新しい冷却セルプロセッサシステムが膵島セル隔離施設に与える影響の評価

Summary

ここでのプロトコルは、GMP(Good Manufacturing Practices)クリーンルームと互換性があり、細胞の生存率後処理を改善するためのカスタム冷却セルプロセッサシステムについて説明しています。

Abstract

標準的な細胞治療装置は、臨床移植のためにヒトの膵島を精製するためのゴールドスタンダードの細胞処理装置を含め、ほとんど冷蔵されないため、遠心分離ステップ中に細胞を高温にさらす可能性があります。カスタム冷却システムは、人間の膵島の生存率と機能に直接的な利益をもたらします。本研究は、最小限の変更で容易に利用できる冷却型セルプロセッサーシステムの有効性を検証し、ヒト細胞の生存率とGMPクリーンルーム環境への影響を評価するために設計されました。このクーラーシステムは、-30°Cに設定された機械式冷凍熱交換器を使用して、遠心分離機のカバーに開けられた穴から冷却された医療グレードの乾燥空気をセルプロセッサーボウルに送り込みました。カタールでは膵臓ドナーの利用が限られているため、システムバリデーションは、プールされたヒト骨髄バフィーコートの連続的な密度勾配精製で行われました。無菌性、乱流、および粒子数は、クラスCおよびクラスBのクリーンルーム環境で測定されました。冷却されたセルプロセッサの周囲に乱流が発生することはなく、クリーンルームのGMP基準に従って、0.5 μmおよび5 μmの過剰な空気中の微粒子は発生しませんでした。収集ステップの開始時と終了時に、温度は非冷却セルプロセッサで0.20°C±0.34°Cと21.93°C±それぞれ21.50°Cに上昇し、冷却セルプロセッサでは0.17°C±11.16°C±0.35°Cにそれぞれ上昇しました（p <0.05)。冷却されたセルプロセッサーにより、単核細胞分画の回収率(98%)と後処理後の生存率(100%)(100±2%)の両方が向上しました。新しい冷却システムは、GMPクリーンルーム環境に微粒子の影響を与えずに、セルプロセッサによって生成される熱を効果的に低減します。ここで説明する冷却セルプロセッサは、安価(税金、通関手続き、輸送費を含まない16,000ドル)で、堅牢な冷却を提供する低侵襲の方法です。現在、GMP細胞治療施設における本技術は、臨床プログラムのためのヒト膵島細胞の単離・移植に応用されています。

Introduction

重症1型糖尿病に対する膵島移植は、内因性インスリン分泌を回復させることができ、多くの国で標準治療となっています¹.膵島の単離は、膵臓の温性酵素的および機械的消化、消化組織の回収のための冷却相、およびセルプロセッサー上での連続的または不連続な密度勾配による膵島精製を含む多段階の手順です。急速な冷却は酵素消化段階を遅らせ、腺房細胞を汚染することによって遊離する消化酵素から膵島を保護します。セルプロセッサはもともと、周囲温度で細胞の血液成分を分離するように設計されました²。これは、1989年にランゲルハンスの人間の膵島を浄化するために再利用されました³。30年間にわたり、ヒト膵島は臨床試験のために精製され、最近では、不連続な勾配を持つ細胞プロセッサーで精製されてきました⁴、または勾配メーカー¹または同等のコンピューター操作ミキサー^5,6,7.他のグループは、大型の哺乳動物や人間から大型の円筒形のプラスチックボトルを使用した膵島精製を報告しています^8,7,9、これにより精製の有効性と膵島の品質が大幅に向上しました。

確かに、臨床移植のためにヒトの膵島を精製するためのゴールドスタンダードを考慮すると^10,11、製造されたセルプロセッサーは冷蔵がありませんでした。冷蔵がなかったことの直接的な結果として、膵島は精製ステップ中に温度上昇にさらされました。遠心分離中、ローターの機械的摩擦により、制御不能な温度上昇が発生します^12,13。細胞プロセッサーは、グルコース誘発性インスリン分泌と細胞生存率を統計的に増加させる膵島分離センターの冷却システムに適応させ、精製手順中に膵島を低温に保つことの利点を確認しました^14,15。

1980年代後半に、密度勾配精製中の膵島の損傷を減らすために10機の冷蔵プロトタイプが製造されたが、それ以上の注意が払われなかったことに注意すべきである。セルプロセッサーのプロトタイプは、チルドポリエチレングリコールによるスピンドルとボウルの冷却に基づいていました。特に、臓器保存液や多糖類の密度勾配などの膵島精製溶液は、室温以上で使用すると膵島の生存率に悪影響を及ぼす可能性があります^16,17,18.膵島細胞精製のための細胞プロセッサーと元の非冷蔵細胞プロセッサーの異なる冷却戦略の比較を評価し、ローターの摩擦によって発生する制御不能な温度上昇に対抗するために評価しました。ヒト膵島の精製中に細胞プロセッサーを冷却するためのいくつかの試みがなされてきました。セルプロセッサは、イリノイ大学の島分離センターで現在使用されている勾配遠心分離中に0〜8°Cの温度を維持するために特別に設計された冷蔵室に一時的または恒久的に収容できますup class="xref">19<、マイアミ大学¹⁴、オックスフォード大学の施設¹⁵、およびサンフランシスコ大学(カスタム冷却ユニットはセルプロセッサを包んでいます)。別の変更には、ジュネーブ、スウェーデン、およびチェコ共和国の電子制御液体窒素冷却を使用した冷却システムによるセルプロセッサスピンドルのコア冷却が含まれます^15,19。2000年半ばの別の選択肢は、リール大学の空調ユニット^{12によるセルプロセッサのコア冷却、}またはシャフトの液体冷却による冷却でした。

セルプロセッサの冷却変更は容易には利用できず、保証の喪失や機械の保守に対する建設業者の拒否など、GMPクリーンルーム環境内でのリスク(湿度、結露の蓄積)を伴います。その結果、ミラノ(イタリア)、オスロ(ノルウェー)、エジンバラ(スコットランド)など、一部の島センターでは、島精製プロセス中に細胞プロセッサの冷却システムを使用しません¹⁵。

現在の研究は、新しく開発された容易に利用可能なクーラーと最小限の改造されたセルプロセッサシステムの有効性をテストするために設計されました。簡単に説明する空気ベースのクーラーは、-40°Cから-100°Cの間の乾燥ガスの1標準立方フィート/分(SCFM)の温度を制御する機械的に冷却された熱交換器です。この冷却システムには、乾燥した医療用空気の供給が必要です。空気はラインと熱交換器を通って流れ、(7.9 mm)ノズルから出ます。ノズル内に配置されたヒーターは、空気の流れの温度を制御するために熱を供給します。予備の固体プラスチック遠心分離機カバーが購入され、最小限の変更が加えられました。カバーには直径13.3mmの穴が開けられ、冷却された空気はクーラーノズルから遠心分離機カバーの穴を介してセルプロセッサに送られました。冷却された医療用空気は、液体の温度または密度勾配を絶えず制御しながら、セルプロセッサの遠心分離ボウル内に注入されました。

冷却セルプロセッサの技術的性能と、冷却エレメントがGMPクリーンルーム環境に与える影響を評価しました。主な焦点は、生存率を維持するために、ヒトの膵島精製中に堅牢に低い温度(<10°C)を達成することでした。膵島単離の代理としてバフィーコート密度分離を使用して、この冷却プロトコルが細胞生存率に及ぼす影響を決定しました。

Protocol

このプロトコルは、施設の廃棄ガイドラインに従って使用に適さない廃棄された全血を使用しました。IRB の承認とインフォームド コンセントは適用されません。

1. 冷却セルプロセッサのセットアップ

注:すべての手順はクリーンルーム環境で行われなければならず、スタッフはクリーンルームの衣服の手順を尊重しなければなりません。

1. 機器の購入
   1. 予備のプレキシガラス蓋を購入します。冷却装置システム、機械式冷凍ガス流温度コントローラー付きクーラー、エアドライヤー、圧力および流量調整器、および保証(オプション)を購入します。参照については、資料の表を参照してください.
      注:合計費用は、送料や通関手数料なしで16,133ドルです。
   2. 標準グレード(欧州薬局方参照1238)に準拠した圧縮医療ガスである医療用ドライエアを、地元の医療ガス供給業者にご注文ください。6.8m3(47L:23cm×153cm、直径×長さ)のシリンダーを2本購入します。
2. 機器のセットアップ (図 1 および 図 2)
   1. GMPクリーンルームに機器を入室(GMP手順に従ってクリーンルームに入る前に消毒してください。
   2. 医療グレードの圧縮空気の場合は、ガスボンベをクリーンルームに直接設置するのではなく、ガスラインを設置してください。
3. 冷却のためのセルプロセッサの変更
   1. まず、プレキシガラスのカバーを取り外します。保証に問題がある場合に備えて、元のプレキシガラスカバーを保管してください。セルプロセッサーの予備蓋に、冷却装置のノズル先端の外径に合わせて直径の穴を開け、遠心分離機のカバーのひび割れを防ぎます(13.3mmを推奨)。
   2. ブラケットを円形のフォームで固定します。これは、蓋の破損や引っかき傷を防止するため、セルプロセッサの上の所定の位置に冷却ノズルを保持するため、注入された空気の高圧による過度の曲げから蓋を保護するため、ノズルの重量を支えるため、そして最後に、実験手順中に必要なすべてのセルプロセッサ機能に自由かつ安全にアクセスできるように、オペレータに最大限の安全性を確保するために使用されます。
   3. 冷却ノズルをプレキシガラスの穴に取り付けて、冷却システムをセルプロセッサに接続します。ブラケットとフォームクッションで固定します。
   4. 冷凍ハウジングをノズルから最大8フィート(2.44 m)離して配置します。温度コントローラーを別のキャビネットに収納し、冷凍ハウジングから6フィート(1.83 m)以内に置きます。
   5. クーラーの空気流を冷却するために、クーラーの設定値を-40°Cに設定します。出口温度は、デジタルインジケータに0.1°Cの分解能で連続的に表示され、温度コントローラーを使用して出口温度をデジタルで0.1°Cに設定します。
   6. クーラーに供給する前に、圧力および流量レギュレーターモジュール(図2)で空気供給の圧力と流量を制御します。それぞれ55 psiと4 SCFMの流量に設定して、-30 °C±2 °Cで冷却された空気流で最適な条件に到達します。
   7. 圧縮空気が-30°Cに達するには医療用ガスの供給が5 barの圧力で調整され、少なくとも90分間持続できることを確認します
      注:医療用乾燥空気は圧縮された医療用ガスであり、完全に加圧された乾燥空気は標準グレードに準拠しています。
   8. セルプロセッサーの蓋に接続されたクーラーノズルから、遠心分離機のカバーに開けられた穴を通して5バールを供給します。冷却した医療用空気をセルプロセッサーの遠心分離ボウル内に注入します(図2)。冷却された空気が遠心分離機ローターのアルミニウムリムに垂直に向けられるように、エアインジェクションの位置を選択します。
   9. セルプロセッサーを準備するときは、ローターが室温(18°C)にあることを確認してください。冷却システムの自動温度調節器を-30°Cに設定し、ローターに直接冷気を注入します.
      注:セルプロセッサセルセパレーターシステムの耐熱性と遠心分離中のローターの加熱を克服するために必要な+4°Cの最適な温度勾配に到達するために、さまざまな試験条件がテストされました。プログラムされたサーモレギュレーターは、手順中、特に遠心分離中に、+18°Cのクリーンルーム温度で細胞処理装置内の最適な目標温度を維持します。
      1. セルプロセッサを最初の予冷フェーズでセットアップし、プロセッサ(セルプロセッサキットなし)を+3°Cで30〜45分間冷却し、セルプロセッサを実行する2番目の予冷フェーズは、キットを+4°C、134 x gで5分間予冷します。

2. 空気中の微粒子の数

1. ISO 14644-1規格に従って、冷却装置がGMPクリーンルーム環境に準拠しているかどうかを評価し、運転段階での熱装置の影響を評価します。
2. 粒子数モニタリングを使用して、静止時および運転中の重要な制御ポイントで必要なレベルの清浄度が達成されているという証拠を提供します。
   1. サンプル位置の最小数は、測定する領域によって異なります。これを方程式を使用して計算します
      
      ここで、Aはクリーンルームまたはクリーンエアコントロールスペースの面積(m²)で、NLはサンプル位置の数を整数に切り上げ
   たものです。
   2. 空中サンプリング量は、各場所の最小量です。エアーボリュームが、指定された最大粒子サイズの20個の粒子をカウントするのに十分な大きさであることを確認してください。航空機のサンプリング量を
      式で計算します。 V= 20/C x 1000
      ここで、Vは1箇所あたりの最小単一サンプル量(Lで表され)、Cはクラス限界(粒子数/ m³)です。
   3. 場所ごとに、エリアに応じて、1つ以上のサンプルを使用します。各場所でサンプリングされる最小量が 2 L で、最小サンプル時間が少なくとも 1 分であることを確認してください。
3. サンプリングする前に、パージフィルターでパーティクルカウンターデバイスをパージします。フィルターを取り外し、サンプリング用のアイソキネティックプローブと一緒に配置します。
4. 特定されたサンプリング位置にパーティクルカウンター装置を配置します。パーティクルカウンターデバイスのメイン画面からサンプル収集を開始します。
5. サンプリングが終了したら、パーティクルカウンターデバイスを次の場所に持っていきます。サンプリングのすべての場所が終了したら、データを確認し、レポートを印刷します。
6. エリア内のすべてのサンプリングポイントの平均粒子濃度が表1に記載されているクラス制限を下回った場合は、許容粒子濃度を持つために通過した部屋を考慮してください。

3. グラジエント調製と細胞分離処理

1. 実験に先立ち、軽密度と重密度のグラディエントとセルプロセッサーキットを冷蔵庫で+4°Cで一晩予冷します。
2. セルプロセッサーを安静時に45分間予冷します(つまり、使用前にセルプロセッサーの電源を入れます)。温度を+2°Cから+5°Cに維持し、+4°Cに予冷したセルプロセッサキットを挿入します。
3. 標準のエタノール冷却ダブルジャケットグラジエントメーカー(オプション;図 3)2つのガラスチャンバーを接続し、マグネチックスターラーの上に置きます。clamp 2つのチャンバーの間にチューブを挟みます。グラジエントメーカーをエタノール循環冷却チラーで0°Cで冷却します。
4. まず、チャンバーに130mLの高密度グラジエント(HD;1.087 g / mL)です。150mL/minのポンプ速度で負荷します。
5. 重いグラジエントが袋に入ったら、前面のビーカーに130 mLの高密度(HD)を、背面に140 mLの低密度(LD;1.063 g/mL)グラジエントを追加します(クランプを閉じた状態)。
6. 2つのチャンバー間で止血剤/クランプをクランプ解除し、50 mL/minのポンプ速度で連続的な勾配を作成します。
7. 全血老廃物から採取した複数のプールされた匿名のバフィーコート細胞(全血を10個のバフィーコートバッグに40mL〜60mLを添加した)から精製するために、ヒト単核バフィーコート細胞を予め調製しておき、血液バンクからの入手可能性に応じて調製しておきましょう。
   1. MNC 分離
      1. 密度勾配遠心分離法を使用して、低密度のヒト単核細胞を分離します。これを行うには、以下で説明する手順に従います。
      2. 細胞調製のために、血液の量を計算します(抗凝固全血または懸濁バフィーコート)。反転を混合することにより、血液を2x-4x緩衝液で希釈します。血液が希釈されるほど、単核細胞の純度は高くなります。
      3. リン酸緩衝液と抗凝固剤を混合して緩衝液を調製します。血液の量を35mLで割って必要なチューブの数を計算し、各チューブに1.073密度勾配溶液15mLを注ぎます。
      4. 希釈した血液懸濁液35 mLを、針に接続された60 mLシリンジを使用して密度勾配の表面を穏やかに流し、密度勾配上に徐々に重ねます。少量の場合は、ピペットを使用します。.インターフェースを乱さないようにしてください、これは貧弱な単核層をもたらすので。
      5. 400 x gで20分間、20°Cで中断なく遠心分離します(加速0、減速0)。遠心分離後、滅菌トランスファーピペットを使用して単核細胞の界面層を穏やかに回収します。細胞を別の新しい50 mLコニカルチューブに移します。
      6. 細胞を緩衝液(抗凝固剤を添加したPBS)で2回洗浄します。最初の洗浄では、細胞を含むチューブに50mLまでのバッファーを満たします。300 x gで20°Cで10分間遠心分離し、細胞をペレット化します(加速9、減速0)。すべての上清を慎重にそっと取り除きます。
      7. 血小板の除去のために2回目の洗浄を行います。ペレットをバッファーで50mLの容量に再懸濁します。200-300 x gで20°Cで10分間遠心分離します(加速9、減速0)。
      8. 細胞を最終容量5mLに再構成すると、これらの細胞は低密度MNC<1.073に似た比重を持つ必要があります。濃度計で勾配の比密度を測定します。
      9. トランスファーバッグに95 mLの高密度グラジエント培地(1.083 g / mL)を入れて、ペレットを最終容量100 mLに再懸濁します。本製品は、セルセパレーターを用いた精製にご使用ください。最終容量の 100 mL には、細胞と 1.083 個の高密度グラジエント培地が含まれています
         注:バフィーコートは、0.5%BSAまたは自家血漿を含むPBSで冷蔵庫に一晩保存できます。バフィーコートは洗濯もできます。
8. 100 mLの濃縮保存培地に懸濁したバフィーコートから分離した最大30 mLのMNCを、25 mL/分の蠕動ポンプを使用して、あらかじめ形成されたグラジエントにトップロードします。グラジエントを+4°Cに保ちます。
9. 事前に校正されたサーモプローブを使用して、セルプロセッサー内の温度を連続的に測定します。滅菌サーモプローブに接続されたデジタル熱電対を使用して、プロセス中のグラジエントとセルの温度を監視します。

4. 勾配荷重のさまざまなステップの最適化

1. +4°Cで予冷したセルプロセッサーキットを挿入し、重いグラジエント(130mL)を+4.5°Cでロードします。グラジエントローディングの終了時に、ローターから発生する熱を最小限に抑えるために、遠心分離機を比較的低速(537 x g)に設定します。
2. セルプロセッサをオフにして、油圧システムが運転前のレベルに戻り、空気を放出できるようにします。
3. セルプロセッサーを537 x gで再活性化し、重密度グラジエント(130 mL)と低密度グラジエント(140 mL)を添加して、+4.3 °C、流速50 mL/minで連続的な密度グラジエントを作成します。
4. バフィーコート(30mL)に100mLの冷蔵保存培地を+6°C、流速25mL/分で入れ、50mL(25mL×2)の洗浄液を加えます。
5. +5°Cで5分後、100 mL/minの流速で12本のボトルにスピングラジエントを回収します。
6. チューブに洗浄剤(M199 + 20%ヒトアルブミン+ 10%ペニシリンストレプトマイシン)を入れます。チューブ1に100mLの洗浄培地と150mLの細胞を、チューブ2-12に225mLの洗浄培地と25mLの細胞を充填します。

Results

冷却されたセルプロセッサがGMPクリーンルームに与える影響は、最初に定量化されました。標準化された方法では、GMPグレードのクラスCおよびクラスBのクリーンルーム環境において、セルプロセッサおよび加圧空気冷却システムに近い重要なポイントで空気中の粒子汚染を測定するパーティクルカウンターが使用されました。その結果、機器の周囲に乱流が発生しないことが示されました。記録されたデータによると、クリーンルームGMPグレードC、グレードB、およびBSL III基準(図4)に従って、0.5μmおよび5μmの空気浮遊微粒子はありませんでした。

すべての実験は連続多糖類密度勾配で行われました。まず、グラジエント溶液の温度測定を、冷却セルプロセッサーと非冷却セルプロセッサーで6回の実行で、異なる時点でセルなしでテストしました。その後の研究では、冷却されたセルプロセッサーを使用して、ヒト細胞を密度勾配で精製しました。

すべてのデータは、標準偏差(SD)±3...

Discussion

世界中の膵島分離施設は、何十年にもわたって、再利用された細胞プロセッサーでヒト膵島精製を採用してきました。一部の膵島生産施設は、非冷蔵セルプロセッサーで膵島を処理し続けているが、ほとんどのセンターは、セルプロセッサ^10,11,15の冷蔵バージョンを使用している。センターは、セルプロセッサを湿気や結露にさらされるという大きな欠点がある冷蔵室に配置するか、シャフトを含むセルプロセッサ自体に技術的に大幅な変更を加え、マシンの保証とその予防保守に直ちに影響を及ぼします。提示された新しいGMP細胞療法対応セルプロセッサー冷却システムは、室温での元のセルプロセッサーセルセパレーターによる遠心分離では達成できない、定義された低温(+ <10°C)で細胞処理を実行するのに有益です。

空冷技術はブリュッセル²⁰ でグループによって最初に使用され、

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Air粒子	カウンターLasair III
エアジェットXR40	SP Scientific	FTSシステムXR40
バイオセーフティキャビネット	Thermo Scientific	EQ-1301
循環冷却チラーJulabo		CF30
COBE 2991	テルモ BCT
コニカルクーリングトレイ	バイオレップ	CCT-01
ダブルジャケットグラディエントメーカー	社内
KJT-熱電対温度計	ハンナインスツルメン	HI93551N	液体温度測定用
マグネチックスターラー	Thermo Scientific	88880014
蠕動ポンプ	MasterFlex	MK-77921-79
温度計	Extech Instruments	RMS 430	COBE温度用
水なしビーズバスコール	パー	マー10122-00
材料および試薬
BD幹細胞列挙キット	BDバイオサイエンス
COBE 2911 チューブ キット	テルモ BCT	90819
コニカル チューブ 250ml	コーニング	430776
グラジエント密度 1.1	バイオクロム	L6155
目盛り付き使い捨てボトル	サーモフィ	ッシャー382019-1000
ヒトアルブミン20%	ケドリオン・バイオファーマ	8091600
M199 洗浄液	コーニング	99-784-CM
Masterflex	Masterflex	96400-6
医療ドライエア	リンデヘルスケア	Medi On 22
Pencillin-streptomycin	ギブコ
サーモプローブ	Biorep	TC-02	サーモセンサー
トリパンブルー	シグマ・アルドリッチ	15250061
ウィスコンシン大学ベルツァー校(UW)	生命の架け橋	RM/N 4055	コンサベーション・メディウム