イメージングおよび電気生理学的記録デバイスとの互換性など、この細胞タイプの複数の特性を考慮することによって達成されました。これまで、検出装置³⁷として高速ライン走査型共焦点顕微鏡を用いた。ここで、信号取得用のフォトダイオードを使用して、この手法のバリエーションを紹介します。このフォトダイオードベースの検出システムは、他の研究室でのこの技術の実装を容易にする可能性があります。

ここでは、Ca_V1.1からの個々の電圧センサーの動きの研究のためにネイティブセルでFSDFを利用するための段階的なプロトコルについて説明します。この原稿全体で例としてCa_V1.1チャネルが使用されてきましたが、この手法は、他のイオンチャネル、受容体、または表面タンパク質の細胞外アクセス可能なドメインに適用できます。

このプロトコルは、メリーランド大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました。以下のプロトコルは、(1)分子構築物設計とシステイン反応色素の選択、(2) in vivo エレクトロポレーション、(3)筋解剖と線維分離、(4)取得セットアップの説明、(5)増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)陽性の繊維電気的活性とシステイン染色の評価、および(6)シグナルの取得と処理からなる複数のサブセクションに分かれています。さらに、各セクションの冒頭で、骨格筋線維にFSDFを適用する際のいくつかの関連する考慮事項について詳しく説明します。すべてのプロトコルセクションは、白衣や手袋などの適切な個人用保護具を使用して実行する必要があります。

1. 分子構築設計とシステイン反応色素の選択

1. 構築設計は、実験の成功の重要な部分です。まず、野生型の蛍光タグ付きCa_V1.1 cDNAコンストラクトを作製し、適切な細胞型での発現を評価します。筋線維の場合、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを担持するプラスミドを使用することで、強力なトランスフェクション効率を達成できます。このプロトコルでは、既に特徴付けられたウサギEGFP-Ca_V1.1プラスミド³⁸を使用した。
   注:電位依存性イオンチャネルにシステイン残基を導入するようにcDNA構築物を改変する場合、システインの位置は重要であり、慎重に検討する必要があります。システインは、チオール結合色素反応を可能にするために細胞外空間からアクセス可能であり(図1C、D)、脱分極に応答してその動きを正確に追跡するためにS4領域に近接している必要があります。しかし、タンパク質の動きに応答して色素の蛍光消光を可能にするには、導入されたシステイン結合蛍光色素は、2つの異なる環境(例えば、膜と細胞外液; 図1E)。さらに、挿入されたシステインがタンパク質の機能を妨げないようにすることが重要です。
2. 適切なシステイン局在化に関するアイデアを得るには、チャネル構造に関する情報を収集するか、他の関連するチャネルタンパク質の他の蛍光測定実験から情報を収集します。システイン工学によるCa V 1.1コンストラクトの設計では、チャネル²⁶の分解クライオ電子顕微鏡(クライオEM)構造を評価し、Ca_V1.2¹²などの関連チャネル、またはシェー^カー11やNaChBac³⁹などの他のチャネルからの以前の研究のシステイン挿入を比較します。
3. 適切なシステイン位置を選択したら、市販の部位特異的突然変異誘発キットを使用してシステイン置換を導入します。本プロトコルでは、以下のシステイン修飾を、Ca_V1.1のS4電圧感知セグメントの各細胞質末端で独立して操作した:VSD-I(L159C)、VSD-II(L522C)、VSD-III(V893C)、VSD-IV(S1231C)、およびUniProtKB:P07293(図1B)。
4. 骨格筋線維には、表面膜の陥入およびCa_V1.1チャネルの優勢な位置である横細管膜系への適切かつ迅速な拡散を示す5-カルボキシテトラメチルローダミンメタンチオスルホネート(MTS-5-TAMRA)を使用する。MTS-5-TAMRAは、脂質膜から水性環境に移行する際に蛍光の減少を示します(図1E)。
   注:ダイライトまたはAlexa-マレイミド誘導体は表面膜を染色しますが、横尿細管システムは染色しません。

図1:膜貫通αらせんの界面におけるチオール-システイン反応の模式図。 (A)L型CaV1.1膜トポロジー。プラス記号はS4 αらせん内の塩基性残基を表し、オレンジ色の星は部位特異的突然変異誘発によってシステインが導入された場所を示します。(B)ウサギCa_V1.1のS4_IからS4_IVへの配列アラインメント(UniProtKB:P07293)。電圧検出に重要な正に帯電したアルギニン残基とリジン残基は赤で強調表示され、操作されたシステイン置換はオレンジで示されます。このパネルは参考文献³⁷から適応されています。(c)システイン-チオール蛍光分子反応。(d)膜貫通電位感受性αらせん内へのシステイン突然変異誘発作用を示す図である。システインは安静時に膜に埋め込まれ、脱分極後に細胞外にアクセス可能である必要があります(ΔV;システインの追跡は、標的システインが脱分極前に細胞外空間からすでにアクセス可能である場合(II)、または脱分極後にシステインが細胞外空間からアクセスできない場合(III)には通常起こりそうにありません。(e)チオール蛍光分子との反応後、脱分極に応答したαらせん運動によりMTS-5-TAMRA蛍光発光が減少する。蛍光信号は、S4ヘリックスの移動とそれに続くメンブレンと水性環境に対する色素の移動によって生成されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 生体内 エレクトロポレーション

注:エレクトロポレーション実験は、前述の^ように38 を改変して実施した。次のセクションでは、プロトコルは、マウスの片足パッドのエレクトロポレーション用に設計されています。両方の足を準備する場合は、音量を調整する必要があります。

1. 氷上に置いた1.5 mLチューブに2〜5 μg/μLのプラスミド溶液25〜100 μLを分注します。
2. 滅菌生理食塩水中の2 mg/mLヒアルロニダーゼの0.5 mL溶液を調製し、1 mLシリンジに取り付けられた低結合タンパク質0.2 μm滅菌フィルターで溶液をろ過します。室温で1.5 mLチューブに保存してください。
3. 較正された麻酔装置を使用して、マウスを麻酔室に入れることによって、O₂ (1L / min)中の3%〜4.5%イソフルランを使用してマウスを麻酔する。ピンセットを使用して尾の先端をつまんで、動物の適切な麻酔を確認します。最適な麻酔に達したときに反応は観察されません。.
4. マウスを麻酔室から取り出し、麻酔ノーズマスクをマウスの上に置きます。滅菌ベンチパッドで覆われた等温加熱パッドの上に動物を仰向けに置きます。O₂ (1 L / min)中の3%イソフルランを含むげっ歯類マスクを使用して麻酔を継続します。
5. 処置中の目の乾燥を防ぐために、滅菌綿の先端で動物の目に人工涙液クリームの細かい層を塗ります。エチルアルコールで飽和させた滅菌ワイプを使用して動物の足を消毒します。
6. 長さ29Gの0.5インチ滅菌インスリン針を用いて、20μLのヒアルロニダーゼ溶液を吸引する。かかとの高さで皮膚を貫通し、つま先の付け根に向かって皮下に針をスライドさせます(図2A)。針を徐々に後方に動かしながら、ゆっくりと溶液を注入します。足の下にボーラスまたはバンプを観察する必要があります(図2B)。
   注:動物の年齢や足の大きさによっては、全量の溶液が注入されない可能性があります。多くの場合、注入点からの小さな漏れが発生する可能性があります。
7. 必要に応じて、ステップ2.6のように、適切な足の消毒後に別の滅菌針を使用して、もう一方の足で手順2.5を繰り返します。
8. 動物をノーズマスクから取り外して麻酔を外し、マウスをケージに戻して、餌と水を 自由に摂取できるようにします。麻酔からの完全な回復は~5分で観察されるべきです。プラスミド溶液を含むチューブをベンチに置き、室温に到達させます。
9. 1時間後、動物をもう一度麻酔し、加熱パッドの上に置き、手順2.3〜2.5の説明に従って足を消毒します。
10. ステップ2.6で説明したのと同じ手法を使用して、10〜20 μLのcDNA構築物を注入します。注入されるコンストラクトの総量は、足あたり50〜100μgである。必要に応じて、別の滅菌注射器を使用して、反対側の足で手順を繰り返します。
11. 動物を等温加熱パッドで5分間麻酔下に置き、cDNA溶液が組織全体に均一に分散できるようにします。
12. エレクトロポレーション装置の電源を入れ、製造元の推奨に従って二重電極アレイに接続します。
13. エチルアルコールで飽和させたワイプを使用して二重電極アレイを消毒します。片手で足を安定させ、最初にかかとの後ろの皮膚の下に1つの電極を挿入します。次に、つま先の付け根に2番目の電極を挿入し、両方の電極の向きが足の軸に垂直になるようにします(図2C)。足や脚を極端な角度方向に拘束しない位置にプローブを向けます。
    注:電極の挿入は、ピンセットを使用し、電極の先端を定期的に鋭くすることで容易になります。動物の年齢に応じて、足のサイズは変化する可能性があり、電極の間隔はそれに応じて調整する必要があります。
14. 1Hzで20パルス、持続時間20ミリ秒/それぞれを適用して、筋肉を電気分解します。電極針の間隔が1cmの場合は、電圧を~100Vに設定します。これは、電極間隔が~100 V/cmに達するように変更される場合に調整する必要があります。電極が適切に配置されている場合、パルス配信中に指のわずかな屈曲を観察する必要があります。
15. 必要に応じて、反対側の足で手順2.13と2.14を繰り返します。
16. 麻酔を外し、動物をケージに入れ、電気孔を通さないカウンターメイトから隔離し、食物と水に2時間 自由 にアクセスします。麻酔からの完全な回復は~10分で観察されるべきです。動物をケージの中に戻します。
    注:cDNAコンストラクトの発現は、コードされるタンパク質に大きく依存します。タンパク質の代謝回転、cDNAの量と質、プラスミドプロモーター、およびその他の変数は、構築物の発現に影響を与える可能性があります。この実験では、CMVプロモーターによるCa_V1.1のα1Sサブユニットの最適発現には4〜6週間かかりますが、2週間から最大12〜15か月まで検出できます。

図2:エレクトロポレーション用マウスフットパッドにおけるcDNA注入およびエレクトロポレーションエレクトロポレーション電極位置決めの図。 (A)マウスフットパッド下でのヒアルロニダーゼおよびcDNA注入の針位置。矢印は、スキンを通る挿入点を示します。(B)注射後、皮膚のわずかな変色と足のサイズのわずかな増加を一時的に観察する必要があります。.(C)エレクトロポレーションのための電極アレイの位置決め。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3.筋肉解剖と繊維分離

注:骨格筋線維解離は、改変を加えて前述の^{ように行った37}、^40、41。次のセクションでは、プロトコルはマウスの2つのフットパッドに適しています。

1. 繊維が解離する前に、60 mmのプラスチックシャーレでエラストマー10部(%w / w)に硬化剤1部を加えて、厚さが~5 mmになるようにシルガードで覆われたプレートを準備します。エラストマーで覆われたプレートを使用前に一晩硬化させます。これは、使用前と使用後に適切に保管し、70%エチルアルコールで消毒すれば、複数回再利用できます。
2. 10%ウシ胎児血清(FBS;最終濃度2 mg / mL)を添加した2 mLのスピナー最小必須ワシ培地(S-MEM)に4 mgのコラゲナーゼI型を調製します。溶液を35 mmのコーティングされていないプラスチックプレートに移し、皿を37°C、5%_CO2のインキュベーターに入れます。
   注:S-MEMは、グルタミンと^Ca2+を含まない修飾MEM製剤です。このステップで^Ca2+ が存在しないと、酵素消化および摩砕中の繊維拘縮が減少します。
11. 
    
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反復的な電界刺激に応答して伝播活動電位がトリガされると、脱分極の特定の周波数に応答して特定の電圧センサの動きを追跡することができる。 図6Aに示すように、VSD-IIタグ付きヘリックスの動きは、10Hz(すなわち、100ms間隔で)で適用される2つの連続した脱分極のそれぞれに応じて追跡することができる。シグナルの漂白は、ベースラインをトレースに差し引くことで補正できます(図6B)。第1応答と第2応答のさらなる時間倍率(図6C)により、これらの急速に発達するVSD-IIらせんの動きを正確に観察することができます。フィールド刺激トリガからの時間マーカーにより、10μsの精度で1番目と2番目の応答の相対的な時間的アライメントが可能になります。両方の信号をそれぞれの最小値(つまり、最小ピーク)で正規化して、2つの応答の速度論的比較を可能にします(図6D)。相対蛍光のこれらの記録から、ピークまでの時間は、この電圧センサーの連続した脱分極間で同等であることが観察できます。

このアプローチは、さまざまな周波数の脱分極と複数の活動電位で個々の電圧センサーの動きを追跡して、それらの活性化と電荷の動き、カルシウム電流、またはカルシウム過渡との関係を研究するために使用でき、以前に報告されたように、異なるファイバーのセットで並行して研究できます37。

図6:10Hzでの2回の連続した脱分極によってトリガーされたEGFP-CaV1.1 VSD-IIからの代表的な蛍光記録。 (A)10Hzで2回刺激したEGFP-Cav1.1 VSD-IIを発現するファイバーのΔF/F0蛍光シグナルとベースライン補正曲線(紫)。上の黒い線は誘導された脱分極を示します。(B)2つの独立した応答(C)のΔF/F0ベースライン補正信号。プロット上の値は、ピーク時の最小リーチに対応します。(D)それぞれの最小ピークによる脱分極および正規化に対する信号アライメントは、両方の刺激に対して同等の動力学を伴うVSD-IIドメインの動きを示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:変更されたリンゲル溶液組成。

著者らは利益相反を報告していない。