単為生殖昆虫、カラショウアブラムシ、 Lipaphis erysimi (Kalt.)

サマリー

このプロトコルはマスタードアブラムシ(Lipaphis erysimi (Kalt.))、単為生殖の昆虫に対する昆虫病原性の菌類(EPF)の有効性を評価するための最大限に活用された一戸建ての葉の生物検定システムを示す。この手法は、ペトリ皿実験中のデータ収集プロセスの概要を示しており、研究者はマスタードアブラムシやその他の単為生殖昆虫に対するEPFの病原性を一貫して測定することができます。

要約

カラシナアブラムシ(L. erysimi)は、さまざまなアブラナ科の作物に寄生し、植物ウイルスを媒介する害虫です。環境にやさしい病害虫管理を実現するために、昆虫病原性真菌(EPF)は、この害虫を防除するための微生物防除剤として期待されています。したがって、ペトリ皿条件下でのEPF分離株の病原性スクリーニングは、フィールドアプリケーションの前に必要です。しかし、カラシナアブラムシは単為生殖性の昆虫であるため、ペトリ皿実験中のデータ記録は困難です。この問題に対処するために、マイクロ噴霧器を使用してアブラムシに分生子を接種し、胞子懸濁後の自然乾燥を容易にすることで溺死を防ぐという、分離葉バイオアッセイ用の改良システムを開発しました。観察期間中、高い相対湿度が保たれ、葉の円盤は10日以上新鮮に保たれ、アブラムシの単為生殖が可能であった。子孫の蓄積を防ぐために、ペイントブラシを使用して毎日除去するプロセスが実施されました。このプロトコルは、マスタードアブラムシまたは他のアブラムシに対してEPF分離株の病原性を評価するための安定したシステムを実証し、アブラムシ防除のための潜在的な分離株の選択を可能にします。

概要

カラシナアブラムシ(L. erysimi)は、さまざまなアブラナ科作物に蔓延し、重大な経済的損失を引き起こす悪名高い害虫です¹。アブラムシの蔓延と戦うためにいくつかの体系的な殺虫剤が推奨されていますが、これらの殺虫剤の頻繁な使用は、農薬耐性に関する懸念を引き起こします^2,3。したがって、環境に優しい害虫管理の観点から、昆虫病原性真菌(EPF)は適切な代替防除戦略として役立つ可能性があります。EPFは、宿主のクチクラを貫通して感染する能力を持つ昆虫病原体であり、アブラムシやその他の植物吸引昆虫を駆除するための強力な薬剤となっています⁴。さらに、EPFは実行可能で持続可能な害虫管理技術であることが証明されており、植物病原菌拮抗作用や植物の成長促進などの利点を提供します⁵。

EPFは、昆虫と土壌の餌付けによって得るか、または野外で昆虫の死体から単離することができる^6,7。ただし、真菌分離株をさらに使用する前に、病原性スクリーニングが必要です。深刻な被害を引き起こす可能性のある重大な作物害虫で....

プロトコル

メモ: 完全なフローチャートを 図 1 に示します。

1.マスタードアブラムシの収集とメンテナンス

1. カラシナアブラムシのコレクション
   1. 葉をひっくり返して、畑のアブラナ科作物にカラシナアブラムシが蔓延していないかを目視で確認します。
   2. サンプリング場所の情報(GPSなど)と宿主植物を記録し、殺虫剤の散布履歴を農家に確認します。
   3. 昆虫吸引器または細い塗装ブラシ( 材料表を参照)を使用して、圃場のアブラナ科作物から約50匹のマスタードアブラムシを50 mLの遠心分離管に集め、3時間以内にサンプルを実験室に運びます。
   4. アブラナ科の葉を切り取り、底に水を浸透させたろ紙を入れた一時的なメンテナンスペトリ皿を準備します。
   5. 5匹のアブラムシを室温(25±2°C)、相対湿度70%、12:12時間(明暗)の日長で14日間、アブラムシが天敵にならないことを確認してから飼育する。
      注:野外で採集されたアブラムシに寄生バチや昆虫病原菌などの天敵がいないことを確認するためには、飼育を進める前にこれらの生物がいないことを確認することが重要です。
2. カラシナアブラムシの維持
   注:マスタードアブ....

結果

提示されたフローチャートは、フィールド収集から病原性スクリーニングまでのマスタードアブラムシの安定した状態を示しています。野外での採集によるアブラムシの維持は、十分な餌の供給とアブラムシのコロニーの安定的な増加を保証しました。野外で採取されたアブラムシは、PCRアンプリコンサイズやLeCO1シーケンシングなどの分子マーカーを使用して、マスタードアブラムシであることが確認されました。Detached-Leaf法を用いて実施した病原性スクリーニングでは、カラシナアブラムシの生存率は一貫しており、対照群の生存率は85%でした(図4)。

病原性スクリーニング中、Cc-NCHU-213は最速のアブラムシ殺傷能力を示し、接種後3日および4.5日後にそれぞれ50%および90%の死亡率(d.p.i.)をもたらしました(図4)。しかし、アブラムシを殺す能力は、5つの B. bassiana 分離株の間で観察されました。Bb-NCHU-141、-143、および-15.......

ディスカッション

野菜のグループであるアブラナ科は、マスタードアブラムシ(L. erysimi)やキャベツアブラムシ(Brevicoryne brassicae)など、複数のアブラムシ種が頻繁に寄生しています²⁶。台湾では²⁷種とも報告されており、採集地では共存している可能性がある。近縁のアブラムシ種を区別するために、本研究ではマルチプレックスプライマーセット²¹を用いた分子同定技術を用いた。カラショウアブラムシのCOI遺伝子断片から分子マーカーを設計することにより、カラショウアブラムシの同定に成功し、分子マーカーA05Leの信頼性を確認した²¹。

その結果、大きさや形態のみに基づいて、第4齢の幼虫とマスタードアブラムシの成虫を区別することは、経験がなければ困難であることが明らかになりました。しかし、決定的な特徴は後脚の脛骨で、第4齢の幼虫では白く見えるが、成虫では白く見えな.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 μL 接種ループ	NEST Scientific	718201
100 bp DNA Ladder III	Geneaid	DL007
2x SuperRed PCR Master Mix	Biotools	TE-SR01
50 mL 遠心分離管	Bioman Scientific	ET5050-12
6 cm ペトリ皿	Alpha Plus Scientific	16021
6 mm 昆虫吸引器	MegaView Science	BA6001
70 mm 濾紙 NO.1	東洋老師
70% エタノール
9 cm シャーレ	アルファプラス サイエンティフィック	16001
寒天	バイオマン サイエンティフィック	AGR001.1	微生物学グレード
アガロース	バイオマン サイエンティフィック	PB1200
バイオグリーン セーフ DNA ゲルバッファー	バイオマン サイエンティフィック	サイ
テク	ネリジウム
GeneDoc
GenepHlow ゲル/PCR キット	Geneaid	DFH300	https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf
Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit Protech	Technology	PT-GD112-V3	http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
血球計算盤	Paul Marienfeld	640030
小松菜の葉 (Brassica rapa var. perviridis)	Tai Cheng Farm	1-010-300410
マイクロスプレー
MiniAmp サーマルサイクラー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A37834
マスタードアブラムシ(Lipaphis erysimi)
絵画ブラシ	Tian Chengブラシ会社	4716608400352
パラフィルムM	ビーミス	PM-996
ペレット乳棒バイオ	マンサイエンティフィック	GT100R
サブローデキストロースブロス	HiMediaMH033-500G
SPSS統計	IBM
TAEバッファー 50x	Bioman Scientific	TAE501000
Tween 80	PanReac AppliChem	142050.1661

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