このプロトコルは、神経(免疫)学研究のために、胚17日目のマウス脳から中枢神経系細胞培養を生成するユニークな方法を提示します。このモデルは、RT-qPCR、顕微鏡、ELISA、フローサイトメトリーなど、さまざまな実験手法を使用して分析できます。
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この記事について
サマリー
要約
中枢神経系(CNS)のモデルは、 in vivoで 見られる相互接続された細胞の複雑なネットワークを再現する必要があります。CNSは、主にニューロン、星状細胞、希突起膠細胞、およびミクログリアで構成されています。動物の使用を置き換え、削減するための努力が高まっているため、CNS感染症および病状の治療法の開発を可能にする、生来の細胞特性を探索するために、さまざまな in vitro 細胞培養システムが開発されています。特定の研究課題は、(誘導された)多能性幹細胞などのヒトベースの細胞培養システムによって対処できますが、ヒト細胞を扱う作業には、可用性、コスト、および倫理に関して独自の制限があります。ここでは、マウスの胚性脳から細胞を単離および培養するための独自のプロトコルについて説明します。得られた混合神経細胞培養物は、 in vivoで脳に見られるいくつかの細胞集団および相互作用を模倣する。現在の同等の方法と比較して、このプロトコルは脳の特性をより厳密に模倣し、より多くの細胞を獲得するため、1匹の妊娠中のマウスからより多くの実験条件を調査できます。さらに、プロトコルは比較的簡単で再現性が高いです。これらの培養物は、96ウェルベースのハイスループットスクリーン、24ウェル顕微鏡分析、フローサイトメトリーおよび逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)分析用の6ウェル培養など、さまざまなスケールでの使用に最適化されています。この培養法は、 in vitro 法の利便性を備えたCNSの複雑さの文脈の中で感染と免疫を調査するための強力なツールです。
概要
中枢神経系(CNS)の理解を深めることは、多くの神経炎症性疾患および神経変性疾患の治療選択肢を改善するために重要です。CNSは、脳、脊髄、および視神経内の相互接続された細胞の複雑なネットワークであり、ニューロン、希突起膠細胞、星状細胞、およびそれらの自然免疫細胞であるミクログリア1で構成されています。in vitroアプローチは、多くの場合、有意義な研究を行うために必要なマウスの数を大幅に減らすことができます。しかし、CNSの複雑な性質により、細胞株を使用してin vivoの状況を再現することは不可能です。混合神経細胞培養は、置換、還元、改良(3R)の原則に沿って、関連するモデルで神経(免疫)学の質問を調査するための非常に貴重な研究ツールを提供します2,3。
Thomsonらは、前述の全ての主要なCNS細胞型に分化する出生前脊髄細胞を用いた細胞培養方法を記載した4。このシステムはまた、シナプス形成、有髄軸索、およびランヴィエの結節を有する。この培養方法の主な制限は、脊髄であるため、脳を有用にモデル化せず、胚13日目(E13)の脊髄からの細胞収量が収縮していることです。したがって、これにより、調査できる実験条件の数が制限されます。そ....
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プロトコル
すべての動物実験は、動物使用に関する現地の法律とガイドラインに準拠しており、グラスゴー大学の地元の倫理審査委員会によって承認されました。動物は、英国内務省プロジェクトライセンスの後援の下、1986年英国動物科学的手順法に従って、特定の病原体のない状態で飼育されました。この研究では、社内で飼育した成体C57BL / 6Jマウスを使用しました。妊娠の成功率が高いため、若い女性(8〜12週間)の使用が推奨されます。オスは繁殖の複数のラウンドに再利用することができます。 図1 は、混合ニューロンおよびグリア培養物を生成するための記載された方法の概略概要を表す。
1.組織培養消耗品の調製
- クラス2安全キャビネット内の顕微鏡カバーガラスを含むプレートおよび/または皿を準備します。培養期間中の無菌性を確保するために、すべての試薬またはオートクレーブを滅菌してください。
- 各ウェルに適切な量のBA-PLL(13.2 μg/mLポリ-L-リジン臭化水素酸塩[PLL]、ホウ酸緩衝液[BA][50 mMホウ酸、12.5 mM四ホウ酸ナトリウム、pH 8.5]; 材料表参照)を加えます(6ウェルプレートでは1,000 μL/ウェル、96ウェルプレートでは100 μL/ウェル、容量は 表1にまとめられてい....
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結果
顕微鏡
ガラスカバーガラスで育てられた培養物は、顕微鏡で分析するのに理想的です。培養の発達を視覚化するために、カバーガラスをDIV0(細胞が付着した後)からDIV28までの複数の時点で4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定しました。NG2(未熟希突起膠細胞)とネスチン(神経幹/前駆細胞)、神経細胞マーカーとしてSMI31(軸索)、MBP(ミエリン)、NeuN(ニューロン細胞体)、またはグリアマーカーとしてCNP(希突起膠細胞)、GFAP(アストロサイト)、Iba1(ミクログリア)の3つの異なる染色の組み合わせを使用して、前述のように 免疫蛍光イメージングのために培養物を染色しました(図2)。
さまざまな細胞タイプを、CellProfilerパイプライン(',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール陽性(https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1)に基づく)を使用して定量しました。個々のデータポイントは、各.......
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ディスカッション
CNSは、脳から脊髄にまたがる複雑なネットワークであり、主にニューロン、希突起膠細胞、星状細胞、ミクログリアなど、多くの細胞型で構成されています1。各細胞は、CNS 9,10,11の恒常性を維持し、課題に対する適切な応答を生成する上で重要な役割を果たすため、これらすべての細胞タイプを含む培養システムは、脳が刺激にどのように反応するかを調べるための有用で用途の広いツールです。これらの細胞とその相互作用をin vitroの状況で研究できることは、さまざまな実験上の質問を簡単に調査するために多種多様な技術を使用できることを意味します。我々は、成体マウス脳の個々の細胞集団を模倣することができる出生前脳から主要なCNS細胞型を取得して培養するための迅速かつ効率的な方法を概説した12。
CNS培養.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
エドガーとリニントンの研究室のメンバー、特にクリス・リニントン教授、ダイアナ・アルセニ博士、カティア・ミュックリッシュ博士のアドバイス、有益なコメント、そして私たちがこれらの文化を立ち上げる際の文化への供給の支援に感謝します。特に、Cell Profiler パイプラインの出発点を提供してくださった Muecklisch 博士に感謝します。この作業は、MSソサエティ(助成金122)とユーリとローナチェルナヨフスキー財団によってMPに支援されました。グラスゴー大学がJCとMPに資金を提供する。ウェルカムトラスト(217093 / Z / 19 / Z)および医学研究評議会(MRV0109721)をGJGに譲渡します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10x トリプシン | Σ Σ | T4549-100ML | 組織を消化するには |
| 140 mm TC ディッシュ | フィッシャー | 11339283 | 1 個あたり 35 mm ディッシュを 1 個あたり 140 mm ディッシュ |
| 15 mL ファルコン | サルスタット | 62554502 | 細胞をペレットに集めてプレーティング培地に再懸濁するには |
| 18 G ニードル | ケ サス ウルフ | 4710012040 | サンプルのトリチュレーション用 |
| 21 G ニードル | BD | 304432 | サンプルのトリチュレーション用 |
| 23 G ニードル | ヘンケ・サス・ウルフ | ・オ4710006030 | サンプルのトリチュレーション用 |
| 35 mm TC ディッシュ | コーニング | 430165 | プレートアウト 1 個あたり 3 PLLコーティングされたカバースリップ |
| 5 mL シリンジ | フィッシャー | 15869152 | サンプルのトリチュレーション用 |
| 6 ウェルプレート | コーニング | 3516 | RT-qPCR用の細胞をプレートアウトし、フローします。サイトメトリー |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | 脳を入れるには intp |
| 96 ウェルプレート | コーニング | 3596 | ハイスループット試験のために細胞をプレートアウトする |
| ACSA-2 抗体、抗マウス、PE | Miltenyi | 130-123-284 | アストロサイトのフローサイトメトリー染色用 |
| 角度付き鉗子 | デュモン | 0108-5/45-PO | 解剖 |
| 用ビオチン | DM+/- | ||
| ホウ酸 | グマ | B6768-500G用シグマB6768-500G | ホウ酸緩衝液 |
| 用 ブリリアントバイオレット421抗マウスCD24抗体、クローンM1-69 | バイオレジェンド | 101825 | ニューロンおよびアストロサイトのフローサイトメトリー染色用 |
| ブリリアントバイオレット605抗マウスCD45抗体、クローン30-F11 | レジェン | 103139 | ミクログリア |
| のフローサイトメトリー染色用ブリリアントバイオレット 785 抗マウス/ヒト CD11b 抗体、クローン M1/70 | バイオレジェンド | 101243 | ミクログリアのフローサイトメトリー染色用 |
| BSA フラクション V | シグマ | A3059-10G | SD阻害剤用 |
| CNP | アブカム | AB6319 | 成熟オリゴデンドロサイト |
| カバースリップ | VWR | 631-0149 | プレートアウトする |
| 解剖ハサ | ミ シグマ | S3146-1EA | 解剖用 |
| DMEM 高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン | Gibco | 21969-035 | DM+/-用、およびめっき媒体用 |
| DNase I | サーモフィッシャー | 18047019 | SD阻害剤の場合、シグマからのこれまたは他のDnaseを使用することができます |
| DNase I | Sigma | D4263 | SD阻害剤の場合、サーモフィッシャーeBioscienceのFixable Viability Dyeからのこれまたは他のDnaseを使用することができます |
| eFluor 780 | サーモフィッシャー | 65-0865-14 | 生/死ステイン |
| ファイン鉗子 | デュモン | 0102-SS135-PO | 解剖用 |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | アストロサイト |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | めっき媒体用 |
| HBSS w/o Ca Mg | Σ | H9394-500ML | |
| に添加する脳用Gibco | 26050-070 | めっき媒体用 | |
| ヒドロコルチゾン | Sigma | H0396 | DM+/- |
| IBA1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | ミクログリア |
| インスリン | Sigma | I1882 | DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | SD 阻害剤 |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| 用マウス CCL5/RANTES DuoSet ELISA キット | BioTechne | DY478-05 | 96 ウェルプレートの上清中の CCL5 濃度を定量化するための ELISA キット |
| N1 培地サプリメント | シグマ | N6530-5ML | DM+/- |
| ネスティン | メルク | MAB353 | 神経幹細胞/前駆細胞 |
| NeuN | サーモフィッシャー | PA578499 | 神経細胞体 |
| NG2 | シグマ | AB5320 | 未熟オリゴデンドロサイト |
| O4抗体、抗ヒト/マウス/ラット、APC | Miltenyi | 130-119-155 | オリゴデンドロサイトのフローサイトメトリー染色用 |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | DM+/-用、およびめっき媒体用 |
| ポリ-L-リジン臭化水素 | Sigma P1274 | ホウ酸/ポリ-L-リジン溶液用 カバースリップをコーティングする | |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | 軸索 |
| ホウ酸ナトリウム | シグマ | 221732-100G | ホウ酸緩衝液用 |
| トリゾール | サーモフィッシャー | 15596026 | RT-qPCRのための細胞の溶解用 |
| シグマ | T9003-100MG | からのトリプシン阻害剤 | SD阻害剤用 |
参考文献
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E.
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