DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

ゲノムDNAの損傷は、自然崩壊、内部損傷、および環境要因によって発生します¹。結果として生じるDNA病変は、損傷した塩基、ミスマッチ、一本鎖および二本鎖の切断、鎖間および鎖内架橋、およびDNA-タンパク質架橋(DPC)で構成されます。DPCは、クロマチン結合タンパク質が共有結合によってDNA上にトラップされると形成されます。DPCは、内因性DNA病変および反応性代謝物、ならびに化学療法薬および二官能性架橋剤などの外因性薬剤によって誘導される。特定の状況下では、酵素機能障害もDPCの形成^{につながる可能性があります2。}DPC誘導物質の大きな違いは、共有結合タンパク質の同一性、DPCが形成される染色体領域、タンパク質に架橋されたDNAの構造タイプ、およびタンパク質とDNA間の共有結合の化学的性質に違いをもたらします^2,3,4。

DPCは、その化学的性質に基づいて、一般に酵素DPCと非酵素DPCの2つのグループに分類されます。 トポイソメラーゼ、グリコシラーゼ、メチル/アシルトランスフェラーゼなどの特定の酵素は、通常の触媒反応中に可逆的な酵素-DNA共有結合中間体を形成することによって作用します。これらは短寿命の酵素-DNA中間体であり、内因性または外因性の薬剤、特に化学療法薬によってトラップされると、長寿命の酵素DPCに変換^{できます3。}トポイソメラーゼDPCは、真核細胞において最も頻繁に使用される酵素DPCの一つであり、臨床的に有用なトポイソメラーゼ阻害剤(トポイソメラーゼI [TOP1]の場合はトポテカンおよびイリノテカン、トポイソメラーゼII [TOP2]の場合はエトポシドおよびドキソルビシン)によって生成することができ、これらの阻害剤の主要な治療メカニズムです^5,6.DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)1、3A、および3Bは、5-アザ-2'-デオキシシチジン(デシタビンとしても知られている)の標的であり、薬物⁷への曝露時にDPCを形成します。反応性薬剤は、紫外線および電離放射線と同様に、タンパク質をDNAに非特異的に架橋することによって非酵素的DPCを誘導する。アセトアルデヒドやホルムアルデヒド(FA)などの反応性アルデヒドは、細胞代謝の副産物として生成されることが多く、その中でFAはメタノール代謝、脂質過酸化、ヒストン脱メチル化の際にマイクロモル濃度で生成されます。また、FAは世界中で製造されている大量生産の化学物質であり、多くの人々が環境的および職業的にさらされています^8,9。

酵素的および非酵素的DPCはどちらも、そのかさばるタンパク質成分が複製および転写を含むほぼすべてのクロマチンベースのプロセスを効率的に妨げ、修復せずに放置すると細胞周期の停止およびアポトーシスを引き起こすため、細胞に対して非常に毒性があります。過去20年間、DPCの修復は精力的に研究されており、DPCを直接修復するか、修復プロセスを調節する重要な要因として、いくつかのタンパク質/経路が特定されています。例えば、DPCのタンパク質バルクのタンパク質分解がDPC修復の重要なステップであり、タンパク質分解がプロテアーゼSPRTN 10、11^、12、13、14、FAM111A¹⁵、GCNA^16、17、または26Sプロテアソーム複合体¹⁸、¹⁹、^20、21、22によって触媒され得ることは十分に確立されている,23,24,25,26,27は、細胞型または細胞状況依存的に。これらのプロテアーゼの同定および特性評価は、酵素(ICE)アッセイ^28,29およびDNA付加体回収への迅速なアプローチ(RADAR)アッセイ^30,31のin vivo複合体に大きく依存しており、どちらも遊離細胞タンパク質からDNA分子およびその共有結合タンパク質を単離し、架橋タンパク質を標的とする抗体を用いたスロットブロットによるDPCの検出を可能にする。また、トラップインアガロースDNA免疫染色(TARDIS)アッセイは、単一細胞レベルでDPCを検出および定量する手段として使用されました³²。現在、ICEアッセイは非常に時間がかかる塩化セシウム勾配超遠心分離を使用した核酸の精製に依存しているのに対し、レーダーアッセイはエタノールを使用して核酸をはるかに短い期間で沈殿させるため、研究者はICEアッセイよりもレーダーアッセイを選択してDPCを測定しています。

近年、DPC標的プロテアーゼのシグナル伝達と動員に複数の翻訳後修飾(PTM)が関与しているという証拠が増えています3,33,34,35。例えば、TOP1-DPCとTOP2-DPCの両方が、DNA複製と転写とは無関係に、低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)-2/3によって結合し、次にSUMO-1によってSUMO-3リガーゼPIAS4によって結合することがわかりました。逐次SUMO修飾はユビキチンの標的であると考えられ、ユビキチンはSUMO化TOP-DPCに沈着し、RNF4と呼ばれるSUMO標的ユビキチンリガーゼによってリジン48残基を介してポリマー鎖を形成します。続いて、ユビキチンポリマーは、26Sプロテアソームへのシグナルを惹起し、^{TOP-DPCs23,36}に動員する。同じSUMOユビキチン経路が最近、DNMT1-DPCおよびPARP-DNA複合体に作用して修復することが示されました^37,38。さらに、ユビキチンE3リガーゼTRAIPによるSUMO非依存性ユビキチン化は、複製共役様式でプロテアソーム分解のためにDPCをプライムすることが報告されています³⁹。TOP-DPCのプロテアソーム分解と同様に、複製共役メタロプロテアーゼSPRTNによる酵素的および非酵素的DPCのタンパク質分解も、SPRTN^40,41を係合させるメカニズムとしてDPC基質のユビキチン化を必要とします。SUMO化とユビキチン化の役割を説明するには、これらのPTMでマークされたDPCを検出する必要があります。オリジナルのICEアッセイとRADARアッセイは、未消化のDNAサンプルを測定するためにスロットブロット/ドットブロット装置に依存しているため、これら2つのアッセイはどちらも、分子量の異なるPTM結合DPC種を分解して視覚化することはできません。この問題を克服するために、エタノール沈殿による精製とミクロコッカスヌクレアーゼ、DNAおよびRNAエンドエキソヌクレアーゼによるサンプル正規化によってDNAサンプルを消化し、架橋タンパク質を遊離させ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)でタンパク質とその共有結合性PTMを分離することができました。電気泳動により、PTMを標的とする特異的抗体を用いてPTM結合DPCを検出および定量することができました。当初、この改良されたメソッドをDUSTアッセイと名付け、ユビキチル化およびSUMO化TOP-DPCの検出における堅牢性を強調しました²³。その後、ポリADP-リボース^{ポリマー20}に対する抗体を用いて、インビボでTOP1-DPCのADPリボシル化を定量的に評価するためにアッセイの使用を拡大しました。

ここでは、ユビキチル化、SUMO化、およびADPリボシル化DPCを検出および測定するアッセイの詳細なプロトコルを示し、阻害剤によって誘導される修飾TOP-DPCおよびFAによって誘導される非特異的/非酵素的DPC用に最適化されています。このアッセイでは、カオトロピック剤で細胞を溶解し、エタノールでDNAを沈殿させ、架橋タンパク質とその修飾因子をミクロコッカスヌクレアーゼで放出することにより、PTM結合DPCを単離します。それ以外のDNA結合タンパク質とそのPTMは、特異的抗体を用いたイムノブロッティングによって定量されます。このアッセイは、細胞が酵素的および非酵素的DPCの両方を修復する分子メカニズムを解明するための新しい道を開きます。 具体的には、TOP-DPCの分解と修復の制御に重要なPTMの誘導と動態の詳細な研究を可能にし、PTMを決定するE3リガーゼなどの新規因子の発見を可能にします。 これらの因子を標的とする阻害剤と同様に。TOP-DPC修復に関与するPTMの一部は、プラチナベースの薬物などの他の化学療法薬によって誘導されるDPCの修復に関与している可能性が高いため²²、このアッセイは、新薬の発見への応用や、治療計画を導くために患者細胞内のトポイソメラーゼ阻害剤またはプラチナベースの抗腫瘍薬との併用療法の合理的な最適化にも応用できる可能性があります。

1. ヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞株における細胞培養と薬物処理

1. 10%ウシ胎児血清、1%2 mM L-グルタミン、および100単位/mLペニシリン-ストレプトマイシンを添加した培養培地、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を準備します。
2. 処理条件とコントロールごとに、60 mmプレートまたは6ウェルプレートに1 x 10⁶ 細胞をシードします。
3. 翌日、選択したDPC誘導物質で細胞を処理します。
   1. TOP1-DPCとそのユビキチン化およびSUMO化を誘導するには、TOP1阻害剤カンプトテシンを20 μMで細胞に添加し、20、60、および180分で細胞を回収します。
   2. TOP2αおよびβ-DPCおよびそれらのユビキチン化およびSUMO化を誘導するには、細胞を露出させてTOP2阻害剤エトポシドを200 μMで細胞に添加し、20、60、および180分で細胞を回収します。
   3. 非酵素的DPCとそのユビキチン化およびSUMO化を誘導するには、1 mMでFAを添加し、曝露の2時間後に細胞を収集します。
   4. TOP1-DPCのPAR化を誘導するには、細胞を1時間前処理して、10 μMのポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ(PARG)阻害剤PDD00017273による脱PAR化をブロックし、続いて20 μMのカンプトテシンと20、60、および180分間共処理します。

2. 架橋タンパク質を含むDNAの単離と標準化

1. 処理後、吸引ピペットで培地を迅速に吸引し、氷冷した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗い流します。1xプロテアーゼカクテル阻害剤、1 mMジチオスレイトール(DTT)、および20 mM N-エチルマレイミド(脱SUMO化および脱ユビキチル化酵素の阻害剤)を含む600 μLのDNAzol試薬で細胞を直ちに溶解します。
2. 振動プラットフォーム上でプレートを4°Cで10分間ゆっくりと攪拌します。
3. 1/2容量の100%冷エタノール(0.3 mL)をプレートに直接加え、不透明な核酸凝集体が見えるようになるまでステップ2.2を繰り返します。細胞ライセートを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、チューブを最高速度(20,000 x g)にかけ、4°Cで15分間遠心分離して、核酸とその架橋タンパク質を沈殿させます。
4. 吸引ピペットを使用して上清を吸引し、核酸ペレットを1 mLの75%エタノールで洗浄した後、4°Cで20,000 x g の2分間遠心分離を行います。
5. 上清を吸引し、同じ速度でスピンダウンし、P20ピペットを使用して残りの液体を除去します。ペレットを5分間風乾します。
6. 核酸ペレットを0.1 mLの_ddH2Oに素早く溶解し、ピペッティングを繰り返してペレットを再懸濁し、ペレットが少なくとも3倍(約30分)膨潤するまで37°Cの水浴中でインキュベートします。
7. ペレットを完全に溶解するために10秒間30%の振幅で超音波プロセッサプローブでサンプルを超音波処理します。
8. オプションの手順:サンプルをRNase A/T1ミックス(10 μgのRNase Aと25 UのRNase T1)で処理し、37°Cで15分間インキュベートします。1/10容量の3 M酢酸ナトリウムと2容量の氷冷100%エタノールをチューブに加え、20,000 x g で10分間遠心分離してDNAを回収します。上清を除去し、沈殿したDNAを0.1mLの_ddH2Oに溶解する。
9. オプションステップ:サンプルを20,000 x g で5分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。
10. 紫外可視(UV-Vis)分光計を使用してDNA濃度を定量します。典型的なDNA収量は約600〜800 ng / μLです。RNA除去後、A260 / A280比を2.0-2.1から1.8-1.9に減らす必要があります。
11. 0.12 mLのddH 2 O中のDNAの濃度を400〜500 ng / μLに調整し、未消化DNAローディングコントロールとして20 μLのサンプルを新しいマイクロ遠心チューブに移します(ステップ_2.4を参照)。
12. 残りの100 μLの_ddH2Oに溶解したDNAを消化するには、2,000ゲル単位のミクロコッカスヌクレアーゼと1/10容量(~11 μL)の10xカルシウムミクロコッカスヌクレアーゼ反応バッファーをサンプルに追加します。37°Cで30分間インキュベートします。

3. 消化DNAサンプルのウェスタンブロッティング

1. 4x Laemmli サンプルバッファーを添加し、サンプルを 5 分間煮沸します。
2. 5-6 μgの消化サンプル(~15 μL)を4%-20%ポリアクリルアミドゲルにロードし、続いてSDS-PAGE⁴² をロードして、未修飾およびPTM結合DPCを分離します。
3. FA誘導性の非酵素的DPC種を検出するには、室温で一晩クマシーブルーステインを含むゲルをインキュベートします。ゲルをddH 2 Oで₂時間洗浄し、イメージングシステムを使用して画像を取得します。
4. ゲルを移し、ブロッキングバッファーで一次抗体を適切に希釈しながら、メンブレンを4°Cで一晩インキュベートします。
   1. ユビキチン化を検出するには、抗ユビキチン抗体を1:100に希釈します。
   2. SUMO-1またはSUMO-2/3修飾を検出するには、抗SUMO-1または抗SUMO-2/3抗体を1:250に希釈します。
   3. ADPリボシル化を検出するには、抗PAR抗体を1:500に希釈します。
   4. TOP1、TOP2α、またはTOP2β-DPCの合計を検出するには、抗TOP1、抗TOP2α、または抗TOP2β抗体を1:500に希釈します。
      注:抗体希釈の詳細については、 材料表 を参照してください。
5. 1x PBS-T(0.1%トゥイーン20)洗浄メンブレンを、ブロッキングバッファーで5,000倍に希釈した二次抗体とともに室温で60分間インキュベートします。
6. 化学発光増強(ECL)試薬でメンブレンを開発し、イメージングシステムを使用して画像を取得します。

4. 未消化DNAサンプルのスロットブロッティング

1. 20 μLの未消化DNAサンプルを180 μLのリン酸ナトリウムバッファー(25 mM、pH 6.6)で希釈します。
2. ニトロセルロースメンブレン(0.45 μm)を切断し、リン酸ナトリウム緩衝液中で5分間平衡化します。
3. 製造元の指示に従ってスロットブロット装置を組み立て、真空システムに接続します。
4. 真空を適用してリン酸ナトリウム緩衝液でウェルを洗浄する。ウェルの漏れがないことを確認してください。
5. 真空を停止し、サンプルあたり200 μLのDNA(1 μg)をロードします。空のウェルに200 μLのリン酸ナトリウムバッファーを満たします。
6. 真空を適用します。
7. すべてのウェルが完全に空になったら、真空を停止し、各ウェルに200 μLのリン酸ナトリウムバッファーをロードし、ステップ4.6を繰り返します。
8. メンブレンを回収し、5%ブロッキングバッファーで室温で0.5時間ブロックします。
9. 抗二本鎖DNA(dsDNA)抗体を1:5,000希釈で4°Cで一晩プローブします。
10. 1x PBS-Tで3倍洗浄し、1:5,000希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗マウス二次抗体でインキュベートします。
11. 化学発光増強(ECL)試薬でメンブレンを開発し、イメージングシステムを使用して画像を取得します。

5. デンシトメトリー分析

1. ImageJを使用して、未消化DNAのスロットの強度に対する各バンド/塗抹標本の強度の比率を計算し、薬物処理なし/治療前の細胞の比率を正規化します。

図1に示す代表的な結果は、薬物誘発性TOP1-DPCの形成と動態、およびそれらのSUMO化とユビキチン化を示しています。TOP1はDNA二本鎖の1本鎖を切断し、TOP1切断複合体(TOP1cc)と呼ばれる酵素-DNA共有結合中間体を形成した。TOP1阻害剤であるカンプトテシン(CPT)の治療は、TOP1ccに結合して安定化し、長寿命のTOP1-DPCの形成につながります。TOP1-DPCは、CPTへの曝露後20分で誘導され、ピークに達することが観察されました。 同時に、TOP1-DPCはSUMO-2/3によって修飾され、これもCPT処理の20分後にピークに達しました。SUMO-2とSUMO-3は95%の配列同一性を共有するため、抗体は互いに区別しません。60分後、TOP1-DPCとそのSUMO-2/3修飾は減少し、SUMO-1修飾とユビキタス化の頂点を伴いました。60分間の薬物治療後、TOP1-DPC SUMO-1修飾およびユビキチン化のレベルは低下し始めた。哺乳類では、TOP2アイソザイムαおよびβは、DNA二本鎖切断を導入することによって、ならびに一過性で可逆的な酵素-DNA共有結合複合体(TOP2cc)の形成を介して作用する。エトポシド(ETOP)などのTOP2阻害剤は、TOP2ccをTOP2-DPCに変換し、それらのSUMO化およびユビキチル化を誘導します。TOP1-DPCとそのPTMの速度論と同様に、TOP2αおよびβ-DPCとそのSUMO-2/3修飾は20分でピークに達し、その後減少し始めました。一方、SUMO-1とユビキチンの修飾は60分でピークに達しました(図2)。TOP-DPCのクリアランスはプロテアソーム分解に起因することが実証されており、TOP-DPCのSUMO化とユビキチン化のクリアランスは、それぞれ逆転酵素による脱SUMO化と脱ユビキチン化によるリサイクルによる可能性が高い。図3の実験では、FA誘導性の非酵素的DPCとそのPTMを調べました。DPCとそのSUMO-2/3、SUMO-1、およびユビキチン化は、FA用量依存的に形成および蓄積されることが観察されました。最後に、同じ方法を用いて抗PAR抗体でTOP1-DPCのPAR化を定量的に検出しました(図4)。TOP1-DPCのPAR化は、PARG阻害剤を細胞に添加しない限り検出できず、PAR化が迅速に発生し、非常に動的であることが示唆されました。以前の発見と一致して、PARGiによる脱PAR化の阻害は、おそらくタンパク質分解分解をブロックすることによって、TOP1-DPCを蓄積するように見えました。

図1:HEK293細胞におけるCPT処理時のTOP1-DPCの形成と動態、およびそれらのSUMO化とユビキチン化の定量的解析 。 (A)HEK293細胞を20 μM CPTで所定の期間処理した。細胞ライセートを回収し、指示された抗体を用いて改変レーダーアッセイおよびウェスタンブロッティングに供した。未消化DNAサンプルは、ローディングコントロールとして抗dsDNA抗体を用いたスロットブロッティングを行った。(B)バンド強度はImageJソフトウェアで定量化し、Prismソフトウェアでプロットしました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:HEK293細胞におけるETOP処理におけるTOP2-DPCの形成と動態、およびそれらのSUMO化とユビキチン化の定量的解析 。 (A)HEK293細胞を200 μM ETOPで指示された期間処理した。細胞ライセートを回収し、指示された抗体を用いて改変レーダーアッセイおよびウェスタンブロッティングに供した。未消化DNAサンプルは、ローディングコントロールとして抗dsDNA抗体を用いたスロットブロッティングを行った。(B)バンド強度はImageJソフトウェアで定量化し、Prismソフトウェアでプロットしました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:HEK293細胞における非酵素的DPCとそのFA処理によるSUMO化およびユビキチン化の定量的解析 。 (a)HEK293細胞を指示濃度のFAで2時間処理した。細胞ライセートを回収し、指示された抗体を用いて改変レーダーアッセイおよびウェスタンブロッティングに供した。未消化DNAサンプルは、ローディングコントロールとして抗dsDNA抗体を用いたスロットブロッティングを行った。(B)バンド強度はImageJソフトウェアで定量化し、Prismソフトウェアでプロットしました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:HEK293細胞におけるCPT処理時のTOP1-DPCとそのPAR化の定量分析 。 (A)HEK293細胞を10 μM PARGiで1時間前処理した後、CPTと一定期間同時処理しました。細胞ライセートを回収し、指示された抗体を用いて改変レーダーアッセイおよびウェスタンブロッティングに供した。未消化DNAサンプルは、ローディングコントロールとして抗dsDNA抗体を用いたスロットブロッティングを行った。(B)バンド強度はImageJソフトウェアで定量化し、Prismソフトウェアでプロットしました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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